UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU,

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. C07C 51/493 ( ) C07C 57/12 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Sposób wydzielania izomeru c9,t11 sprzężonego kwasu linolowego (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 16/13 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 07/14 (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL (72) Twórca(y) wynalazku: NATALIA NIEZGODA, Suchy Bór, PL CZESŁAW WAWRZEŃCZYK, Wrocław, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Olszewska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wydzielania izomeru c9,t11 sprzężonego kwasu linolowego (CLA) o wzorze 1 przedstawionym na rysunku, z mieszaniny izomerów c9,t11 i t10,c12 CLA metodą enzymatycznej estryfikacji z udziałem lipazy z Candida cylindracea. Wynalazek ten może znaleźć zastosowanie w produkcji suplementów diety dla sportowców i kulturystów lub środków wspomagający terapię przeciwnowotworową. Sposób otrzymywania sprzężonego kwasu linolowego na skalę przemysłową opiera się na izomeryzacji kwasu linolowego w środowisku zasadowym (Niezgoda N. i inni, 2011, Przem. Chem., 90, s. 949, Chin S. F. i inni, 1992, J. Food Compos. Anal., 5, s. 185). Uzyskuje się w ten sposób mieszaninę głównie dwóch izomerów c9,t11 i t10,c12 CLA. Przeprowadzone badania dotyczące właściwości przeciwnowotworowych wykazały, że izomery te mogą różnić się aktywnością cytotoksyczną w stosunku to różnych typów komórek nowotworowych (Palombo J. D. i inni, 2002, Cancer Lett., 177, s. 163; Kim Y.S. i inni, 2008, J. Food Sci., 73, s. T7; Beppu F. i inni, 2006, J. Nutr. Biochem., 17, s. 830). Czysty izomer c9,t11 CLA wykazuje aktywność przeciwnowotworową w stosunku do komórek raka jelita grubego (Degen C. i inni, 2012, Toxicol. In Vitro, 26, s. 985). Ważne jest zatem otrzymanie czystych preparatów tych dwóch izomerów. Znana jest metoda oczyszczania izomeru c9,t12 CLA w reakcji enzymatycznej estryfikacji alkoholem metylowym lub etylowym w rozpuszczalnikach organicznych np. w 3-heptanonie, izooktanie lub heksanie, gdzie jako katalizator stosowano lipazę z Geotrichum candidum (Haas M. J. i inni, 1999, Lipids, 34, s. 979). W literaturze opisanych jest kilka metod enzymatycznego oczyszczania izomeru c9,t11 sprzężonego kwasu linolowego. Polegają one na jedno lub dwuetapowej selektywnej estryfikacji mieszaniny izomerów CLA za pomocą specyficznych w stosunku do wiązania cis-9 lipaz pochodzenia mikrobiologicznego. W wyniku selektywnego działania lipaz frakcja tworzących się w reakcji estrów wzbogacona zostaje w izomer c9,t11. Znana jest metoda polegająca na dwuetapowym procesie oczyszczania izomeru c9,t11 CLA w dwóch następujących po sobie reakcjach enzymatycznej estryfikacji alkoholem butylowym katalizowanych lipazą z Aspergillus niger w środowisku dwufazowym (CLA, alkohol butylowy:woda) (Chen C.-A. i inni, 1999, Lipids, 34, s. 879). Z kolei McNeill G. P. i inni, opisują estryfikacje alkoholem Iaurylowym katalizowane lipazą z Geotrichum candidum w środowisku dwufazowym (CLA, alkohol laurylowy:woda) (1999, J. Am. Oil Chem. Soc., 76, s. 1265), zaś katalizowane lipazą z Candida cylindracea (rugosa) opisują Nagao T. i inni, (2002, J. Am. Oil Chem. Soc., 79, s. 303). Kobayashi T. i inni, (J. Am. Oil Chem. Soc., 2006, 83, s. 93) wskazują na estryfikacje mentolem katalizowane lipazą z Candida cylindracea (rugosa) w środowisku dwufazowym (CLA, mentol:woda). Znany jest również jednoetapowy proces oczyszczania izomeru c9,t11 CLA w reakcji enzymatycznej estryfikacji alkoholem etylowym katalizowanej lipazą z Candida cylindracea (rugosa) AY 30 w środowisku dwufazowym (CLA:bufor fosforanowy o ph 6,5, etanol) (Wang Y. i inni, 2007, J. Mol. Cat. B., 46, s. 20). W powyższych metodach drugi etap enzymatyczny musi być poprzedzony: rozdziałem na frakcję estrową