(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/DK02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/DK02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO03/ (13) B1 (51) Int.Cl. C07K 14/62 ( ) A61P 3/10 ( ) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Sposób wytwarzania związków insuliny (30) Pierwszeństwo: , DK, PA (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 08/05 (73) Uprawniony z patentu: NOVO NORDISK A/S, Bagsvaerd, DK (72) Twórca(y) wynalazku: ARE BOGSNES, Niva, DK INGUN CHRISTIANSEN, Birkerod, DK PER BALSCHMIDT, Espergaerde, DK (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/12 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania związków insuliny. Jest to ulepszony sposób konwersji prekursora insuliny do związku insuliny, ewentualnie poprzez ester insuliny. Stan techniki Insulina jest hormonem trzustkowym zaangażowanym w regulację stężenia glukozy we krwi. Przykładowo, pacjentom cierpiącym na cukrzycę insulinozależną, w celu kontrolowania stężenia glukozy we krwi, podaje się insulinę ludzką, świńską i bydlęcą, analogi insuliny oraz insuliny mieszane. Insulinę świńską i bydlęcą otrzymuje się zazwyczaj z trzustki. Insulinę ludzką można w sposób półsyntetyczny otrzymać z insuliny świńskiej. Alternatywnie, ludzką insulinę, jak również wiele analogów insuliny, można wytworzyć metodami inżynierii genetycznej. Przy zastosowaniu inżynierii genetycznej, w której można posługiwać się np. bakteriami lub drożdżami, wytwarza się prekursor insuliny który, następnie, poddaje się konwersji do pożądanego produktu. Konwersję tę można przeprowadzić różnymi sposobami. Jedną możliwością jest tak zwana transpeptydyzacja, w której w tej samej mieszaninie reakcyjnej, w takich samych warunkach reakcji, zachodzi kolejno cięcie i sprzęganie peptydu, patrz, np. opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr (Novo Industri). Inną możliwością jest cięcie prekursora insuliny w pierwszym etapie, patrz, np. Hoppe-Seyler Z. Physiol. Chem. 359 (1978), 799, następnie oczyszczenie związku pośredniego, a potem przeprowadzenie pożądanego sprzęgania w innej mieszaninie reakcyjnej niż ta użyta w pierwszym etapie, patrz, np. Nature 280 (1979), 412. Według europejskiego opisu patentowego nr 87238, reakcję transpeptydyzacji przeprowadza się w układzie rozpuszczalników zawierającym pomiędzy około 75% i 97% (objętościowo) co najmniej jednego nie wodnego, mieszającego się w środowisku reakcji rozpuszczalnika obejmującego co najmniej około 50% (objętościowo) butano-1,4-diolu. Według opisu patentowego St. Zjedn. Ameryki nr , proces transpeptydyzacji przeprowadza się stosując L-specyficzną karboksypeptydazę serynową, np. karboksypeptydazę Y. Według opisu patentowego St. Zjedn. Ameryki nr (Nordisk Insulinlaboratorium), transpeptydyzację lub tylko sprzęganie peptydu przeprowadza się w wodnym środowisku reakcji w zasadzie pozbawionym rozpuszczalnika organicznego. Według międzynarodowego zgłoszenia patentowego 83/00504 (Nordisk Insulinlaboratorium), produkt pochodzenia świńskiego poddano działaniu karboksypeptydazy A, uzyskany produkt insulinę des-alanino-b30 zawieszono w niższym alkoholu, a tę zawiesinę mieszano z roztworem estru L-treoniny oraz trypsyny. We wszystkich specyficznych przykładach, produkt insulinę des-alanino-b30 oczyszczono metodą liofilizacji lub wytrącania. Celem wynalazku jest przezwyciężenie lub udoskonalenie co najmniej niektórych spośród niedogodności znanych ze stanu techniki. Zatem, nie wszystkie wymienione poniżej w sposób bardziej szczegółowy problemy można całkowicie przezwyciężyć lub udoskonalić. Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania związku insuliny, polegający na tym, że a) w mieszaninie reakcyjnej zawierającej od 55 do 70% wody (wagowo) prekursor insuliny poddaje się cięciu enzymatycznemu, a następnie, bez izolowania związku pośredniego z mieszaniny reakcyjnej, b) ten związek pośredni sprzęga się ze związkiem nukleofilowym w mieszaninie reakcyjnej o zawartości wody w zakresie od 10% do 50% (wagowo), i c) jeśli to pożądane, usuwa się grupę zabezpieczającą (grupy zabezpieczające). Korzystnie w etapie sprzęgania stosuje się enzym stosowany również w etapie cięcia. Korzystnie przed rozpoczęciem reakcji sprzęgania przeprowadza się cięcie od 25% do 95% prekursora insuliny do związku pośredniego. Korzystnie jako enzym do cięcia enzymatycznego stosuje się trypsynę lub lizylo-specyficzną proteazę, zwłaszcza proteazę I z Achromobacter lyticus. Korzystnie jako związek nukleofilowy stosuje się ester aminokwasu. Korzystniej jako związek nukleofilowy stosuje się ester treoniny. Korzystnie jako związek nukleofilowy stosuje się amid aminokwasu. Korzystnie jako związek nukleofilowy stosuje się peptyd. Korzystnie jako związek nukleofilowy stosuje się ester peptydu. Korzystnie jako związek nukleofilowy stosuje się amid peptydu.

