(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP95/03601

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (2 2 ) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP95/03601 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , W096/10040, PCT Gazette nr 15/96 (51) Int.Cl.7 C07K 14/60 C07K 5/027 A61K 38/25 A61K 38/07 A61P 5/06 (54)Związki polipeptydowe zawierające D-2-alkilotryptofan wspomagające uwalnianie hormonu wzrostu oraz kompozycje farmaceutyczne je zawierające (30) Pierwszeństwo: ,IT,MI94A ,IT,MI95A (73)Uprawniony z patentu: Deghenghi Romano, St.Cergue, CH (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 16/97 (72) Twórcy wynalazku: Romano Deghenghi, St.Cergue, CH (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/01 (74) Pełnomocnik: Bogdan Barbara, POLSERVICE PL B1 (57)1. Peptyd o wzorze:, w którym A oznacza aminokwas D-Ala, D-Thr, His, lub oznacza 4-aminobutyryl, izonipekotyl, imidazoloacetyl, 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonyl, Tyr-His, D-Thr-His; D dotyczy izomeru dextro, Mrp oznacza 2-(C1-C3 alkilo)tryptofan; n wynosi 1; B oznacza L-Trp, Phe; C oznacza NH2, D-Trp-Lys-NH2, D-Phe-Lys-NH2, D-Phe-Lys-Thr-NH2, D-Phe-Lys-D-Thr-NH2, i sole z farmaceutycznie dopuszczalnymi organicznymi kwasami. 8. Kompozycja farmaceutyczna występująca w postaci kompozycji do podawania pozajelitowego, donosowego, doustnego, podawania o kontrolowanym uwalnianiu i dla implantów podskórnych, znamienna tym, ze zawiera skuteczną ilość co najmniej jednego peptydu o wzorze, w którym A oznacza aminokwas D-Ala, D-Thr, His, lub oznacza 4-aminobutyryl, izonipekotyl, imidazoloacetyl, 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonyl, Tyr-His, D-Thr-His; D dotyczy izomeru dextro, Mrp oznacza 2-(C1-C3 alkilo)tryptofan; n wynosi 1; B oznacza L-Trp, Phe; C oznacza NH2, D-Trp-Lys-NH2, D-Phe-Lys-NH2, D-Phe-Lys-Thr-NH2, D-Phe-Lys-D-Thr-NH2; jako składnika aktywnego, ewentualnie w mieszaninie z no-- śnikami i zarobkami. 9. Peptyd o wzorze:, w którym A oznacza aminokwas D-Ala, D-Thr, His, lub A oznacza imidazoloacetyl, izonipekotyl, 4-aminobutyryl, 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonyl), Tyr-His, D-Thr-His; D dotyczy izomeru dextro, Mrp oznacza 2-(C1-C3 alkilo)tryptofan; n wynosi 0 lub 1; B oznacza L- lub D-Trp, Phe lub D-β-Nal; C oznacza N H 2, D-Trp-Lys-NH2, D-Phe-Lys-NH2, Phe-Lys-NH2, D-Phe-Lys-Thr-NH2, D-Phe-Lys-D-Thr-NH2, i sole z farmaceutycznie dopuszczalnymi organicznymi kwasami. 16. Kompozycja farmaceutyczna występująca w postaci kompozycji do podawania pozajelitowego, donosowego, doustnego, podawania o kontrolowanym uwalnianiu i dla implantów podskórnych, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość co najmniej jednego peptydu o wzorze, w którym A oznacza aminokwas D-Ala, D-Thr, His, lub A oznacza imidazoloacetyl, izonipekotyl, 4-aminobutyryl, 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonyl., Tyr-His, D-Thr-His; D dotyczy izomeru dextro, Mrp oznacza 2-(C1-C3 alkilo)tryptofan; n wynosi 0 lub 1; B oznacza L- lub D-Trp, Phe lub D-β-Nal; C oznacza NH2, D-Trp-Lys-NH2, D-Phe-Lys-NH2, Phe-Lys-NH2, D-Phe-Lys-Thr-NH2, D-Phe-Lys-D-Thr-NH2, jako składnika aktywnego, ewentualnie w mieszaninie z nośnikami i zarobkami.