i frakcję wolnych kwasów tłuszczowych wykonanym przeważnie poprzez wielokrotną destylację molekularną, a następnie hydrolizą frakcji estrowej wzbogaconej w izomer c9,t11 CLA. Natomiast najczęściej stosowanymi substratami alkoholowymi w reakcjach enzymatycznej estryfikacji jest mentol lub alkohol laurylowy. Zastosowanie takich alkoholi stwarza trudność w oddzieleniu ich od frakcji otrzymanego estru prostymi metodami chromatograficznymi. Przeprowadzenie procesu enzymatycznego w środowisku dwufazowym złożonym z wody i sprzężonego kwasu linolowego, w przeciwieństwie do reakcji prowadzonych w rozpuszczalnikach organicznych pozwala na zachowanie dużej szybkości estryfikacji, co wiąże się ze specyfiką lipaz działających na granicy fazy. Niektóre z metod wykorzystujących reakcję w środowisku dwufazowym prowadzonych jest z zastosowaniem buforów umożliwiających utrzymanie stałego ph. Znana jest metoda wydzielania izomeru c9,t11 sprzężonego kwasu linolowego, polegająca na dwuetapowym oczyszczaniu izomeru c9,t11 CLA w wyniku enzymatycznej estryfikacji alkoholem Iaurylowym katalizowanej lipazą z Candida cylindracea (rugosa) (Nagao T. i inni, 2003, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, s. 1429). W tej metodzie, rozdziału dokonuje się stosując wyjściowo około równomolową mieszaninę izomerów c9,t11 i t10,c12 CLA otrzymaną w wyniku izomeryzacji w środowisku

3 PL B1 3 zasadowym kwasu linolowego o wysokiej czystości. Reakcje enzymatycznej estryfikacji prowadzi się w temperaturze 30 C w środowisku dwufazowym (CLA, alkohol laurylowy:woda) stosując sprzężony kwas linolowy w stosunku molowym do alkoholu Iaurylowego 1:1. Po pierwszym z dwóch etapów enzymatycznych następuje rozdział reagentów w wyniku dwustopniowej destylacji molekularnej, gdzie w pierwszym etapie usuwa się w większości nieprzereagowany alkohol laurylowy, a w drugim etapie rozdziela się estry alkoholu Iaurylowego od wolnego sprzężonego kwasu linolowego. Następnie estry hydrolizowane są chemicznie do kwasów w etanolowym roztworze NaOH i ekstrahowane heksanem. Wzbogacony izomer c9,t11 CLA poddaje się drugiemu etapowi enzymatycznej estryfikacji i ponownie wydziela frakcję estrów w wyniku destylacji molekularnej. Dodatkowo ester laurylowy oczyszcza się w procesie ekstrakcji heksanem, hydrolizuje do wolnych kwasów i ekstrahuje się. Następnie wykonuje się jeszcze 3 etapy destylacji molekularnej z dodatkiem triacylogliceroli otrzymując ostatecznie izomer c9,t11 o czystości 93,1% z wydajnością 34%. Znany sposób składa się, więc z wielu etapów, co wpływa znacząco na wydłużenie czasu trwania całego procesu. Okazało się, że proces ten można uprościć, zastępując jeden z etapów enzymatycznych innym, nieenzymatycznym procesem. Istotą wynalazku jest to, że etap enzymatycznej estryfikacji CLA 2-propanolem w nadmiarze molowym od 3 do 7, prowadzony w temperaturze od 25 do 35 C i zakończony w momencie osiągnięcia stopnia przereagowania na poziomie od 15 do 40%, poprzedzony jest krystalizacją estrów metylowych mieszaniny izomerów CLA z roztworu acetonowego w temperaturze od -75 do -55 C. Stosunek wagowo-objętościowy estrów metylowych CLA do acetonu wynosi od 3 g:15 ml do 3 g:40 ml. krystalizację prowadzi się przez, co najmniej 10 minut od osiągnięcia przez roztwór acetonu temperatury krystalizacji, po czym precypitat oddziela się od supernatantu poprzez filtrację, a następnie poddaje się go hydrolizie. Korzystnie jest, gdy nadmiar molowy 2-propanolu wynosi 5, natomiast etap enzymatycznej estryfikacji prowadzi się w temperaturze 30 C. Korzystnie także jest, gdy stopień przereagowania CLA wynosi od 30 do 35%. Korzystnie również jest, gdy temperatura krystalizacji wynosi -65 C, zaś stosunek wagowo- -objętościowy estrów metylowych CLA do acetonu wynosi od 3 g:25 ml do 3 g:35 ml. Zaletą sposobu według wynalazku jest to, że z dwóch etapów, w których następuje