3 PL B1 3 Korzystnie sposób ten obejmuje etap, w którym ze związku insuliny usuwa się grupę zabezpieczającą (grupy zabezpieczające). Korzystnie sposobem tym otrzymuje się związek insuliny z treoniną w pozycji B30. Korzystnie sposobem tym jako związek insuliny otrzymuje się insulinę ludzką, insulinę aspart, insulinę lispro, insulinę glargin lub insulinę detemir. Definicje Stosowany tu termin aminokwas" odnosi się do aminokwasów, które można zakodować przy zastosowaniu sekwencji nukleotydowych. Analogicznie, stosuje się to do terminu reszta aminokwasowa, który oznacza aminokwas z którego grupy karboksylowej usunięto grupę hydroksylową i/lub z grupy aminowej usunięto atom wodoru. Podobnie, terminy peptyd i reszta peptydowa obejmują reszty aminokwasowe. Dogodnie, peptyd zawiera nie więcej niż 10 reszt aminokwasowych. Stosowany tu termin amid aminokwasu" odnosi się do aminokwasu mającego ewentualnie podstawioną C-końcową grupę karboksyamidową. Stosowany tu termin amid peptydu" odnosi się do peptydu mającego ewentualnie podstawioną C-końcową grupę karboksyamidową. Stosowany tu termin prekursor insuliny" odnosi się do polipeptydu składającego się z dwóch łańcuchów peptydowych (odpowiadających łańcuchom A i B insuliny i poniżej wskazanych jako łańcuchy A i B), które, podobnie jak insulina, łączą się ze sobą poprzez dwa mostki disiarczkowe (między jedną resztą cysteinową (Cys) a drugą resztą cysteinową) pomiędzy dwoma łańcuchami peptydowymi i, przy tym, tak jak w insulinie, występuje mostek disiarczkowy pomiędzy jedną resztą cysteinową w łańcuchu A a drugą resztą cysteinową w łańcuchu A. W tym prekursorze insuliny w łańcuchu B występuje, co najmniej, jedna reszta lizynowa lub argininowa. Ewentualnie, w tym prekursorze insuliny, łańcuchy A i B łączą się ze sobą poprzez trzeci łańcuch peptydowy (odpowiadający peptydowi łączącemu w insulinę) pomiędzy C-końcem łańcucha B i N-końcem łańcucha A. W przypadku gdy łańcuchy A i B łączą się ze sobą poprzez ten trzeci łańcuch peptydowy, lizyna występuje na C-końcu tego trzeciego peptydu. Ewentualnie, w tym prekursorze insuliny, do N-końca łańcucha B może być przyłączony czwarty łańcuch peptydowy. W tym przypadku gdy czwarty łańcuch peptydowy łączy się z N-końcem łańcucha B, wówczas lizyna występuje na C-końcu tego czwartego łańcucha peptydowego. Ponadto ten prekursor insuliny wykazuje identyczność reszt aminokwasowych co najmniej 80%, dogodnie co najmniej 85%, dogodniej co najmniej 90%, a zwłaszcza co najmniej 95%, z ludzką insuliną, z takim ograniczeniem, że w obliczeniach tych nie bierze się pod uwagę trzeciego i czwartego łańcucha peptydowego. W insulinie ludzkiej mostki disiarczkowe występują pomiędzy Cys A6 i Cys A11, pomiędzy Cys A7 i Cys B7 oraz pomiędzy Cys A20 i Cys B19, a w pozycji B29 występuje lizyna. Stosowany tu termin ester aminokwasu" odnosi się do aminokwasu niosącego grupę zabezpieczającą C-końcową grupę karboksylową i, ewentualnie, grupę zabezpieczającą grupę hydroksylową. Stosowany tu termin ester peptydu" odnosi się do peptydu, w którym przynajmniej C-końcowa grupa karboksylowa niesie grupę zabezpieczającą grupę karboksylową. Ewentualnie, zabezpiecza się każdą grupę hydroksylową i ewentualnie, grupę ε-aminową każdej reszty lizynowej przeprowadza się w pochodną, dogodnie z zastosowaniem grupy hydrofobowej, np. grupy acylowej mającej co najmniej 10 atomów węgla. Ester peptydu dogodnie zawiera nie więcej niż 10 reszt aminokwasowych. Stosowany tu termin związek nukleofilowy" odnosi się do estru aminokwasu, amidu aminokwasu, peptydu, estru peptydu i amidu peptydu. W każdym z tych estrów aminokwasów, amidów aminokwasów, peptydów, estrów peptydów i amidów peptydów, grupę aminową w każdej grupie lizynowej, przeprowadza się, ewentualnie, w pochodną, dogodnie z zastosowaniem grupy hydrofobowej, np. grupy acylowej mającej co najmniej 10 atomów węgla. Stosowany tu termin związek insuliny" odnosi się do insuliny pochodzącej z dowolnego gatunku, takiej jak insulina świńska, insulina bydlęca i insulina ludzka, i ich soli, takich jak sole cynku oraz sole z protaminą. Ponadto, stosowany tu termin związek insuliny" odnosi się do związków, które można krótko określić jako analogi insuliny". Stosowany tu termin analogi insuliny odnosi się do związków insuliny, w których jedną lub więcej reszt aminokwasowych zamieniono na inną resztę aminokwasową i/lub z których usunięto jedną lub więcej reszt aminokwasowych i/lub do których dodano jedną lub więcej reszt aminokwasowych, pod warunkiem, że ten analog insuliny ma wystarczającą aktywność insuliny. Przykłady analogów insuliny opisano w następujących opisach patentowych i ich równoważnych opisach: opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr ; europejski opis patentowy ; europejski opis patentowy ; opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr ; i opis pa-

4 4 PL B1 tentowy St. Zjedn. Ameryki nr Przykłady specyficznych analogów insuliny obejmują insulinę aspart (tj. insulina ludzka[asp B28 ]), insulinę lispro (tj. insulina ludzka[lys B28, Pro B29 ]) insulinę glargin (tj. insulina ludzka[gly A21, Arg B31, Arg B32 )]. Stosowany tu termin analog insuliny" obejmuje także związki, które można nazwać pochodnymi insuliny, tj. związki, które fachowiec w dziedzinie określiłby zazwyczaj jako pochodne insuliny, patrz ogólne podręczniki, jak np. insulina mająca podstawnik niewystępujący w macierzystej cząsteczce insuliny. Przykłady pochodnych insuliny obejmują insuliny lub analogi insuliny mające ewentualnie podstawioną grupę karboksyamidową. Termin analog insuliny obejmuje także związki, które można uznać zarówno za pochodną insuliny, jak i analog insuliny. Przykłady takich związków opisano w następujących opisach patentowych i ich opisach równoważnych: opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr Zatem, kolejnym przykładem specyficznego analogu insuliny jest insulina detemir (tj. insulina ludzka des-thr B30 γlys B29 tetradekanoil). Wytworzone związki insuliny według wynalazku mają dostatecznie dużą aktywność przeciwcukrzycową aby stosować je do leczenia cukrzycy. Aktywność przeciwcukrzycową można określić stosując tak zwany test z wykorzystaniem wolnych komórek tłuszczowych. Stosowany tu termin wartość ph" odnosi się do wartości zmierzonej pehametrem poprzez zanurzenie kombinowanej elektrody kalomelowej i szklanej przyłączonej do pehametru bezpośrednio w roztworze, którego wartość