2 Związki polipeptydowe zawierające D-2-alkilotryptofan wspomagające uwalnianie hormonu wzrostu oraz kompozycje farmaceutyczne je zawierające 1. Peptyd o wzorze: Zastrzeżenia patentowe w którym A oznacza aminokwas D-Ala, D-Thr, His, lub oznacza 4-aminobutyryl, izonipekotyl, imidazoloacetyl, 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonyl, Tyr-His, D-Thr-His; D dotyczy izomeru dextro, Mrp oznacza 2-(C1-C3 alkilo)tryptofan; n wynosi 1; B oznacza L-Trp, Phe; C oznacza NH2, D-Trp-Lys-NH2, D-Phe-Lys-NH2, D-Phe-Lys-Thr-NH2, D-Phe-Lys-D-Thr-NH2, i sole z farmaceutycznie dopuszczalnymi organicznymi kwasami. 2. Peptyd według zastrz. 1, w którym Mrp jest wybrany z grupy obejmującej 2-metylotryptofan, 2-etylotryptofan, 2-propylotryptofan i 2-izopropylotryptofan. 3. Peptyd według zastrz. 1, w którym Mrp oznacza 2-metylotryptofan. 4. Peptyd według zastrz. 1, w którym A oznacza imidazoloacetyl, D-Ala lub D-Thr. 5. Peptyd według zastrz. 1, w którym C oznacza D-Trp-Lys-NH2, NH2. 6. Peptyd według zastrz. 1, wybrany z grupy obejmującej: Imidazolacetylo-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2; D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2; His-D-Mrp-Ala-Trp-NH2; D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-D-Thr-NH2; D-Thr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2; His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-Thr-NH2; His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-D-Thr-NH2. 7. Peptyd według zastrz. 6, w którym Mrp oznacza 2-metylotryptofan. 8. Kompozycja farmaceutyczna występująca w postaci kompozycji do podawania pozajelitowego, donosowego, doustnego, podawania o kontrolowanym uwalnianiu i dla implantów podskórnych, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość co najmniej jednego peptydu o wzorze w którym A oznacza aminokwas D-Ala, D-Thr, His, lub oznacza 4-aminobutyryl, izonipekotyl, imidazoloacetyl, 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonyl, Tyr-His, D-Thr-His; D dotyczy izomeru dextro, Mrp oznacza 2-(C1-C3 alkilo)tryptofan; n wynosi 1; B oznacza L-Trp, Phe; C oznacza NH2, D-Trp-Lys-NH2, D-Phe-Lys-NH2, D-Phe-Lys-Thr-NH2, D-Phe-Lys-D-Thr-NH2; jako składnika aktywnego, ewentualnie w mieszaninie z nośnikami i zarobkami. 9. Peptyd o wzorze: w którym A oznacza aminokwas D-Ala, D-Thr, His, lub A oznacza imidazoloacetyl, izonipekotyl, 4-aminobutyryl, 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonyl), Tyr-His, D-Thr-His; D dotyczy izomeru dextro, Mrp oznacza 2-(C1-C3 alkilo)tryptofan; n wynosi 0 lub 1; B oznacza L- lub D-Trp, Phe lub D-β-Nal; C oznacza NH2, D-Trp-Lys-NH2, D-Phe-Lys-NH2, Phe-Lys-NH2, D-Phe-Lys-Thr-NH2, D-Phe-Lys-D-Thr-NH2, i sole z farmaceutycznie dopuszczalnymi organicznymi kwasami. 10. Peptyd według zastrz. 9, w którym Mrp jest wybrany z grupy obejmującej 2-metylotryptofan, 2-etylotryptofan, 2-propylotryptofan i 2-izopropylotryptofan.