wzbogacenie izomeru c9,t11 tylko drugi jest procesem enzymatycznej estryfikacji. Żadna spośród znanych metod nie uwzględnia etapu wstępnego oczyszczania c9,t11 CLA za pomocą niskotemperaturowej krystalizacji jego estrów metylowych z acetonu jako alternatywy pierwszego z etapów enzymatycznych. Wprowadzenie etapu krystalizacji pozwala na uproszczenie i znaczne skrócenie całego procesu, gdyż w jej wyniku następuje jednoczesne wzbogacenie supernatantu w izomer c9,t11 CLA i oddzielenie od frakcji precypitatu wzbogaconej w drugi izomer, który wystarczy odseparować przez filtrację. Zaletą jest również zastosowanie 2-propanolu, jako substratu w enzymatycznej estryfikacji, co pozwala na łatwe usunięcie nieprzereagowanych pozostałości tego alkoholu z mieszaniny poreakcyjnej poprzez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem. Zastosowanie lotnych alkoholi metanolu i etanolu pozwala na ich odparowanie z otrzymanego produktu estryfikacji, jednak reakcje z ich użyciem zwykle dają produkt o niezbyt wysokiej zawartości c9,t11 lub niskiej wydajności. Wszystkie pozostałe po oczyszczaniu uboczne frakcje sprzężonego kwasu linolowego można odzyskać i poddać ponownemu oczyszczaniu. Sposób według wynalazku opisany w przykładzie wykonania jest bliżej objaśniony na rysunku, w którym wzór 1 przedstawia izomer c9,t11 CLA natomiast fig. 2 przedstawia schemat blokowy procesu wydzielania tego izomeru z około równomolowej mieszaniny izomerów c9,t11 i t10,c12 CLA. P r z y k ł a d. 9,0 g (32,1 mmol) kwasu linolowego poddaje się izomeryzacji w środowisku zasadowym, używając 23,4 g (0,44 mol) KOH i 90 ml glikolu etylenowego. Mieszaninę ogrzewa się przez 4 godziny w temperaturze 165 C pod chłodnicą zwrotną na mieszadle magnetycznym z funkcją grzania. Mieszaninę poreakcyjną ochładza się i rozcieńcza wodą destylowaną do objętości 300 ml, a następnie zakwasza stężonym kwasem siarkowym do ph 3,0; po czym ekstrahuje się heksanem (3 x 150 ml). Frakcję heksanową przemywa się 30% roztworem metanolu w wodzie destylowanej (3 x 150 ml), a następnie wodą destylowaną. Ekstrakt osusza się bezwodnym siarczanem magnezu. Heksan odparowuje się na wyparce rotacyjnej w temp. 45 C. W ten sposób otrzymuje się mieszaninę izomerów CLA o składzie: c9,t11 (48,5%) i t10,c12 (48,3%) i 3,2% innych izomerów.

4 4 PL B1 Otrzymany sprzężony kwas linolowy (8,9 g) poddaje się estryfikacji metanolem, stosując 375 ml 4% roztworu H 2 SO 4 w metanolu. Reakcję prowadzi się przez 2 godziny w temperaturze 50 C. Mieszaninę po reakcji ekstrahuje się heksanem (3 x 150 ml), przemywa się wodą destylowaną i osusza bezwodnym MgSO 4, a heksan odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Próbki po 3,0 g (10,2 mmol) estrów metylowych CLA umieszczonych w 100 ml kolbie okrągłodennej rozpuszcza się w 30 ml acetonu, a następnie schładza się do temperatury -30 C i umieszcza się w łaźni wypełnionej etanolem o temperaturze -60 C i pozostawia się bez mieszania przez 20 minut od momentu uzyskania przez roztwór acetonowy temperatury krystalizacji. Wytrącone kryształy oddziela się od supernatantu na schłodzonym lejku Shotta, stosując podciśnienie. W ten sposób możliwy jest do uzyskania filtrat pozostający po oddzieleniu kryształów wzbogacony w izomer c9,t11 CLA (68,4%). Wzbogacony izomer c9,t11 CLA w postaci estrów metylowych (9,43 g; 32,1 mmol) poddaje się hydrolizie w 0,75 M metanolowym roztworze NaOH (92 ml) z dodatkiem 35 ml H 2 O w temperaturze 50 C na mieszadle magnetycznym z funkcją grzania. Po 3 godzinach reakcji roztwór zakwasza się 2 M HCI do ph 3,0 i dodaje się 100 ml wody destylowanej, a następnie ekstrahuje się heksanem (3 x 150 ml). Frakcje heksanowe łączy się i przemywa wodą destylowaną do uzyskania ph obojętnego wody, po czym osusza się bezwodnym MgSO 4 i odparowuje na wyparce rotacyjnej uzyskując 8,82 g (wydajność 98%) CLA w postaci wolnych