(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) T3 (1) Int. Cl. C12N1/82 A01H/00 ( ) ( ) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej Europejski Biuletyn Patentowy 20/02 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Rośliny o zwiększonej aktywności wielu enzymów fosforylujących skrobię (30) Pierwszeństwo: EP EP US P EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2006/48 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 06/20 (73) Uprawniony z patentu: Bayer CropScience AG, Monheim, DE (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 FROHBERG Claus, Kleinmachnow, DE KOETTING Oliver, Zürich, CH RITTE Gerhard, Potsdam, DE STEUP Martin, Berlin, DE (74) Pełnomocnik: Sulima Grabowska i Sierzputowska Biuro Patentów i Znaków Towarowych sp.j. rzecz. pat. Sulima Zofia Warszawa skr. poczt. 6 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-87VAL EP B1 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy komórek roślinnych i roślin, które zostały genetycznie zmodyfikowane, przy czym modyfikacja genetyczna prowadzi do wzrostu aktywności fosforylującego skrobię białka OK1 oraz fosforylującego skrobię białka R1 w porównaniu z odpowiadającymi im komórkami roślinnymi typu dzikiego lub roślinami typu dzikiego, które nie zostały genetycznie zmodyfikowane. Ponadto niniejszy wynalazek dotyczy sposobów i środków do wytwarzania takich komórek roślinnych i roślin. Komórki roślinne i rośliny tego typu syntetyzują modyfikowaną skrobię. Niniejszy wynalazek zatem dotyczy również skrobi syntetyzowanej przez komórki roślinne i rośliny według wynalazku, sposobów wytwarzania tej skrobi i wytwarzania skrobiowych pochodnych tej skrobi modyfikowanej, a także mąki zawierającej skrobię według wynalazku. Ponadto niniejszy wynalazek dotyczy cząsteczek kwasu nukleinowego oraz wektorów zawierających sekwencje kodujące białko OK1 i białko R1, jak również komórek gospodarzy, które zawierają te cząsteczki kwasu nukleinowego. [0002] W odniesieniu do coraz większego znaczenia obecnie przypisywanego składnikom roślinnym jako odnawialnym źródłom surowców, jednym z zadań badań biotechnologicznych są starania mające na celu dostosowanie tych surowców roślinnych do spełnienia wymagań przemysłu przetwórczego. Ponadto konieczne jest uzyskanie wielu różnych materiałów, w celu umożliwienia odtwarzania surowców stosowanych w tak wielu obszarach zastosowania, jak to tylko możliwe. [0003] Polisacharyd skrobia składa się z jednorodnych chemicznie elementów podstawowych, cząsteczek glukozy, ale stanowi złożoną mieszaninę różnych form cząsteczek, wykazujących różnice w odniesieniu do stopnia polimeryzacji i rozgałęzienia, a zatem znacznie różniących się od siebie pod względem swoich właściwości fizykochemicznych. Rozróżnia się skrobię amylozową, zasadniczo nierozgałęziony polimer złożony z cząsteczek glukozy połączonych wiązaniem alfa-1,4-glikozydowym i skrobię amylopektynową, rozgałęziony polimer, w którym rozgałęzienia pojawiają się w wyniku dodatkowych wiązań alfa-1,6-glikozydowych. Kolejna istotna różnica między amylozą i amylopektyną tkwi w masie cząsteczkowej. Podczas gdy amyloza, w zależności od źródła pochodzenia skrobi, ma masę cząsteczkową od x - 6 Da, masa amylopektyny mieści się w zakresie pomiędzy 7 a 8 Da. Te dwie makrocząsteczeki można odróżnić w zależności od ich masy cząsteczkowej oraz ich różnych właściwości fizykochemicznych, które można najłatwiej uwidocznić przez ich różne właściwości wiązania jodu.