ph ma być zmierzona. Pehametr kalibruje się stosując standardowy wodny bufor. Krótki opis rysunków Numer identyfikacyjny sekwencji: 1 oznacza grupę peptydową Glu-(Glu-Ala) 3 -Pro-Lys-; Numer identyfikacyjny sekwencji: 2 oznacza grupę peptydową Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-; i Numer identyfikacyjny sekwencji: 3 oznacza grupę peptydową Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr. Krótki opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania związków insuliny. Te związki insuliny można stosować jako leki. W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku wytwarza się związki insuliny mające treoninę (Thr) na C-końcu łańcucha B. Każdy fachowiec w dziedzinie np. lekarz, jest w stanie określić, jakie dawki związków insuliny podawać pacjentowi cierpiącemu na cukrzycę oraz kiedy je podawać. Substancją wyjściową w sposobie według wynalazku jest prekursor insuliny, który poddaje się zarówno reakcji cięcia, jak i sprzęgania peptydu w warunkach sprzyjających obu reakcjom, lecz w których nie zachodzi oddzielanie związku pośredniego. Innymi słowy, prekursor insuliny poddaje się reakcji cięcia, a uzyskany produkt, tj. związek pośredni, poddaje się reakcji sprzęgania. Warunki sprzyjające cięciu nie są identyczne z warunkami sprzyjającymi sprzęganiu peptydu. Zatem, w pierwszym etapie według wynalazku, tj. etapie cięcia lub reakcji cięcia, warunki reakcji w mieszaninie reakcyjnej dobiera się tak, aby sprzyjały cięciu peptydu, a w drugim etapie według wynalazku, tj. etapie sprzęgania lub reakcji sprzęgania, warunki reakcji w mieszaninie reakcyjnej zmienia się tak, aby sprzyjały sprzęganiu peptydu. W jednym rozwiązaniu według wynalazku, w pierwszym etapie prekursor insuliny rozpuszcza się w środowisku wodnym, w przeważającej mierze, i dodaje enzym w celu cięcia. Ta mieszanina reakcyjna może być wolna lub w zasadzie wolna od rozpuszczalnika organicznego. Alternatywnie, mieszanina reakcyjna może zawierać pewną ilość rozpuszczalnika organicznego, który może zapewnić właściwą rozpuszczalność prekursora insuliny. Jednakże, pożądane jest aby nie stosować rozpuszczalnika organicznego w takiej ilości, która miałaby niepożądany wpływ na cięcie enzymatyczne. W pierwszym etapie sposobu wytwarzania według wynalazku, parametry reakcji, takie jak wartość ph, temperatura i czas, dobiera się tak, aby sprzyjały cięciu przy reszcie lizynowej (resztach lizynowych) lub reszcie argininowej (resztach argininowych). W trakcie trwania reakcji cięcia w pewnym, pożądanym stopniu, związek nukleofilowy i rozpuszczalnik organiczny mieszają się z mieszaniną reakcyjną (bez uprzedniego oddzielenia związku pośredniego) tak, że zachodzi sprzęganie związku nukleofilowego z resztą lizynową lub argininową pożądanego związku pośredniego. W tym etapie, parametry reakcji dobiera się tak, aby sprzyjały reakcji sprzęgania. W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku, związkiem nukleofilowym jest ester aminokwasu, np. estry treoniny lub ester peptydu. Następnie można, jeśli to pożądane, oddzielić od uzyskanego związku grupę zabezpieczającą (grupy zabezpieczające). W porównaniu ze znaną reakcją transpeptydyzacji, zaletą sposobu według wynalazku jest krótszy czas wszystkich reakcji przy tej samej ilości enzymu i podobnej lub większej wydajności. W po-

5 PL B1 5 równaniu z reakcją w dwóch naczyniach z cięciem w środowisku wodnym, oddzielanie związku pośredniego i sprzęganie w mieszaninie rozpuszczalnika organicznego i wody, zaletami tego sposobu wytwarzania według wynalazku jest krótszy czas wszystkich reakcji, zastosowanie mniejszej ilości enzymu oraz łatwiejszy przebieg procesu. Szczegółowy opis wynalazku Jak stwierdzono w zastrz. 1, najpierw zachodzi reakcja cięcia peptydu, a następnie zachodzi reakcja sprzęgania. W skrócie, reakcję cięcia (tj. cięcie enzymatyczne) przeprowadza się w sposób następujący: Cięcie enzymatyczne prekursora insuliny (tj. cięcie peptydu) zachodzi w mieszaninie reakcyjnej zawierającej co najmniej około 55%, dogodnie co najmniej około 60%, dogodniej co najmniej 70% wody (wagowo). W zalecanym rozwiązaniu stężenie prekursora insuliny w mieszaninie reakcyjnej, w której zachodzi cięcie enzymatyczne wynosi co najmniej 2%, dogodnie w zakresie od około 5 do około 10% (wagowo/objętościowo). Reakcję cięcia przeprowadza się w środowisku obojętnym lub alkalicznym, dogodnie o wartości ph w zakresie od około 6 do około 11, dogodniej w zakresie od około 8 do około 10. W zalecanym rozwiązaniu ilości enzymu w porównaniu z ilością prekursora insuliny mieszczą się w zakresie od w przybliżeniu 0,05 do w przybliżeniu 5% (wagowo), dogodnie od w przybliżeniu 0,1 do w przybliżeniu 2%. Enzym trypsynowy nie stanowi materiału do realizacji praktycznej wynalazku. Trypsyna jest dobrze scharakteryzowanym enzymem dostępnym w preparatach o dużym stopniu czystości, szczególnie pochodzenia bydlęcego lub świńskiego. Z mikroorganizmów można otrzymać proteazę I z Acromobacter lyticus (zwaną poniżej ALP). Ponadto, nie stanowi materiału do realizacji praktycznej wynalazku forma enzymu, czy jest to enzym natywny lub aktywny unieruchomiony enzym lub pochodna enzymu. Jeśli pożądane jest cięcie na C-końcu argininy, można stosować trypsynę, a jeśli pożądane jest cięcie na C-końcu lizyny, można stosować albo trypsynę albo ALP. Do cięcia na C-końcu lizyny zalecana jest ALP. Jako przykłady aktywnych pochodnych enzymu można wymienić acetylowaną trypsynę, sukcynylowaną trypsynę, trypsynę potraktowaną aldehydem glutarowym oraz unieruchomioną trypsynę lub pochodne ALP. Jeśli stosuje się unieruchomioną trypsynę lub ALP, zawiesza się ją w mieszaninie reakcyjnej lub można ją wprowadzić do kolumny. Działanie enzymu zależy, w dużym stopniu, od oddziaływań z wodą i rozpuszczalnikiem, wartości ph oraz temperatury w jakiej przebiega reakcja. Zwiększając stężenie rozpuszczalnika organicznego w mieszaninie reakcyjnej i obniżając wartość ph do wartości w przybliżeniu obojętnej przesuwa się kierunek typowej reakcji enzymatycznej od cięcia do sprzęgania. Obniżając temperaturę zmniejsza się szybkość reakcji, lecz można także ograniczyć powstawanie produktu ubocznego oraz denaturację enzymu. W zalecanym rozwiązaniu prekursor insuliny rozpuszcza się w środowisku wodnym o stężeniu jonów octanowych w zakresie od około 5 mm do około 500 mm, dogodnie w zakresie od około 20 mm do około 200 mm. Przykładowo, można stosować octan sodu, potasu, amonu lub trietylooctan amonu. W jednym rozwiązaniu prekursor insuliny (peptyd) można zilustrować posługując się następującym wzorem ogólnym I: R 1 Cys Z n Cys R 2 R 3 Cys Z m Cys R 4 (I) w którym Z n i Z m, niezależnie od siebie, oznaczają dwie grupy peptydowe, przy czym każda zawiera odpowiednio n i m reszt aminokwasowych, R 1 oznacza resztę peptydową, przy czym ta reszta peptydowa, ewentualnie, zawiera resztę lizynową lub argininową, R 2 oznacza resztę aminokwasową lub resztę peptydową, R 3 oznacza resztę peptydową, przy czym ta reszta peptydowa, ewentualnie, zawiera resztę lizynową lub argininową, R 4 oznacza resztę lizynową lub argininową lub resztę peptydową, przy czym ta reszta peptydowa zawiera resztę lizynową lub argininową, albo R 1 i R 4 razem oznaczają resztę peptydową zawierającą resztę lizynową lub argininową, dwie linie pionowe wskazują