3 Peptyd według zastrz. 9, w którym Mrp oznacza 2-metylotryptofan. 12. Peptyd według zastrz. 9, w którym A oznacza imidazoloacetyl, izonipekotyl, 4-aminobutyryl. 13. Peptyd według zastrz. 9, w którym C oznacza Phe-Lys-NH Peptyd według zastrz. 9, wybrany z grupy obejmującej: IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2; INIP-D -Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2; INIP-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2; GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH Peptyd według zastrz. 14, w którym Mrp oznacza 2-metylotryptofan. 16. Kompozycja farmaceutyczna występująca w postaci kompozycji do podawania pozajelitowego, donosowego, doustnego, podawania o kontrolowanym uwalnianiu i dla implantów podskórnych, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość co najmniej jednego peptydu o wzorze. w którym A oznacza aminokwas D-Ala, D-Thr, His, lub A oznacza imidazoloacetyl, izonipekotyl, 4-aminobutyryl, 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonyl., Tyr-His, D-Thr-His; D dotyczy izomeru dextro, Mrp oznacza 2-(C1-C3 alkilo)tryptofan; n wynosi 0 lub 1; B oznacza L- lub D-Trp, Phe lub D-β-Nal; C oznacza NH2, D-Trp-Lys-NH2, D-Phe-Lys-NH2, Phe-Lys-NH2, D-Phe-Lys-Thr-NH2, D-Phe-Lys-D-Thr-NH2, jako składnika aktywnego, ewentualnie w mieszaninie z nośnikami i zarobkami. * * * Niniejszy wynalazek dotyczy związków oligopeptydowych zawierających aminokwas D-2-alkilotryptofan i które są zdolne do uwalniania hormonu wzrostu (GH) z somatotropów, i są aktywne drogą doustną. Zwiększenie poziomu hormonu wzrostu (GH) u ssaków po podaniu związków indukujących uwalnianie GH może prowadzić do przyspieszenia wzrostu, wzrostu masy mięśni oraz zwiększonej produkcji mleka, jeśli po podaniu otrzymuje się wystarczająco wysokie poziomy GH. Ponadto wiadomo, że zwiększenie poziomów hormonu wzrostu ssaków można osiągnąć przez podawanie znanych środków uwalniających hormonu wzrostu, takich jak hormony uwalniające hormon wzrostu (GHRH). Wzrost poziomów hormonu wzrostu u ssaków można także otrzymać przez podawanie pe ptydów uwalniających hormon wzrostu, z których niektóre uprzednio opisano, np. w opisach patentowych USA nr nr 4,223,019,4,223,020,4,223,021,4,224,316,4,226,857,4,228,155,4,228,156, 4,228,157, 4,228,158, 4,410,512, 4,410,513, 4,411,890 i 4,839,344. Zatem obecnie są pożądane dość proste polipeptydy o krótkim łańcuchu, zdolne do sprzyjania uwalnianiu hormonu wzrostu pod warunkiem, że są łatwo i dogodnie wytwarzalne, łatwe do oczyszczenia i utworzenia formy oraz aktywne w przypadku podawania drogą doustną. Jeden z najbardziej zbadanych peptydów uwalniania hormonu wzrostu (GHRP) jest znany od wielu lat jako GHRP-6 (C.Y. Bowers i in., Endocrinology 114:1537 (1984) i ma wzór His-D-Tr- -p-aia-trp-d-phe-lys-nh2. GHRP-6 uwalnia hormon wzrostu in vitro i in vivo i jest doustnie aktywny u zwierząt i u ludzi. Badano jego mechanizm molekularny oraz analogu heptapeptydu GHRP-1 (Cheng i in., Endocrinology 124:2791(1989); M. S. Akmani in., Endocrinology 132:1286(1993)). Stwierdzono, że w przeciwieństwie do naturalnego GHRH, peptydy te działają przez różne receptory uwalniania GH i różne mechanizmy, co jest niezależne od camp i działa innymi śródkomórkowymi szlakami, takimi jak mobilizacja dostaw wapnia i proces zależny od proteinokinazy C (PKC) (L. Bresson Bepoldin i L. DufyBarbe, Cell. Calcium 15, 247, (1994). Nieoczekiwanie stwierdzono obecnie, że wprowadzenie D-2-alkilotryptofanu (2-Mrp) do oligopeptydu szeregu GHRP.modyfikuje znany śródkomórkowy mechanizm uwalniania GH.