3 Amyloza od dawna postrzegana jest jako liniowy polimer składający się z monomerów alfa-d glukozy połączonych wiązaniem alfa-1,4-glikozydowym. Jednakże w najnowszych badaniach wykazano obecność alfa-1,6-glikozydowych punktów rozgałęziających (około 0,1%) (Hizukuri i Takagi, Carbohydr. Res. 134, (1984), 1-; Takeda i in., Carbohydr. Res. 132, (1984), 83-92). [0004] Na cechy funkcjonalne skrobi, takie jak przykładowo rozpuszczalność w wodzie, uleganie retrogradacji, zdolność wiązania wody, właściwości błonotwórcze, lepkość, kleistość, stabilność przy zamrażaniu-rozmrażaniu, odporność na kwasy, siła żelowania, wielkość ziaren skrobi w skrobi oraz inne, wpływa stosunek amylozy do amylopektyny, masa cząsteczkowa, układ rozmieszczenia łańcuchów bocznych, stężenie jonów, zawartość lipidów i białka, średnia wielkość ziaren skrobi w skrobi, morfologia ziaren skrobi itp. Na cechy funkcjonalne skrobi wpływa także zawartość fosforanów, niewęglowego składnika skrobi. Odróżnia się fosforan, które jest kowalencyjnie związany z cząsteczkami glukozy w postaci monoesterów (który określa się poniżej jako fosforan skrobi) i fosforan w postaci fosfolipidów związanych ze skrobią. [000] Stężenie fosforanów w skrobi zmienia się w zależności od typu rośliny. Zatem pewne mutanty kukurydzy syntetyzują skrobię o zwiększonym stężeniu fosforanów skrobi (kukurydza woskowa 0,002% oraz kukurydza o wysokiej zawartości amylozy 0,013%), podczas gdy tradycyjne gatunki kukurydzy zawierają tylko śladowe ilości fosforanów skrobi. Niewielkie ilości fosforanów skrobi można również znaleźć w pszenicy (0,001%), natomiast nie stwierdzono fosforanów skrobi w owsie i sorgo. Podobnie, mniej fosforanów skrobi znajduje się w mutantach ryżu niż w tradycyjnych gatunkach ryżu (0,013%). Znaczne ilości fosforanów skrobi znaleziono w bulwach lub korzeniach spichrzowych roślin syntetyzujących skrobię, takich jak tapioka (0,008%), słodki ziemniak (0,011%), maranta (0,021%) i ziemniak (0,089%). Wymienione powyżej wartości procentowe zawartości fosforanu skrobi odnoszą się odpowiednio do suchej masy skrobi i zostały oznaczone przez Jane i in. (1996, Cereal Foods World 41 (11), ). [0006] Fosforan skrobi może występować w postaci monoesterów w pozycji C-2, C-3 i C-6 spolimeryzowanych monomerów glukozy (Takeda i Hizukuri, 1971, Starch/Stärke 23, ). Z rozmieszczenia fosforanu w skrobi syntetyzowanej przez rośliny ogólnie wynika, że około 30% do 40% reszt fosforanowych jest kowalencyjnie związanych w pozycji C-3, a około 60% do 70% reszt fosforanowych jest kowalencyjnie związanych w pozycji C-6 cząsteczki glukozy (Blennow i in., Int. J. of Biological Macromolecules 27, ). Blennow i in. (2000, Carbohydrate Polymers 41, ) oznaczyli stężenie fosforanu skrobi, który jest związany w pozycji C-6 cząsteczki glukozy, dla różnych rodzajów skro-

4 bi, takich jak skrobia ziemniaczana (pomiędzy 7,8 a 33, nmola na mg skrobi, w zależności od gatunku), skrobia z różnych gatunków Curcuma (pomiędzy 1,8 a 63 nmoli na mg), skrobia z tapioki (2, nmoli na mg skrobi), skrobia ryżowa (1,0 nmola na mg skrobi), skrobia fasoli mung (3, nmola na mg skrobi) i skrobia z sorgo (0,9 nmola na mg skrobi). Autorzy ci nie byli w stanie wykryć fosforanu skrobi związanego w pozycji C-6 w skrobi jęczmiennej i skrobi z różnych woskowych mutantów kukurydzy. Dotychczas nie stwierdzono związku pomiędzy genotypem rośliny a stężeniem fosforanu skrobi (Jane i in., 