6 6 PL B1 wiązania disiarczkowe pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi i ponadto, występuje wiązanie disiarczkowe pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi występującymi w R 1 i w Z n. Zalecane reszty aminokwasowe występujące w prekursorze insuliny o wzorze I to takie, które można zakodować z zastosowaniem sekwencji nukleotydowych. W zalecanym rozwiązaniu stosuje się prekursor insuliny, w którym liczba reszt aminokwasowych w R 1 i R 4 łącznie mieści się zakresie od około 8 do około 50. W innym zalecanym rozwiązaniu Z n zawiera sekwencję 12 reszt aminokwasowych. W innym zalecanym rozwiązaniu Z m zawiera sekwencję 11 reszt aminokwasowych. W innym zalecanym rozwiązaniu R 2 zawiera 1 resztę aminokwasową, np. Asn lub Gly. W innym zalecanym rozwiązaniu R 3 zawiera sekwencję 6 reszt aminokwasowych. W zalecanym rozwiązaniu prekursorem insuliny jest prekursor o pojedynczym łańcuchu, tj. związek o wzorze I, w którym R 1 i R 4 razem oznaczają resztę peptydową zawierającą resztę lizynową lub argininową. Zatem dogodnie prekursorem insuliny nie jest insulina ssaka, taka jak insulina świńska, insulina królicza, insulina psia lub insulina wielorybia. W innym rozwiązaniu prekursor insuliny o wzorze I zawiera sekwencję takich samych reszt aminokwasowych w pozycjach A1 do A21 i w pozycjach B1 do B29 jakie występują w insulinie ludzkiej w takich samych pozycjach. W innym rozwiązaniu prekursor insuliny o wzorze I zawiera sekwencję takich samych reszt aminokwasowych w pozycjach A1 do A21 i w pozycjach B1 do B29 z takim ograniczeniem, że resztą aminokwasową w pozycji B28 jest Asp. W innym rozwiązaniu prekursor insuliny o wzorze I zawiera sekwencję takich samych reszt aminokwasowych w pozycjach A1 do A21 i w pozycjach B1 do B29 jakie występują w insulinie ludzkiej w takich samych pozycjach z takim ograniczeniem, że resztą aminokwasową w pozycji B28 jest Lys i resztą aminokwasową w pozycji B29 jest Pro. W innym rozwiązaniu prekursor insuliny o wzorze I zawiera sekwencję takich samych reszt aminokwasowych w pozycjach A1 do A21 i w pozycjach B1 do B29 jakie występują w insulinie ludzkiej w takich samych pozycjach z takim ograniczeniem, że resztą aminokwasową w pozycji A21 jest Gly, a resztą aminokwasową zarówno w pozycji B31, jak i B32 jest Arg. Przykłady specyficznych prekursorów insuliny, które można zastosować w sposobie wytwarzania według wynalazku obejmują ludzką proinsulinę; małpią proinsulinę; świńską proinsulinę [Ala 31, Lys 32 ]-des(33-63); świńską insulinę; ludzką proinsulinę [Asp 28 ]-des(30-65) wydłużoną na N-końcu z zastosowaniem Glu-(Glu-Ala) 3 -Pro-Lys- (numer identyfikacyjny sekwencji: 1); i ludzką proinsulinę [Asp 28,Met 30,Trp 31,Lys 32 ]-des(33-65) wydłużoną na N-końcu z zastosowaniem Glu-Glu-Gly-Glu-Pro- -Lys- (numer identyfikacyjny sekwencji: 2). Prekursory insuliny o wzorze I można wytworzyć jak opisano lub jak analogicznie opisano w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych o numerach WO 01/49742, WO 01/49870, WO 01/ i WO 02/079254, zawartość których załącza się niniejszym na zasadzie odsyłacza. Pożądany związek pośredni (tj. pożądany produkt cięcia) odpowiada prekursorowi insuliny, w którym co najmniej jedną resztę lizynową lub argininową odcięto z wytworzeniem odpowiednio grupy lizylowej lub arginylowej. Ponadto, w pożądanym związku pośrednim, łańcuchy A i B, które łączą się ze sobą poprzez dwa mostki disiarczkowe nie są połączone ze sobą poprzez łańcuch peptydowy pomiędzy C-końcem łańcucha B a N-końcem łańcucha A. W zalecanym rozwiązaniu liczba reszt aminokwasowych występujących w pożądanym związku pośrednim mieści się w zakresie od około 48 do około 52, dogodnie w zakresie od około 49 do około 51, nawet dogodniej 50. W innym zalecanym rozwiązaniu w pożądanym związku pośrednim występuje nie więcej niż 4, dogodnie nie więcej niż 3, dogodniej nie więcej niż 2, a zwłaszcza nie więcej niż 1 reszta aminokwasowa niewystępująca w odpowiedniej pozycji w insulinie ludzkiej. W jednym rozwiązaniu pożądany związek pośredni (pożądany produkt cięcia) można zilustrować posługując się wzorem ogólnym II. R 1 Cys Z n Cys R 2 R 3 Cys Z m Cys R 4 (II) w którym Z n i Z m, niezależnie od siebie, oznaczają dwie grupy peptydowe, przy czym każda zawiera n i m reszt aminokwasowych, odpowiednio, R 1 oznacza resztę peptydową, R '2 oznacza resztę aminokwasową lub resztę peptydową, R '3 oznacza resztę peptydową, R '4 oznacza resztę lizynową lub

7 PL B1 7 argininową lub resztę peptydową zawierającą resztę lizynową lub argininową na C-końcu, dwie pionowe linie wskazują wiązanie disiarczkowe pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi i, ponadto występuje wiązanie disiarczkowe pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi występującymi w R 1 i w Z n. W zalecanym rozwiązaniu R 1 oznacza sekwencję reszt aminokwasowych od A1 do A6 ludzkiej insuliny, w której, ewentualnie, jedna lub dwie reszty aminokwasowe są wymienione na inną resztę aminokwasową, lub z której jedna lub dwie reszty aminokwasowe są usunięte. W innym rozwiązaniu R '2 oznacza reszty -Asn or -Gly. W innym zalecanym rozwiązaniu R 3 oznacza sekwencję reszt aminokwasowych od B1 do B6 ludzkiej insuliny, w której, ewentualnie, jedna lub dwie reszty aminokwasowe są wymienione na inną resztę aminokwasową, lub z której jedna lub dwie reszty aminokwasowe są usunięte. W innym zalecanym rozwiązaniu R 4 oznacza sekwencję reszt aminokwasowych od B20 do B29 ludzkiej insuliny, z takim ograniczeniem, że w pozycji B28 występuje reszta