4 W pewnych przypadkach wykazano zasadniczy wzrost aktywności adenylocyklazy w przedniej przysadce, zarówno pochodzenia mysiego lub szczurzego jak i pochodzenia ludzkiego, lecz konkretny mechanizm nadal wymaga pełnego wyjaśnienia. Zatem modyfikacja przez pojedynczą grupę alkilową w pozycji 2 tryptofanu (w jego konformacji D), oprócz korzystnego zwiększenia trwałości reszty Trp (R. Deghenghi WO 91/18016 opublikowane i R. Deghenghi i in.,life Sciences 54, 1321, (1994)), jest odpowiedzialna na zupełnie nieoczekiwaną zmianę mechanizmów śródkomórkowych, które są obecnie niezależne od wapnia, niekiedy zależne od adenylocyklazy i bardziej podobne do występujących w przypadku GHRH oraz innych hormonów peptydowych. (James D.Watson i in., Molecular Biology of the Gene, 4 wyd., The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, Califomia, 1987, s. 60). Inną nieoczekiwaną cechą charakterystyczną wynalazku jest bardzo wysoka moc pewnych penta-, heksa-, i heptapeptydów i korzystny stosunek: doustna aktywność/moc także dla mniejszych tetrapeptydów z szeregu. Przedmiotem wynalazku jest peptyd o wzorze: w którym A oznacza aminokwas D-Ala, D-Thr, His, lub oznacza 4-aminobutyryl, izonipekotyl, imidazoloacetyl, 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonyl, Tyr-His, D-Thr-His; D dotyczy izomeru dextro, Mrp oznacza 2-(C1-C3 alkilo)tryptofan; n wynosi 1; B oznacza L-Trp, Phe; C oznacza NH2, D-Trp-Lys-NH2, D-Phe-Lys-NH2, D-Phe-Lys-Thr-NH2, D-Phe-Lys-D-Thr-NH2, i sole z farmaceutycznie dopuszczalnymi organicznymi kwasami. Peptyd według wynalazku korzystnie zawiera Mrp wybrany z grupy obejmującej 2-metylotryptofan, 2-etylotryptofan, 2-propylotryptofan i 2-izopropylotryptofan, najkorzystniej Mrp oznacza 2-metylotryptofan. Ppetyd według wynalazku korzystnie zawiera A, który oznacza imidazoloacetyl, D-Ala lub D-Thr. Peptyd według wynalazku korzystnie zawiera C, który oznacza D-Trp-Lys-NH2, NH2. Peptyd według wynalazku korzystnie wybrany jest z grupy obejmującej: Imidazolacetylo-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2; D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2; His-D-Mrp-Ala-Trp-NH2; D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-D-Thr-NH2; D-Thr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2; His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-Thr-NH2; His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-D-Thr-NH2. Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna występująca w postaci kompozycji do podawania pozajelitowego, donosowego, doustnego, podawania o kontrolowanym uwalnianiu i dla implantów podskórnych, charakteryzująca się tym, że zawiera skuteczną ilość co najmniej jednego peptydu o wzorze: w którym A oznacza aminokwas D-Ala, D-Thr, His, lub oznacza 4-aminobutyryl, izonipekotyl, imidazoloacetyl, 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonyl), Tyr-His, D-Thr-His; D dotyczy izomeru dextro, Mrp oznacza 2-(C1-C3 alkilo)tryptofan; n wynosi 1; B oznacza L-Trp, Phe; C oznacza NH2, D-Trp-Lys-NH2, D-Phe-Lys-NH2, D-Phe-Lys-Thr-NH2, D-Phe-Lys-D-Thr-NH2; jako składnika aktywnego, ewentualnie w mieszaninie z nośnikami i zarobkami. Przedmiotem wynalazku jest także peptyd o wzorze: w którym A oznacza aminokwas D-Ala, D-Thr, His, lub A oznacza imidazoloacetyl, izonipekotyl, 4-aminobutyryl, 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonyl, Tyr-His, D-Thr-His; D dotyczy