1996, Cereal Foods World 41 (11), ). Zatem obecnie nie jest możliwe wpływanie na stężenie fosforanu skrobi na drodze hodowli. [0007] Dotychczas opisano tylko jedno białko, które powoduje wprowadzenie wiązań kowalencyjnych pomiędzy resztami fosforanowymi a cząsteczkami glukozy skrobi. Białko to wykazuje aktywność enzymatyczną dikinazy alfa-glukan-woda (GWD, E.C.: ) (Ritte i in., 2002, PNAS 99, ), często oznaczone jest w literaturze naukowej jako R1 i jest związane z ziarnami skrobi w skrobi spichrzowej w bulwach ziemniaka (Loberth i in., 1998, Nature Biotechnology 16, ). W reakcji katalizowanej przez R1, alfa-1,4- glukanowe substancje wydzielone (skrobia), trifosforan adenozyny (ATP) i woda są przekształcane w produkty, fosforan glukanu (fosforan skrobi), monofosforan i monofosforan adenozyny. W tym samym czasie gamma fosforan reszty ATP zostaje przeniesiony na cząsteczkę wody, a beta fosforan reszty ATP zostaje przeniesiony na glukan (skrobia). In vitro R1 przenosi resztę beta-fosforanową z ATP w pozycję C-6 i C-3 cząsteczki glukozy alfa- 1,4-glukanów. Stosunek C-6 fosforanu do C-3 fosforanu osiągany w reakcji w warunkach in vitro odpowiada stosunkowi, który występuje w skrobi wyizolowanej z roślin (Ritte i in., 2002, PNAS 99, ). Ponieważ około 70% fosforanu skrobi obecnego w skrobi ziemniaczanej jest związane z monomerami glukozowymi skrobi w pozycji C-6, a około 30% w pozycji C-3, oznacza to, że R1 najlepiej fosforyluje pozycję C-6 cząsteczki glukozy. Ponadto dzięki zastosowaniu amylopektyny z kukurydzy wykazano, że, między innymi, R1 może fosforylować alfa-1,4-glukany, które jeszcze nie zawierają kowalencyjnie związanego fosforanu (Ritte i in., 2002, PNAS 99, ), a zatem R1 jest w stanie wprowadzić fosforan do alfa-1,4-glukanów de novo. [0008] Rośliny pszenicy o aktywności białek R1 zwiększonej przez nadekspresję genu R1 z ziemniaków opisano w WO Rośliny te syntetyzują skrobię ze znacznymi ilościami fosforanu skrobi w pozycji C-6 cząsteczki glukozy w porównaniu z odpowiednimi roślinami typu dzikiego, w których nie można wykryć fosforanu skrobi. [0009] Dotychczas nie opisano kolejnych białek katalizujących reakcje, które wprowadzają kowalencyjnie związane grup fosforanowych do skrobi. Nie są także znane enzymy, które

5 preferencyjnie wprowadzają grupy fosforanowe w pozycji C-3 i/lub pozycji C-2 cząsteczek glukozy w skrobi. Zatem poza wzrostem zawartości fosforanu skrobi w roślinach brak jest dostępnych sposobów specyficznego wpływania na fosforylację skrobi w roślinach, modyfikację rozmieszczenia fosforanu w skrobi syntetyzowanej przez rośliny, i/lub dalszego zwiększenia zawartości fosforanu skrobi. [00] Przedmiot niniejszego wynalazku jest zatem oparty na dostarczeniu modyfikowanych skrobi o zwiększonej zawartości fosforanów i/lub zmienionym rozmieszczeniu fosforanów, jak również komórek roślinnych i lub roślin, które syntetyzują taką modyfikowaną skrobię, a także sposobów i środków do wytwarzania wspomnianych roślin i/lub komórek roślinnych. [0011] Problem ten rozwiązują postacie opisane w zastrzeżeniach patentowych. [0012] Niniejszy wynalazek dotyczy genetycznie modyfikowanej komórki roślinnej lub genetycznie modyfikowanej rośliny, charakteryzujących się tym, że wykazują zwiększoną aktywność co najmniej jednego białka dikinazy [P-glukan]-woda i co najmniej jednego białka dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda w porównaniu z odpowiednimi