Lys, przy czym w każdej z tych sekwencji, ewentualnie, jedna lub dwie reszty aminokwasowe są wymienione na inną resztę aminokwasową lub z każdej z tych sekwencji jedna lub dwie reszty aminokwasowe są usunięte, lub część z tych sekwencji pozbawiona jest na swoim C-końcu jednej lub więcej reszt aminokwasowych. W innym zalecanym rozwiązaniu Z n oznacza sekwencję reszt aminokwasowych od A8 do A19 ludzkiej insuliny, w której, ewentualnie, jedna lub dwie reszty aminokwasowe są wymienione na inną resztę aminokwasową, lub z której jedna lub dwie reszty aminokwasowe są usunięte. W innym zalecanym rozwiązaniu Z m oznacza sekwencję reszt aminokwasowych od B8 do B18 ludzkiej insuliny, w której, ewentualnie, jedna lub dwie reszty aminokwasowe są wymienione na inną resztę aminokwasową, lub z której jedna lub dwie reszty aminokwasowe są usunięte. Zarówno podczas reakcji cięcia, jak i reakcji sprzęgania, zakres temperatury przebiegu reakcji wynosi od punktu zamarzania mieszaniny reakcyjnej do około 50 C. Zalecany zakres temperatury wynosi od około 0 C do około 25 C. W skrócie, reakcję sprzęgania przeprowadza się w sposób następujący: Gdy co najmniej około 25%, dogodnie co najmniej 50%, dogodniej co najmniej 75%, w szczególności co najmniej 85%, a zwłaszcza co najmniej 95%, prekursora insuliny potnie się do pożądanego związku pośredniego, z jednej strony związek nukleofilowy, z drugiej strony rozpuszczalnik organiczny miesza się z mieszaniną reakcyjną, w której doszło do cięcia tak, że uzyskuje się warunki reakcji dogodne lub sprzyjające etapowi sprzęgania. Procent cięcia (konwersji) zależy od możliwej równowagi w mieszaninie reakcyjnej zastosowanej do cięcia. Zazwyczaj, od rozpoczęcia enzymatycznej reakcji cięcia aż do pewnego punktu czasowego wydajność otrzymywania pożądanego związku pośredniego, tj. pożądanego produktu cięcia, zwiększa się i osiąga stężenie maksymalne. Następnie stężenie pożądanego produktu cięcia może się zmniejszać. W zalecanym rozwiązaniu z mieszaniny reakcyjnej przed zajściem reakcji sprzęgania nie usuwa się żadnych składników uzyskanych w wyniku reakcji cięcia. Prostym sposobem jest dodanie, po reakcji cięcia, związku nukleofilowego i wystarczającej ilości rozpuszczalnika organicznego. W ten sposób, np. enzym zastosowany w etapie cięcia stosuje się także w etapie sprzęgania. Sposób wytwarzania według wynalazku obejmuje także reakcje sprzęgania w mieszaninie reakcyjnej, która oprócz pożądanego związku pośredniego zawiera małą ilość częściowo pociętego prekursora insuliny i/lub nieprzereagowanego prekursora insuliny. W innym korzystnym rozwiązaniu według wynalazku, związkiem nukleofilowym jest amid aminokwasu lub amid peptydu, przy czym grupa karboksyamidowa nie jest podstawiona albo jest jednolub dwupodstawiona przez grupę alkilową o nie więcej niż 16 atomach węgla, przy czym grupa alkilowa (grupy alkilowe), razem z sąsiadującym atomem azotu, może tworzyć pierścień, albo grupa karboksyamidowa jest jedno- lub dwupodstawiona przez grupę arylową. Zalecane są podstawniki alifatyczne. Przykłady podstawionych grup karboksyamidowych obejmują N,N-dimetylokarboksyamid, N,N-dietylokarboksyamid i N-heksylokarboksyamid. W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku, związkiem nukleotydowym jest ester aminokwasu, w którym zabezpiecza się grupę karboksylową i ewentualnie zabezpiecza się każdą grupę hydroksylową. W następnym korzystnym rozwiązaniu według wynalazku, związkiem nukleotydowym jest ester treoniny, w którym zabezpiecza się grupę karboksylową i, ewentualnie, zabezpiecza się grupę hydroksylową. Zatem, ester L-treoniny można zilustrować następującym wzorem ogólnym IIIa: Thr(R 5 )-OR 6 (IIIa)

8 8 PL B1 w którym R 6 oznacza grupę zabezpieczającą grupę karboksylową i R 5 oznacza atom wodoru lub grupę zabezpieczającą grupę hydroksylową. Dla większej jasności, ester treoniny można zilustrować posługując się wzorem ogólnym CH 3 -CH(OR 5 )-CH(NH 2 )COOR 6, w którym R 6 i R 5 mają znaczenia wymienione powyżej. Pewne związki nukleofilowe są znane, a inne związki nukleofilowe można wytworzyć analogicznie jak wytwarza się znane związki lub analogicznie według znanych metod. Związki nukleofilowe można stosować w postaci wolnej zasady, albo jej rozpuszczalnych soli, takich jak chlorowodorki, octany, propioniany i maślany. Na początku reakcji sprzęgania, pożądane jest aby w mieszaninie reakcyjnej występował znaczny nadmiar związku nukleofilowego, przy stosunku molowym między związkiem nukleofilowym a pożądanym związkiem pośrednim dogodnie przekraczającym około 5:1. Na początku reakcji sprzęgania stężenie związku nukleofilowego w mieszaninie reakcyjnej powinno dogodnie przekraczać 0,1 mola, przy czym górne stężenie ogranicza jego rozpuszczalność. Istotnym aspektem realizacji praktycznej wynalazku jest osiągnięcie wydajności 60%, a temperatura w której przebiega reakcja, zawartość wody i wartość ph są ze sobą powiązane w opisanych zakresach. Rozpuszczalniki organiczne odpowiednie do realizacji praktycznej wynalazku obejmują rozpuszczalniki polarne mieszające się z wodą, a dogodnie takie, które mogą zawierać pożądany związek pośredni w dużych stężeniach (np. o wzorze II) oraz związek nukleofilowy. Przykłady odpowiednich rozpuszczalników organicznych obejmują rozpuszczalniki aprotonowe, takie jak N,N-dimetyloformamid, N,N-dimetyloacetamid, N-metylopirolidon-2 i sulfotlenek dimetylu oraz rozpuszczalniki protonowe, takie jak kwas octowy, etanol, metanol, 2-propanol, 1-propanol, butanol i 1,4-butandiol. Jako rozpuszczalnik organiczny można także stosować dioksan, aceton, tetrahydrofuran, formamid i acetonitryl, a nawet, całkowicie lub częściowo, ester aminokwasu stosowany jako związek nukleofilowy. Własności rozpuszczalnika wpływają na układ jako całość, a oddziaływania odpowiednie dla jednego rozpuszczalnika dające duże wydajności nie muszą stosować się do innego rozpuszczalnika. Najlepsze wydajności otrzymano stosując rozpuszczalniki aprotonowe i są one najbardziej zalecane do realizacji praktycznej wynalazku. Oczywiście, przy obliczaniu lub określaniu zawartości wody w mieszaninie reakcyjnej, związek nukleofilowy przyjmuje się za rozpuszczalnik organiczny. Ewentualnie dodaje się kwas, taki jak kwas chlorowodorowy, kwas mrówkowy, kwas octowy, kwas propionowy lub kwas masłowy, albo zasadę, taką jak pirydyna, TRIS, N-metylomorfolina, trietyloamina lub N-etylomorfolina. Dodaje się je do