5 izomeru dextro, Mrp oznacza 2-(C1-C3 alkilo)tryptofan; n wynosi 0 lub 1; B oznacza L- lub D-Trp, Phe lub D-β-Nal; C oznacza NH2, D-Trp-Lys-NH2, D-Phe-Lys-NH2, Phe-Lys-NH2, D-Phe-Lys-Thr-NH2, D-Phe-Lys-D-Thr-NH2, i sole z farmaceutycznie dopuszczalnymi organicznymi kwasami. Peptyd według wynalazku korzystnie zawiera Mrp wybrany z grupy obejmującej 2-metylotryptofan, 2-etylotryptofan, 2-propylotryptofan i 2-izopropylotryptofan. Peptyd według wynalazku korzystnie zawiera Mrp, który oznacza 2-metylotryptofan. Peptyd według wynalazku korzystnie zawiera A, który oznacza imidazoloacetyl, izonipekotyl, 4-aminobutyryl. Peptyd według wynalazku korzystnie zawiera C, który oznacza Phe-Lys-NH2. Peptyd według wynalazku jest wybrany z grupy obejmującej : IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2; INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2; INIP-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2; GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna występująca w postaci kompozycji do podawania pozajelitowego, donosowego, doustnego, podawania o kontrolowanym uwalnianiu i dla implantów podskórnych, charakteryzująca się tym, że zawiera skuteczną ilość co najmniej jednego peptydu o wzorze: w którym A oznacza aminokwas D-Ala, D-Thr, His, lub A oznacza imidazoloacetyl, izonipekotyl, 4-aminobutyryl, 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonyl, Tyr-His, D-Thr-His; D dotyczy izomeru dextro, Mrp oznacza 2-(C1-C3 alkilo)tryptofan; n wynosi 0 lub 1; B oznacza L- lub D-Trp, Phe lub D-β-Nal; C oznacza NH2, D-Trp-Lys-NH2, D-Phe-Lys-NH2, Phe-Lys-NH2, D-Phe-Lys-Thr-NH2, D-Phe-Lys-D-Thr-NH2, jako składnika aktywnego, ewentualnie w mieszaninie z nośnikami i zarobkami. Skróty użyte dla reszt aminokwasowych są zgodne ze standardową nomenklaturą dla peptydów: Gly = Glicyna Tyr = L-Tyrozyna Ile = L-Izoleucyna Glu = Kwas L-glutaminowy Thr = L-Treonina Phe = L-Fenyloalanina Ala = L-Alanina Lys = L-Lizyna Asp = Kwas L-asparaginowy Cys = L-Cysteina Arg = L-Arginina Gln = L-Glutamina Pro = L-Prolina Leu = L-Leucyna Met = L-Metionina Ser = L-Seryna Asn = L-Asparagina His = L-Histydyna Trp = L-Tryptofan Val = L-Walina. Ponadto, D-β-Nal= D-β-Naftyloalanina; INIP = Izonipekotyl;

6 IMA = Imidazoliloacetyl; GAB = 4-aminobutyryl; Mrp = 2-alkilotryptofan. Według wynalazku, przez alkil w zamierzeniu rozumie się niższy alkil, obejmujący od 1 do 3 atomów węgla. Przykładami niższego alkilu są metyl, etyl, propyl, izopropyl. Spośród nich, korzystny jest metyl. Wszystkie skróty trzyliterowe aminokwasów poprzedzone przez D wskazują konfigurację D reszty aminokwasowej. Korzystnymi związkami uwalniającymi hormon wzrostu w wykonaniu według wynalazku są: INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2; INIP-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2; IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2; IMA-D-Mrp-D-β -Nal-Phe-Lys -N H 2 ; GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2; GAB-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2; 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonylo-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2; 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonylo-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2; D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2; D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2; His-D-Mrp-Ala-Phe-D-Trp-LysNH2; Tyr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2; His-D-Mrp-Ala-TrpNH2; D -Thr-D-Mrp-Ala-TrpNH2; w którym Mrp oznacza 2-metylotryptofan, INIP, IMA i GAB są takie jak określono powyżej, oraz sole z farmaceutycznie dopuszczalnymi kwasami organicznymi. Związki te można podawać pozajelitowo, lecz dogodniej donosowo i doustnie, lub można formułować w układach o kontrolowanym uwalnianiu, takich jak biodegradowalne mikrokap sułki, mikrosfery, implanty podskórne, itp. Związki polipetydowe według wynalazku można zsyntetyzować zwykłymi metodami chemii peptydów, zarówno w fazie stałej jak i w roztworze, lub za