komórkami roślinnymi typu dzikiego lub roślinami typu dzikiego, które nie zostały genetycznie zmodyfikowane, przy czym komórka roślinna lub roślina zawiera pierwszą obcą cząsteczkę kwasu nukleinowego, która nie występuje w odpowiedniej komórce roślinnej typu dzikiego lub roślinie typu dzikiego, kodującą białko dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda, oraz drugą obcą cząsteczkę kwasu nukleinowego, która nie występuje w odpowiedniej komórce roślinnej typu dzikiego lub roślinie typu dzikiego, kodującą białko dikinazę [P-glukan]-woda w genomie komórki roślinnej. [0013] Niniejszy wynalazek opisuje genetycznie modyfikowane komórki roślinne i rośliny, charakteryzujące się tym, że mają zwiększoną aktywność co najmniej jednego białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) i co najmniej jednego białka dikinazy [alfa-1,4- glukan]-woda (białka R1) w porównaniu z odpowiednimi komórkami roślinnymi typu dzikiego lub roślinami typu dzikiego, które nie zostały genetycznie zmodyfikowane. [0014] Niniejszy wynalazek opisuje komórkę roślinną lub roślinę, które są genetycznie zmodyfikowane, przy czym modyfikacja genetyczna prowadzi do wzrostu aktywności co najmniej jednego białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) oraz jednocześnie co najmniej jednego białka dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) w porównaniu z odpowiednimi komórkami roślinnymi typu dzikiego lub roślinami typu dzikiego, które nie zostały genetycznie zmodyfikowane. [001] W związku z niniejszym wynalazkiem, określenie komórka roślinna typu dzikiego oznacza, że opisane komórki roślinne zostały użyte jako materiał wyjściowy do wy-

6 tworzenia komórek roślinnych według wynalazku, tzn. ich informacja genetyczna, niezależnie od wprowadzonych modyfikacji genetycznych, odpowiada informacji genetycznej komórki roślinnej według wynalazku. [0016] W związku z niniejszym wynalazkiem, określenie roślina typu dzikiego oznacza, że opisane rośliny zostały wykorzystane jako materiał wyjściowy do wytworzenia roślin według wynalazku, tzn. ich informacja genetyczna, niezależnie od wprowadzonych modyfikacji genetycznych, odpowiada informacji rośliny według wynalazku. [0017] W związku z niniejszym wynalazkiem, określenie odpowiadające oznacza, że przy porównaniu kilku przedmiotów, opisywane przedmioty, które są porównywane ze sobą były utrzymywane w tych samych warunkach. W związku z niniejszym wynalazkiem, określenie odpowiadające w połączeniu z komórką roślinną typu dzikiego lub rośliną typu dzikiego w porównaniu z genetycznie zmodyfikowanymi komórkami roślinnymi lub roślinami oznacza, że komórki roślinne lub rośliny, które są porównywane ze sobą, zostały wyhodowane w takich samych warunkach uprawy i że wykazują taki sam wiek (uprawy). [0018] Tutaj, w ramach niniejszego wynalazku, określenie zwiększona aktywność co najmniej jednego białka OK1 oznacza wzrost ekspresji endogennych genów, które kodują białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białek OK1) i/lub wzrost ilości białka (białek) dikinazy [P-glukan]-woda (białek OK1) w komórkach i/lub wzrost aktywności enzymatycznej białka (białek) dikinazy [P-glukan]-woda (białek OK1) w komórkach. [0019] Tutaj, w ramach niniejszego wynalazku, określenie zwiększona aktywność co najmniej jednego białka (białek) dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) oznacza wzrost ekspresji endogennych genów, które