mieszaniny reakcyjnej w celu uzyskania odpowiedniej wartości ph. Chociaż w realizacji praktycznej wynalazku można stosować kwasy lub zasady mineralne, zalecane są kwasy i zasady organiczne, szczególnie te określone powyżej. Najbardziej zalecane są kwasy organiczne. Na początku reakcji sprzęgania stosunek wagowy pomiędzy trypsyną lub ALP (obliczony dla trypsyny krystalicznej lub ALP lub ilość odpowiedniej pochodnej trypsyny lub ALP) a pożądanym związkiem pośrednim w mieszaninie reakcyjnej mieści się dogodnie w zakresie od około 1:1000 do około 1:10, dogodniej w zakresie od około 1:200 do około 1:50. W pewnych przypadkach, enzym dodany w etapie cięcia wystarcza do przeprowadzenia reakcji sprzęgania i w tym przypadku, w trakcie etapu sprzęgania nie ma potrzeby dodawania kolejnej porcji enzymu. W innych przypadkach, w trakcie etapu sprzęgania może być pożądane dodanie dodatkowej porcji enzymu. Ponieważ duże stężenia pożądanego związku pośredniego oraz związku nukleofilowego w roztworze zwiększają szybkość konwersji, wybór rozpuszczalnika ukierunkowany jest na te rozpuszczalniki, w których dobrze rozpuszczają się reagenty. Rozpuszczalność związku nukleofilowego jest szczególnie ważna, ponieważ reagent ten powinien występować w dużym stężeniu. Na początku reakcji sprzęgania stosunek molowy związku nukleofilowego do pożądanego związku pośredniego powinien dogodnie przekraczać 5:1, dogodniej przekraczać 50:1. Na początku reakcji sprzęgania stężenie związku nukleofilowego w mieszaninie reakcyjnej powinno dogodnie wynosić co najmniej 0,1 mola. W zalecanym rozwiązaniu stosuje się związek nukleofilowy mający grupę zabezpieczającą grupę karboksylową (grupy zabezpieczające grupy karboksylowe), którą można usunąć z otrzymanego związku insuliny, w warunkach, które nie powodują istotnych nieodwracalnych zmian w cząsteczce insuliny. Jako przykłady takich grup zabezpieczających grupy karboksylowe można wymienić niższy alkil, np. metyl, etyl i tert-butyl, podstawione grupy benzylowe, takie jak p-metoksybenzyl, difenylome-

9 PL B1 9 tyl i 2,4,6-trimetylobenzyl oraz grupy o wzorze ogólnym -CH 2 -CH 2 -SO 2 R 7, w którym R 7 oznacza niższy alkil, taki jak metyl, etyl, propyl i n-butyl. Odpowiednie grupy zabezpieczające grupę hydroksylową obejmują te, które można usunąć w warunkach niepowodujących istotnej nieodwracalnej zmiany w cząsteczce insuliny. Jako przykład takiej grupy można wymienić tert-butyl. Inne zazwyczaj stosowane grupy zabezpieczające opisał Wunch: Metoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), tom XV/1, pod redakcją Eugena Mullera, Georg Thieme Verlag, Stuttgart W jednym rozwiązaniu sposób wytwarzania według niniejszego wynalazku doprowadzi do związku o wzorze ogólnym IV: R 1 Cys Z n Cys R 2 R 3 Cys Z m Cys R 4 R 6 (IV) w którym Z n i Z m, niezależnie od siebie, oznaczają dwie grupy peptydowe, przy czym każda zawiera odpowiednio n i m reszt aminokwasowych, R 1 oznacza resztę peptydową, a R 2 oznacza resztę aminokwasową lub resztę peptydową, R 3 oznacza resztę peptydową, R 4 ma znaczenie wymienione powyżej i R 6 oznacza aminokwas niosący grupę zabezpieczającą grupę karboksylową lub resztę peptydową, ewentualnie, niosący grupę zabezpieczającą grupę karboksylową. Dowolną grupę zabezpieczającą grupę karboksylową (np. R 6 ) i dowolną grupę zabezpieczającą grupę hydroksylową (np. R 5 ) występującą w związkach insuliny można usunąć stosując znane metody lub metody znane per se. W przypadku gdy grupa zabezpieczająca grupę karboksylową oznacza metyl, etyl lub grupę o wzorze ogólnym -CH 2 -CH 2 -SO 2 R 7, w którym R 7 ma znaczenie zdefiniowane powyżej, wspomnianą grupę zabezpieczającą można usunąć stosując łagodne warunki zasadowe w środowisku wodnym, dogodnie przy wartości ph w zakresie od około 8 do około 12, np. w około 9,5. Jako zasadę można stosować silne zasady, przykładowo trzeciorzędową aminę, np. trietyloaminę, wodorotlenki metali alkalicznych, takie jak wodorotlenek sodu lub wodorotlenki metali ziem alkalicznych, takie jak wodorotlenek wapnia lub magnezu. W przypadku gdy grupą zabezpieczającą grupę karboksylową jest tert-butyl, podstawiony benzyl, taki jak p-metoksybenzyl lub 2,4,6-trimetylobenzyl lub difenylometyl, wspomnianą grupę można usunąć metodą hydrolizy kwasowej, dogodnie stosując kwas trifluorooctowy. Kwas trifluorooctowy może być niewodny lub może zawierać pewną część wody lub może być rozcieńczony rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak dichlorometan. W przypadku gdy grupą zabezpieczającą grupę hydroksylową (np. R 5 ) jest tert-butyl, wspomnianą grupę można usunąć metodą hydrolizy kwasowej, patrz powyżej. Dogodnie wytworzone związki insuliny nie posiadają grupy zabezpieczającej grupę hydroksylową. W zalecanym rozwiązaniu sposób wytwarzania prowadzi do konwersji prekursora insuliny (np. o wzorze I) do związku insuliny (np. wzór IV), posiadającego grupę zabezpieczającą grupę karboksylową na C-końcowej reszcie aminokwasowej w łańcuchu B, który następnie można odbezpieczyć uzyskując związek insuliny nieposiadający grupy zabezpieczającej grupę karboksylową. Wybierając warunki reakcji według powyższych wskazówek i rozpatrując otrzymane w poniższych przykładach wyniki możliwe jest uzyskanie wydajności związku insuliny powyżej 60%, a nawet powyżej 80%, a w pewnych dogodnych warunkach powyżej 90%. Stosując sposób wytwarzania według wynalazku można otrzymać związki insuliny o dopuszczalnej czystości, które można dodatkowo oczyścić, jeśli to pożądane, do celów terapeutycznych. Dokładniej, insulinę aspart można wytworzyć np. tnąc enzymatycznie prekursor insuliny taki jak ludzka proinsulina[asp 28 ]-des(30-65) wydłużona na N-końcu Glu-(Glu-Ala) 3 -Pro-Lys- (numer identyfikacyjny sekwencji: 1) z zastosowaniem ALP i sprzęgając ze związkiem nukleofilowym, takim jak ester metylowy L-treoniny, a następnie przeprowadzając hydrolizę. Insulinę lispro można wytworzyć np. tnąc enzymatycznie prekursor insuliny, taki jak insulina świńska z zastosowaniem trypsyny i sprzęgając ze związkiem nukleofilowym, takim jak Gly-Phe-Phe- -Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr (numer identyfikacyjny sekwencji: 3). Insulinę glargin można np. wytworzyć np. tnąc enzymatycznie prekursor insuliny, taki jak ludzka proinsulina [Gly 86 ]-des(30-65) z zastosowaniem ALP i sprzęgając ze związkiem nukleofilowym, takim jak Thr-Arg-Arg-OMe, a następnie przeprowadzając hydrolizę.