pomocą klasycznych metod znanych według stanu techniki. Synteza w fazie stałej rozpoczyna się od C-końcowego końca peptydu. Odpowiednią substancję wyjściową można wytworzyć, np. przyłączając żądany zabezpieczony alfa-aminokwas do żywicy chlorometylowanej, żywicy hydroksymetylowanej, żywicy benzhydryloaminowej (BHA), lub do żywicy para-metylobenzhydrylaminowej (p-me-bha). Np. żywica chlorometylowana jest sprzedawana pod nazwą handlową BIOBEADS(R) SX1 przez BioRad Laboratories, Richmond, Califomia. Wytwarzanie żywicy hydroksymetylowej opisali Bodansky i in., Chem. Ind. (London) 38,15997, (1996). Żywicę BHA opisali Pietta i Marshall, Chem. Comm., 650 (1970) i jest ona handlowo dostępna od Peninsula Laboratories Inc., Belmont, California. Po początkowym przyłączeniu, grupę zabezpieczającą alfa-aminokwasu można usunąć za pom ocą różnych reagentów kwasowych, obejmujących kwas trifluorooctowy (TFA) lub solny (HC1) rozpuszczony w rozpuszczalnikach organicznych w temperaturze pokojowej. Po usunięciu grupy zabezpieczającej alfa-aminokwasu, pozostałe zabezpieczone aminokwasy można sprzęgać krok po kroku w żądanym porządku. Każdy zabezpieczony aminokwas można w ogólnym przypadku poddać reakcji w około trzykrotnym nadmiarze stosując odpowiednią grupę aktywującą karboksyl, taką jak dicykloheksylokarbodiimid (DCC) lub diizopropylokar bodiimid (DIC) rozpuszczony, np. w chlorku metylenu (CH2C12) lub dimetyloformamidzie (DMF) i ich mieszaninach. Po uzyskaniu żądanej sekwencji aminokwasowej, żądany peptyd można odszczepić o żywicy - podłoża przez działanie reagentem, takim jak fluorowodór (HF), który odszczepia od żywicy nie tylko peptyd, lecz także najczęściej występujące grupy zabezpieczające łańcuchów bocznych. Gdy stosuje się żywicę chlorometylowaną lub hydroksymetylo waną działanie HF prowadzi do tworzenia peptydu kwasowego w postaci wolnej. Gdy stosuje się

7 żywicę BHA lub p-me-bha, działanie HF bezpośrednio prowadzi do tworzenia peptydu amidowego w postaci wolnej. Wyżej omawiana procedura w fazie stałej jest znana według stanu techniki i opisano ją w: Atherton i Sheppard, Solid Phase Peptide Synhesis (ERL Press, Oxford, 1989). Pewne metody w roztworze, które można użyć do syntezy ugrupowań peptydowych według wynalazku opisano w: Bodansky i in., Peptide Synthesis, 2. wyd., John Wiley & Sons, New York, N.Y oraz Jones, The Chemical Synthesis of Peptides, (Clarendon Press, Oxford, 1994). Związki te można podawać zwierzętom i ludziom w skutecznej dawce, którą może łatwo określić specjalista z dziedziny techniki i która może się zmieniać stosownie do gatunku, wieku, płci i wagi osobnika poddawanego jej działaniu. Np. u ludzi, przy podawaniu dożylnym, korzystna dawka mieści się w zakresie od 0,1 μg do 10 (μg ogółu peptydu na kg wagi ciała. Przy podawaniu doustnym, w typowym przypadku są niezbędne większe ilości. Np. przy podawaniu doustnym u ludzi, poziom dawki w typowym przypadku wynosi od 30 μg do 1000 μg polipeptydu na kg wagi ciała. Dokładny poziom można łatwo określić empirycznie w oparciu o powyższe ujawnienie. Kompozycje, które obejmują jako składnik aktywny organiczne i nieorganiczne sole addycyjne wyżej opisanych polipeptydów i ich kombinacje, ewentualnie, w mieszaninie z zaróbką, rozcieńczalnikiem, matrycą lub powłoką opóźnionego uwalniania, są także objęte zakresem wynalazku. Formy farmaceutyczne o opóźnionym uwalnianiu, obejmujące matryce bioerodowalne, odpowiednie dla implantów podskórnych, są szczególnie interesujące. Przykłady tych matryc opisano w WO 92/22600 i WO 95/ Aktywność biologiczna. Aktywność tych związków in vivo określono u dziesięciodniowych szczurów, którym podskórnie wstrzyknięto (s.c) dawkę 300 μg/kg lub różne dawki w badaniach dawka-reakcja, według szczegółowego opisu w: R. Deghenghi i in., Life Sciences 54,1321, (1994). Wyniki podsumowano w poniższej tabeli, uwolniony GH zmierzono po 15 minutach od podania. GHRP-2 (wzorzec odniesienia) ma wzór D-Ala-D-β-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2 (Chen i Clarke, J. Neuroend. 