kodują białka R1 i/lub wzrost ilości białka (białek) dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) w komórkach i/lub wzrost aktywności enzymatycznej białka (białek) dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) w komórkach. [0020] Wzrost ekspresji można, przykładowo, oznaczyć przez pomiar ilości transkryptów kodujących białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białka OK1) lub białko (białka) dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1). Można to wykonać z zastosowaniem analizy typu Northern blot lub RT-PCR. Tutaj wzrost korzystnie oznacza wzrost ilości transkryptów w porównaniu z odpowiadającymi komórkami, które nie zostały genetycznie zmodyfikowane co najmniej o 0%, w szczególności co najmniej o 70%, korzystnie co najmniej o 8%, a szczególnie korzystnie co najmniej o 0%. Wzrost ilości transkryptów kodujących białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) oznacza również, że rośliny lub komórki roślinne, które nie zawierają wykrywalnych ilości transkryptów kodujących białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1), po modyfikacji genetycznej według wynalazku zawierają wykrywalne ilości transkryptów kodujących białko (białka) di-

7 kinazę [P-glukan]-woda (białko OK1). Wzrost ilości transkryptów kodujących białko (białka) dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1) oznacza również, że rośliny lub komórki roślinne, które nie zawierają wykrywalnych ilości transkryptów kodujących białko (białka) dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1), po modyfikacji genetycznej według wynalazku zawierają wykrywalne ilości transkryptów kodujących [białko (białka) dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1). [0021] Wzrost ilości białka (białek) dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) lub białka (białek) dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1), który wywołuje zwiększoną aktywność tych białek w opisanych komórkach roślin, można przykładowo oznaczyć metodami immunologicznymi, takimi jak analiza Western Blot, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay; test immunoenzymatyczny) lub RIA (Radio Immune Assay; test radioimmunologiczny). Wzrost korzystnie oznacza tutaj zwiększenie ilości białka w porównaniu z odpowiadającymi komórkami, które nie zostały genetycznie zmodyfikowane co najmniej o 0%, w szczególności co najmniej o 70%, korzystnie co najmniej 8%, a szczególnie korzystnie co najmniej o 0%. Wzrost ilości białka OK1 oznacza również, że rośliny lub komórki roślinne, które nie zawierały wykrywalnej aktywności białka dikinazy [P-glukan]- woda (białka OK1), po modyfikacji genetycznej według wynalazku zawierają wykrywalne ilości białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1). Wzrost ilości białka dikinazy [alfa- 1,4-glukan]-woda (białka R1), oznacza również, że rośliny lub komórki roślinne, które nie wykazywały wykrywalnej aktywności białka dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1), po modyfikacji genetycznej według wynalazku zawierają wykrywalne ilości białka dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1). [0022] Sposoby wytwarzania przeciwciał, które reagują specyficznie z danym białkiem, tj. które wiążą się specyficznie z tym białkiem, są znane fachowcom (patrz, np. Lottspeich i Zorbas (red.