10 10 PL B1 Stosowane tu skróty są zgodne z zasadami zatwierdzonymi (1974) przez lupac-iub Commission on Biochemical Nomenclature, patrz Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature lupac-iub, wydanie 2, Maryland Stosowane tu słowo obejmuje" powinno być szeroko interpretowane w znaczeniu obejmuje", zawiera" lub w tym" (patrz, wytyczne EPO C 4,13). Następujące przykłady podano dla ilustracji, a nie ograniczenia wynalazku. P r z y k ł a d mg świńskiej proinsuliny[ala 31,Lys 32 ]-des(33-63) zawieszono w 1,35 ml wody i wartość ph uregulowano do 9 stosując 10 μl trietyloaminy. Łagodnie mieszając dodano mieszaninę 375 μl N,N- -dimetylo-acetamidu i 460 μl wody i do uzyskanego roztworu dodano 315 μl 5,4 mg/ml wodnego roztworu lizylo-specyficznej proteazy Achromobacter lyticus (EC ) (wskazanej tu jako ALP). Wartość ph uregulowano do 9,8 stosując 20 μl trietyloaminy i roztwór reakcyjny pozostawiono na 1 godzinę w temperaturze 23 C. Roztwór reakcyjny zakwaszono dodając 70 μl 4 N kwasu chlorowodorowego i ochłodzono w łaźni lodowej. Dodano roztwór 300 mg estru metylowego L-treoniny w 4,85 ml N,N-dimetyloacetamidu i wartość ph uregulowano do 6,5 dodając 450 μl 4 N kwasu chlorowodorowego. Roztwór reakcyjny pozostawiono przez 4 godziny w temperaturze 23 C po czym reakcję zatrzymano dodając kwas chlorowodorowy do uzyskania wartości ph < 3. Stosując analizę HPLC w układzie faz odwróconych na 4 mm x 250 mm 5 μm kolumnie C18 wypełnionej krzemionką z eluentem etanol-woda zawierającym 0,125 M siarczanu amonu uregulowany do wartości ph 4 stwierdzono po łącznym czasie reakcji wynoszącym 5 godzin wydajność konwersji do estru metylowego ludzkiej insuliny 86%. Dla porównania przeprowadzono konwersję jednoetapową: 100 mg świńskiej proinsuliny[ala 31,Lys 32 ]-des(33-63) zawieszono w mieszaninie 887 μl wody i 175 μl N,N-dimetyloacetamidu. W 2,265 ml N,N-dimetyloacetamidu rozpuszczono 150 mg estru metylowyego L-treoniny i powoli dodano do oziębionej lodem mieszaniny. Wartość ph uregulowano do 6,5 stosując 340 μl kwasu octowego i dodano 158 μl 5,4 mg/ml wodnego roztworu ALP. Po reakcji przeprowadzono analizę RP-HPLC zakwaszonych próbek. Po upływie 5 godzin, stwierdzono 53% konwersji do estru metylowego ludzkiej insuliny, a po upływie 24 godzin konwersja osiągnęła wartość maksymalną 87%. Wyizolowany ester metylowy ludzkiej insuliny przekształcono do ludzkiej insuliny rozpuszczając w wodzie przy wartości ph 10 w stężeniu 10 mg/ml. Reakcję zakończono po upływie 24 godzin regulując wartość ph do 5,2 stosując 1 N kwas chlorowodorowy i wytrąconą insulinę ludzką wyizolowano poprzez odwirowanie i oczyszczono metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych. Przy takim samym czasie reakcji, tj. 5 godzin, wydajność przy zastosowaniu sposobu wytwarzania według wynalazku, w porównaniu z procesem znanym per se, zwiększono o 62%. Dwa procesy miały prawie taką samą wydajność, jeśli czas reakcji znanej per se konwersji jednoetapowej był prawie 5 razy dłuższy, w porównaniu z czasem reakcji dla sposobu wytwarzania według wynalazku. P r z y k ł a d mg insuliny świńskiej zawieszono w 1,37 ml wody i łagodnie mieszając dodano mieszaninę 294 μl N-metylo-2-pirolidonu i 326 μl wody. Wartość ph uregulowano do 9,0 stosując 10 μl 2 N wodorotlenku sodu i do uzyskanego roztworu dodano 315 μl 5,4 mg/ml wodnego roztworu ALP. Wartość ph uregulowano do 9,8 stosując 12 μl 2 N wodorotlenku sodu i roztwór reakcyjny pozostawiono przez 4 godziny w temperaturze 23 C. Roztwór reakcyjny zakwaszono dodając 70 μl 4 N kwasu chlorowodorowego i ochłodzono w łaźni lodowej. Roztwór 300 mg estru metylowego L-treoniny w 4,4 ml N-metylo-2-pirolidonu zakwaszono 500 μl 4 N kwasu chlorowodorowego. Powoli dodano roztwór insuliny i wartość ph uregulowano do 6,5 stosując 50 μl 2 N kwasu chlorowodorowego. Roztwór reakcyjny pozostawiono przez 4 godziny w temperaturze 23 C po czym reakcję zatrzymano dodając kwas chlorowodorowy do wartości ph <3. Stosując analizę HPLC w układzie faz odwróconych na 4 mm x 250 mm 5 μm kolumnie C18 wypełnionej krzemionką z eluentem etanol-woda zawierającym 0,125 M siarczanu amonu o wartości ph uregulowanej do 4 stwierdzono po łącznym czasie reakcji wynoszącym 8 godzin - 86% konwersji do estru metylowego ludzkiej insuliny. Dla porównania przeprowadzono konwersję jednoetapową: 100 mg świńskiej insuliny zawieszono w mieszaninie 848 μl wody i 147 μl N-metylo-2-pirolidonu. 150 mg estru metylowego L-treoniny rozpuszczono w 2,2 ml N-metylo-2-pirolidonu i powoli dodano do oziębionej lodem mieszaniny. Wartość ph uregulowano do 6,5 stosując 300 μl kwasu octowego i do-

11 PL B1 11 dano 158 μl 5,4 mg/ml wodnego roztworu ALP. Roztwór reakcyjny pozostawiono w temperaturze 23 C i po reakcji przeprowadzono analizę RP-HPLC zakwaszonych próbek. Po 8 godzinach, stwierdzono 54% konwersji do estru metylowego ludzkiej insuliny i po 48 godzinach osiągnięto maksymalną wartość konwersji 86%. Wyizolowany ester metylowy ludzkiej insuliny można przekształcić do insuliny ludzkiej metodą alkalicznej hydrolizy. Przy takim samym czasie reakcji, tj. 8 godzin, wydajność przy zastosowaniu sposobu wytwarzania według wynalazku zwiększono o 59%, w porównaniu z procesem znanym per se. Dwa procesy mają taką samą wydajność, jeśli czas reakcji konwersji jednoetapowej znanej per se jest 6 razy dłuższy, w porównaniu z czasem reakcji dla sposobu wytwarzania według wynalazku. P r z y k ł a d mg ludzkiej proinsuliny[asp 28 ]-des(30-65), wydłużonej na N-końcu peptydem Glu-(Glu- -Ala) 3 -Pro-Lys-(numer identyfikacyjny sekwencji: 1), zawieszono w 1,35 ml wody. Łagodnie mieszając dodano mieszaninę 350 μl N,N-dimetyloformamidu i 425 μl wody i wartość ph uregulowano do 9 stosując 45 μl trietyloaminy. Do uzyskanego roztworu dodano 200 μl 8,5 mg/ml wodnego roztworu ALP i wartość ph uregulowano do 9,8 stosując 20 μl trietyloaminy. Roztwór reakcyjny pozostawiono na 1 godzinę w temperaturze 23 C. Roztwór reakcyjny zakwaszono dodając 70 μl 4 N kwasu chlorowodorowego i ochłodzono w łaźni lodowej. Dodano roztwór 300 mg estru metylowego L-treoniny w 4,95 ml N,N-dimetyloformamidu i wartość ph uregulowano do 6,5 dodając 470 μl 4 N kwasu chlorowodorowego. Roztwór reakcyjny pozostawiono przez 4 godziny w temperaturze 23 C po czym reakcję zatrzymano dodając kwas chlorowodorowy do wartości ph <3. Stosując analizę HPLC w układzie faz odwróconych na 4 mm x 250 mm 5 μl kolumnie C18 wypełnionej krzemionką z eluentem etanol-woda zawierającym 0,125 M siarczanu amonu o wartości ph uregulowanej do 4 po łącznym czasie reakcji wynoszącym 5 godzin stwierdzono wydajność konwersji do estru metylowego ludzkiej insuliny[asp B28 ] - 87%. Dla porównania przeprowadzono konwersję jednoetapową: 90 mg ludzkiej proinsuliny[asp 28 ]-des(30-65), wydłużonej na N-końcu peptydem Glu-(Glu-Ala) 3 - -Pro-Lys-(numer identyfikacyjny sekwencji: 1), zawieszono w mieszaninie 887 μl wody i 175 μl N,N- -dimetyloformamidu. 