7, 179 (1995). Peptyd Tabela Dawka (ig/kg such.kom. GH kontrolny (ng/ml) GH uwolniony (ng/ml) His-D-Mrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Thr-NH ± ±20 His-D-Mrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-D-Thr-NH ± ±27 D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-D-Thr-NH ± ± 20 D-Thr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH ± 8 86 ± 19 D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH ± ± 20 D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH ± ± 32 His-D-Mrp-Ala-Trp-NH ± ±37 Imidazoacetylo-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH ± ±27 1N1P-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH INIP-D-Mrp-D-P-Nal-Phe-Lys-NH GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH (GHRP-2) ,6 Aktywność in vitro adenylocyklazy zmierzono w komórkach przedniej przysadki szczurów o wadze 150 g i wykazano 30% wzrostu w porównaniu z linią podstawową przy EC50-0,23 nm

8 dla peptydu D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2, podczas gdy GHRP-6 (His-D-Trp-Ala-Tr- -p-d-phe-lysnh2) okazało się nieaktywne. Następujące przykłady dalej ilustrują wynalazek. Przykład I. Synteza GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2 (Mrp = 2-metylotryptofan). Syntezę przeprowadzono w fazie stałej z aminokwasami 9-fluorenylometyloksykarbonylowymi (Fmoc) wraz z wytwarzaniem żywicy i zestawieniem w kolumnie reaktora według jednej z szeregu metod dostępnych specjaliście według stanu techniki, jak podano w Solid phase peptide synthesis E. Atherton i R.C. Sheppard, IRL press at Oxford University Press, Zabezpieczonymi aminokwasami są Fmoc-Lys(Fmoc)-Optp (Opfp = ester pentafluorofenylowy), Fmoc-Phe-Opfp, Fmoc-D-Trp-Opfp, Fmoc-D-2-MeTrp-Opfp i Fmoc-GAB-Opfp (GAB = gamma - aminomasłowy). Alternatywnie, można także korzystnie zastosować reagenty Castro, BOP i PyBOP (por. Le Nguyen i Castro (1988) w Peptide Chemistry 1987, s ). Protein Research Foundation Osaka; i Tetrahedron Letters 31,205 (1990) jako reagenty bezpośredniego sprzęgania. Po rozszczepieniu i wyodrębnieniu, tytułowy peptyd oczyszczono jako octan. Czystość (HPLC): 98%, C. cząst. 30(M+H+) = 764,3 (teoretyczna = 763.9). Przykładu. Według procedur opisanych w przykładzie I, wytworzono następujące pep tydy i otrzymano jako octany: INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2; czystość (HPLC) = 99.0%, c.cząst.(m+h+ = 790.4; teoretyczny = 790.0) INIP-D-Mrp-D-p-Nal-Phe-Lys-NH2; czystość (HPLC) = 96.5%, c. cząst. (M+H+ = 801.4; teoretyczny = 801.0) IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2; czystość (HPLC) = 99.2%, c. cząst. (M+H+ = 786.5; teoretyczny = 786.8) IMA-D-Mrp-D-P-Nal-Phe-Lys-NH2; czystość (HPLC) = 97.3%, c. cząst. (M+H = 798.3; teoretyczny = 797.9) GAB-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2; 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonylo-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2; 4-(aminometylo)cykloheksanokarbonylo-D-Mrp-D-β-Nal-Phe-Lys-NH2; D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2; D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2; His-D-Mrp-Ala-Phe-D-Trp-LysNH2; Tyr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH2; His-D-Mrp-Ala-TrpNH2; D-Thr-D-Mrp-Ala-TrpNH2; w którym Mrp oznacza 2-metylotryptofan, a INIP, IMA i GAB są takie jak określono wyżej. Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 2,00 zł.