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN ). Wytwarzanie takich przeciwciał jest oferowane jako usługa kontraktowa przez kilka firm (np. Eurogentec, Belgia). Możliwość wytwarzania przeciwciał, które reagują specyficznie z białkiem dikinazą [P-glukan]-woda (białkiem OK1) opisano szczegółowo poniżej (patrz Przykład ). Przeciwciało z zastosowaniem którego można oznaczyć wzrost ilości białka R1 metodami immunologicznymi opisano w Lorberth i in. (1998, Nature Biotechnology 16, ) oraz Ritte i in. (2000, Plant Journal 21, ). [0023] W ramach niniejszego wynalazku, określenie białko dikinazy [P-glukan]-woda (białko OK1) należy rozumieć jako oznaczające białko, które przenosi resztę fosforanową z ATP na skrobię, która jest już fosforylowana (P-skrobia). Skrobie wyizolowane z liści mutanta Arabidopsis thaliana sex1-3 nie zawierają wykrywalnych ilości kowalencyjnie

8 7 związanych reszt fosforanowych i nie są fosforylowane przez białko dikinazę [P-glukan]- woda (białko OK1), tj. białko dikinaza [P-glukan]-woda (białko OK1) według wynalazku wymaga jako substratu do przenoszenia dodatkowych reszt fosforanowych, skrobi, która jest już fosforylowana. Korzystnie reszta beta fosforanowa ATP jest przenoszona z białka OK1 na skrobię, a reszta gamma fosforanowa ATP jest przenoszona na wodę. Jako dodatkowy produkt reakcji podczas reakcji fosforylacji P-skrobi przeprowadzanej przez białko OK1 powstaje AMP (monofosforan adenozyny). Białko OK1 jest zatem nazywane dikinazą [fosforylowany alfa-glukan]-woda (dikinazą [P-glukan]-woda) lub dikinazą [fosforylowana skrobia]-woda. [0024] Zatem białko (białka) dikinaza [P-glukan]-woda (białka OK1) katalizuje reakcję według poniższego równania: P-glukan + ATP + H 2 O P-glukan-P + AMP + Pi [002] Korzystnie, dodatkowe monoestrowe wiązanie fosforanowe w pozycji C-6 i lub pozycji C-3 cząsteczki glukozy P-skrobi jest tworzone na P-skrobi fosforylowanej przez białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1). Szczególnie korzystnie, podczas fosforylacji P-skrobi katalizowanej przez białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) w pozycji C-3 powstaje kilka dodatkowych monoestrowych wiązań fosforanowych w porównaniu monoestrowymi wiązaniami fosforanowymi w C-6 pozycji cząsteczki glukozy odpowiedniej P-skrobi. Sekwencje aminokwasowe kodujące białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białka OK1) zawierają domenę fosfohistydynową. Domeny fosfohistydynowe zostały, przykładowo, opisany przez Tien-Shin Yu i in. (2001, Plant Cell 13, ). Sekwencje aminokwasowe kodujące domeny fosfohistydynowe białka (białek) dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) korzystnie zawierają dwie histydyny. Podczas katalizowania reakcji fosforylacji P-skrobi przez białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1), fosforylowane białko (białka) dikinaza [P-glukan]-woda (białko OK1) powstaje jako produkt pośredni, przez który reszta fosforanowa ATP jest wiązana kowalencyjnie z aminokwasem białka (białek) dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1). Produkt pośredni jest tworzony przez autofosforylację białka (białek) dikinazy [Pglukan]-woda (białka OK1), tj. białko OK1 samo katalizuje reakcję, która prowadzi do powstania produktu pośredniego. Korzystnie, reszta histydyny sekwencji aminokwasowej kodującej białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) jest fosforylowana przez autofosforylację, szczególnie korzystnie jest to reszta histydyny, które jest częścią domeny fosfohistydynowej.