150 mg estru metylowego L-treoniny rozpuszczono w 2,13 ml N,N-dimetyloformamidu i powoli dodano do oziębionej lodem mieszaniny. Wartość ph uregulowano do 6,5 stosując 250 μl kwasu octowego i dodano 118 μl 8,5 mg/ml wodnego roztworu ALP. Po reakcji przeprowadzono analizę RP-HPLC zakwaszonych próbek. Po upływie 5 godzin stwierdzono konwersję do estru metylowego ludzkiej insuliny[asp B28 ] 47%, a po upływie 24 godzin konwersja osiągnęła wartość maksymalną 81%. Wyizolowany ester metylowy insuliny można przekształcić do insuliny ludzkiej[asp B28 ] metodą alkalicznej hydrolizy. Przy takim samym czasie reakcji, tj. 5 godzin, wydajność przy zastosowaniu sposobu wytwarzania według wynalazku zwiększyła się prawie dwukrotnie, w porównaniu z procesem znanym per se. Porównywalne wydajności w dwóch procesach otrzymano, jeśli czas reakcji konwersji jednoetapowej znanej per se był prawie 5 razy dłuższy, w porównaniu z czasem reakcji dla sposobu wytwarzania według wynalazku. P r z y k ł a d 4 1,5 g prekursora insuliny aspart, ludzkiej proinsuliny[asp 28,Met 30,Trp 31,Lys 32 ]-des(33-65), wydłużonej na N-końcu peptydem Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys- (numer identyfikacyjny sekwencji: 2), zawieszono w 3,5 g wody. Łagodnie mieszając i w temperaturze otoczenia, prekursor rozpuszczono dodając stopniowo 4 M wodorotlenek sodu do wartości ph 10,67. Dodano 3,7 g 45% (wagowo) roztworu etanolu w wodzie. Dodano 1,5 ml 5,8 mg/ml wodnego roztworu ALP i mieszaninę pozostawiono na 2 godziny do przereagowania. Wartość ph uregulowano do 4,7 dodając 4 N kwas chlorowodorowy. 2,025 g estru etylowego L-treoniny rozpuszczono w 16,2 ml etanolu i roztwór dodano przy maksymalnej temperaturze 15 C. Wartość ph uregulowano do 6,5 stosując 4 N kwas chlorowodorowy. Temperaturę uregulowano do temperatury otoczenia i mieszaninę reakcyjną pozostawiono w tej temperaturze na 20 godzin. Stosując analizę HPLC w układzie faz odwróconych na 4 mm x 250 mm 5 μl kolumny C18 wypełnionej krzemionką z eluentem acetonitryl- -woda zawierającym 200 mm siarczanu sodu o wartości ph uregulowanej do 3,6, po czasie reakcji wynoszącym 1 godzinę stwierdzono wydajność konwersji do estru etylowego insuliny aspart 89,1% i po 20 godzinach stwierdzono wydajność konwersji 90,5%. Wyizolowany ester etylowy insuliny aspart można przekształcić do insuliny aspart metodą alkalicznej hydrolizy.

12 12 PL B1 P r z y k ł a d 5 10,9 g prekursora insuliny aspart, ludzkiej proinsuliny[asp 28,Met 30,Trp 31,Lys 32 ]-des(33-65), wydłużonej na N-końcu peptydem Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys- (numer identyfikacyjny sekwencji: 2), zawieszono w 49,3 g wody. Łagodnie mieszając i w temperaturze otoczenia, prekursor rozpuszczono stopniowo dodając 37,6 g mieszaniny zawierającej 0,36 M wodorotlenek sodu, 0,27 M octan sodu i 36% N-metylo-2-pirolidon. Wartość ph uregulowano do 9,7 stosując 9,2 ml 0,5 M wodorotlenku sodu. Dodano 7,1 ml 7,1 mg/ml wodnego roztworu ALP i mieszaninę pozostawiono do przereagowania na 5 godzin. Utrzymywano stałą wartość ph 9,7, dodając w trakcie reakcji więcej 0,5 M wodorotlenku sodu. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 5 C i wartość ph uregulowano do 5,7 dodając 2,73 g 4 N kwasu chlorowodorowego. Dodano 14,02 g estru etylowego L-treoniny i wartość ph uregulowano do 6,0 stosując 4 N kwas chlorowodorowy. Dodano 344 g zimnego (4 C) N-metylo-2-pirolidonu. Temperaturę uregulowano do 22 C i wartość ph uregulowano do 6,5, stosując 4 N kwas chlorowodorowy. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono w tej temperaturze na 9 godzin. Stosując analizę HPLC w układzie faz odwróconych na 4 mm x 250 mm 5 μm kolumnie C18 wypełnionej krzemionką z eluentem acetonitryl-woda zawierającym 200 mm siarczanu sodu o wartości ph uregulowanej do 3,6, po łącznym czasie reakcji wynoszącym 14 godzin stwierdzono wydajność konwersji do estru etylowego insuliny aspart - 87,5%. Wyizolowany ester etylowy insuliny aspart można przekształcić do insuliny aspart metodą alkalicznej hydrolizy.

13 PL B1 13 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania związku insuliny, znamienny tym, że a) w mieszaninie reakcyjnej zawierającej od 55 do 70% wody (wagowo) prekursor insuliny poddaje się cięciu enzymatycznemu, a następnie, bez izolowania związku pośredniego z mieszaniny reakcyjnej, b) ten związek pośredni sprzęga się ze związkiem nukleofilowym w mieszaninie reakcyjnej o zawartości wody w zakresie od 10% do 50% (wagowo), i c) jeśli to pożądane, usuwa się grupę zabezpieczającą (grupy zabezpieczające). 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie sprzęgania stosuje się enzym stosowany również w etapie cięcia. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że przed rozpoczęciem reakcji sprzęgania przeprowadza się cięcie od 25% do 95% prekursora insuliny do związku pośredniego. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że jako enzym do cięcia enzymatycznego stosuje się trypsynę lub lizylo-specyficzną proteazę, zwłaszcza proteazę I z Achromobacter lyticus. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że jako związek nukleofilowy stosuje się ester aminokwasu. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako związek nukleofilowy stosuje się ester treoniny. 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że jako związek nukleofilowy stosuje się amid aminokwasu. 8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że jako związek nukleofilowy stosuje się peptyd. 9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że jako związek nukleofilowy stosuje się ester peptydu. 10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że jako związek nukleofilowy stosuje się amid peptydu. 11. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym ze związku insuliny usuwa się grupę zabezpieczającą (grupy zabezpieczające). 12. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, znamienny tym, że otrzymuje się związek insuliny z treoniną w pozycji B Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, albo 12, znamienny tym, że jako związek insuliny otrzymuje się insulinę ludzką, insulinę aspart, insulinę lispro, insulinę glargin lub insulinę detemir.

14 14 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)