kwasów. Mieszaninę izomerów CLA (8,82 g; 31,4 mmol) poddaje się następnie enzymatycznej estryfikacji z 5-krotnym nadmiarem molowym 2-propanolu (12 ml; 157,2 mmol) w środowisku dwufazowym (17 ml wody) i z dodatkiem 212 mg lipazy z Candida cylindracea (rugosa) w postaci liofilizowanego proszku o aktywności 2,8 U/mg (według wskazań producenta). Reakcję prowadzi się w zamkniętej szklanym korkiem kolbie stożkowej (250 ml) ze szlifem, w temperaturze 30 C na mieszadle magnetycznym, przy silnym mieszaniu (750 RPM). Po 6 godzinach mieszaninę reakcyjną przesącza się przez kolumnę z ziemią okrzemkową w celu oddzielenia enzymu i przepłukuje acetonem. Do przesączu dodaje się 25 ml wody destylowanej i ekstrahuje heksanem (3 x 20 ml). Frakcje heksanu osusza się bezwodnym MgSO 4, a heksan odparowuje pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej (45 C). Estry izopropylowe sprzężonego kwasu linolowego oddziela się od wolnych kwasów na kolumnie chromatograficznej wypełnionej żelem krzemionkowym, stosując mieszaninę heksan:eter dietylowy 9:1 (v/v) jako eluent. Frakcje zawierające estry izopropylowe łączy się i odparowuje eluent na wyparce rotacyjnej. Uzyskuje się tym sposobem 3,15 g estru izopropylowego izomeru c9,t11 CLA o czystości 94,2%, przy wydajności procesu 31%. W celu uzyskania izomeru c9,t11 CLA w postaci wolnego kwasu poddaje się go hydrolizie w 0,75 M metanolowym roztworze NaOH (120 ml) z dodatkiem 45 ml wody, w temperaturze 50 C. Po 5 h reakcji mieszaninę reakcyjną zakwasza się 2 M HCI do ph 3,0, a następnie dodaje się 150 ml wody destylowanej i ekstrahuje się heksanem (3 x 150 ml). Frakcje heksanowe łączy się i przemywa wodą destylowaną do uzyskania obojętnego ph frakcji wodnej, po czym osusza się je bezwodnym MgSO 4 i odparowuje uzyskując 2,72 g (9,69 mmol) c9,t11 CLA co stanowi 99% wydajności. Całkowita wydajność przeliczona w stosunku do 8,82 g wyjściowej mieszaniny izomerów CLA wynosi 31%. Dokładny skład otrzymanego preparatu według analizy przeprowadzonej za pomocą chromatografii gazowej wynosi: 94,2% c9,t11; 2,5% t10,c12; 0,4% izomery c,c; 0,9% izomery t,t; 2,0% inne izomery CLA. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wydzielania izomeru c9,t11 sprzężonego kwasu linolowego z około równomolowej mieszaniny izomerów c9,t11 i t10,c12 CLA, polegający na tym, że oczyszcza się izomer c9,t11 CLA w wyniku enzymatycznej estryfikacji katalizowanej lipazą Candida cylindracea prowadzonej w środowisku dwufazowym, następnie powstałe w wyniku reakcji estry oddziela się od nieprzereagowanych kwasów, po czym estry hydrolizuje się chemicznie do kwasów, znamienny tym, że etap enzymatycznej estryfikacji CLA 2-propanolem w nadmiarze molowym od 3 do 7, prowadzony w temperaturze od 25 do 35 C i zakończony w momencie osiągnięcia stopnia przereagowania na poziomie od 15 do 40%, poprzedzony jest krystalizacją estrów metylowych mieszaniny izomerów CLA z roztworu acetonowego w temperaturze od -75 do -55 C, przy czym stosunek wagowo-objętościowy estrów metylowych CLA do acetonu wynosi od 3 g:15 ml do 3 g:40 ml, w czasie co najmniej 10 minut od osiągnięcia przez roztwór acetonu temperatury krystalizacji, po czym precypitat oddziela się od supernatantu poprzez filtrację, a następnie poddaje się go hydrolizie.

5 PL B Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nadmiar molowy 2-propanolu wynosi Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap enzymatycznej estryfikacji prowadzi się w temperaturze 30 C. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stopień przereagowania CLA wynosi od 30 do 35%. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że temperatura krystalizacji wynosi -65 C. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek wagowo-objętościowy estrów metylowych CLA do acetonu wynosi od 3 g:25 ml do 3 g:35 ml. Rysunki

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)