9 Ponadto, białko (białka) dikinaza [P-glukan]-woda (białka OK1) według wynalazku wykazują zwiększoną aktywność wiązania P-skrobi w porównaniu ze skrobią niefosforylowaną. [0026] Ponieważ jak dotychczas nie opisano enzymów, które wymagają P-skrobi jako substratu do dalszej jej fosforylacji, nie było możliwe do tej pory zwiększenie powyżej pewnego poziomu stężenia fosforanu skrobi w skrobi, która jest już fosforylowana w roślinach. Jest to tylko możliwe dzięki zastosowaniu białka według wynalazku lub cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku do modyfikacji genetycznej roślin. Wyjaśnienie funkcji białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1), a wraz z tym wytworzenie białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) oznacza, że tylko rośliny, które syntezują skrobię o zmodyfikowanych cechach mogą być w tym celu genetycznie zmodyfikowane. Zmiany w rozmieszczenia fosforanu skrobi syntetyzowanego przez rośliny dotychczas nie były możliwe z powodu braku dostępnych środków. Dzięki wytworzeniu białek według niniejszego wynalazku i kwasów nukleinowych według wynalazku, możliwe jest obecnie wprowadzenie zmian stosunku fosforanów w natywnej skrobi. Kolejną zaletą niniejszego wynalazku jest to, że w przypadku jednoczesnej współpracy białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) z białkiem dikinazą [alfa-1,4-glukan]-woda (białkiem R1) do skrobi włączane są większe ilości fosforanu niż w przypadku, gdy odpowiednie białka oddzielone od siebie w przestrzeni lub w czasie fosforylują odpowiednio skrobię lub P-skrobię. [0027] W ramach niniejszego wynalazku, określenie białko dikinaza [alfa-1,4-glukan]- woda (białko R1) należy rozumieć jako oznaczające białko, które przenosi resztę fosforanową z ATP na skrobię. Skrobie wyizolowane z liści mutanta Arabidopsis thaliana sex1-3 nie zawierają wykrywalnych ilości kowalencyjnie związanych reszt fosforanowych, ale są fosforylowane przez białko dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1). Oznacza to, że niefosforylowana skrobia, przykładowo wyizolowana z liścia mutanta Arabidopsis thaliana sex1-3 mutanta, jest wykorzystywana jako substrat w reakcji fosforylacji katalizowanej przez białko dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1 ). Korzystnie reszta beta fosforanowa ATP jest przenoszona z białka R1 na skrobię, a reszta gamma fosforanowa ATP jest przenoszona na wodę. AMP (monofosforan adenozyny) powstaje jako dodatkowy produkt reakcji. Białko R1 jest zatem nazywane dikinazą [alfa-1,4- glukan]-woda lub dikinazą skrobia-woda (E.C.: ; Ritte i in., 2002, PNAS 99, ). Podczas fosforylacji skrobi katalizowanej przez białko dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1), powstaje kilka dodatkowych monoestrowych wiązań fosforanowych w pozycji C-6 cząsteczki glukozy w porównaniu z monoestrowymi wiązaniami fosforanowymi w pozycji C-3 cząsteczki glukozy odpowiedniej skrobi. Białko dikinaza [alfa-1,4-glukan]-

10 woda (białko R1), wprowadza około 60% do 70% reszt fosforanowych w pozycji C-6 cząsteczki glukozy skrobi oraz około 30% do 40% reszt fosforanowych w pozycji C-3 cząsteczki glukozy skrobi (Ritte i in., 2002, PNAS 99, ). Podczas katalizy reakcji fosforylacji skrobi przez białko (białka) dikinazę [alfa-1,4- glukan]-woda (białko R1), fosforylowane białko R1 powstaje jako produkt pośredni, przez który reszta fosforanowa ATP jest wiązana kowalencyjnie z aminokwasem białka (białek) dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) (Ritte i in., 2002, PNAS 99, ). Produkt pośredni powstaje przez autofosforylację białka R1, tj. białko (białka) dikinaza [alfa- 1,4-glukan]-woda (białko R1) samo katalizuje reakcję, która prowadzi do powstania produktu pośredniego. Sekwencje aminokwasowe kodujące białko (białka) dikinazę [alfa-1,4- glukan]-woda (białka R1) zawierają domenę fosfohistydynową. Domeny fosfohistydynowe opisano, przykładowo w Tien-Shin Yu i in. (2001, Plant Cell 13, ). Sekwencje aminokwasowe kodujące domeny fosfohistydynowe białka (białek) dikinazy [alfa-1,4- glukan]-woda (białka R1) korzystnie zawierają jedną histydynę. Przez autofosforylację białka (białek) dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) fosforylowana jest reszta histydyny w domenie fosfohistydynowej sekwencji aminokwasowej kodującej białko (białka) dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1) (Mikkelsen i in., 2003, Biochemical Journal Intermediate Publication). Publikacja w październiku 2003, jako publikacja BJ ; Mikkelsen i in., 2004, Biochemical Journal 377, 2-32). Sekwencje kwasu nukleinowego i odpowiadające im sekwencje aminokwasowe kodujące białko (białka) dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1) opisano dla różnych gatunków takich jak ziemniak (WO , nr dostępu GenBank: AY02722, Y0933), pszenica (WO , US , nr dostępu GenBank: AAN93923, nr dostępu GenBank: AR23616), ryż (nr dostępu GenBank: AAR6144, nr dostępu GenBank: AR400814), kukurydza (nr dostępu GenBank: AAR61444, nr dostępu GenBank: AR400813), soja (nr dostępu GenBank: AAR61446, nr dostępu GenBank: AR40081), drzewo cytrusowe (nr dostępu GenBank: AY094062) i Arabidopsis (nr dostępu GenBank: AF312027). Określone sekwencje kwasów nukleinowych i sekwencje aminokwasowe kodujące białko (białka) dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) opublikowano między innymi w NCBI ( i są one formalnie włączone do opisu niniejszego zgłoszenia przez powołanie pozycji literaturowych. [0028] W związku z niniejszym wynalazkiem, określenie zwiększona aktywność wiązania należy rozumieć jako zwiększone powinowactwo białka względem pierwszego substratu w stosunku do drugiego substratu. Oznacza to, że ilość białka, które w takich samych warunkach inkubacji wiąże pierwszy substrat w większym stopniu w porównaniu z

11 drugim substratem, wykazuje zwiększoną aktywność wiązania z pierwszym substratem. [0029] W związku z niniejszym wynalazkiem, określenie fosforan skrobi należy rozumieć jako grupy fosforanowe związane kowalencyjnie z cząsteczkami glukozy skrobi. [0030] W związku z niniejszym wynalazkiem, określenie skrobia niefosforylowana należy rozumieć jako skrobię, która nie zawiera wykrywalnych ilości fosforanu skrobi. Opisano różne metody oznaczania ilości fosforanu skrobi. Korzystnie, metody opisane przez Ritte i in. (2000, Starch/Stärke 2, ) mogą zostać wykorzystywane do oznaczenia ilości fosforanu skrobi. Szczególnie korzystnie, oznaczenie ilości fosforanu skrobi przeprowadza się z zastosowaniem 31 P-NMR, zgodnie z metodami opisanymi przez Kasemusuwan i Jane (1996, Cereal Chemistry 73, ). [0031] W związku z niniejszym wynalazkiem, określenie fosforylowana skrobia lub P-skrobia należy rozumieć jako skrobię, która zawiera fosforan skrobi. [0032] Aktywność białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) można wykazać, przykładowo, przez w inkubację in vitro białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) z zastosowaniem ATP, który zawiera znakowaną resztę fosforanową (znakowany ATP) w pozycji beta. Korzystny jest ATP dla którego reszta fosforanowa jest specyficznie znakowana w pozycji beta, tj. taki dla którego tylko fosforan w pozycji beta niesie znacznik. Korzystnie stosuje się radioaktywnie znakowany ATP. Szczególnie korzystnie stosuje się ATP, dla którego reszta fosforanowa jest specyficznie znakowana radioaktywnie, a w szczególności korzystnie stosuje się ATP, dla którego reszta fosforanowa jest specyficznie znakowana 33 P w pozycji beta. Jeżeli inkubuje się białko dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) z znakowanym ATP i skrobiami, które nie są fosforylowane, fosforan nie jest przenoszony za pośrednictwem dikinazy [P-glukan]-woda (OK1) na skrobię. Korzystnie stosuje się skrobię z liści mutanta Arabidopsis thaliana sex 1-3 (Tien-Shin Yu i in., 2001, Plant Cell 13, ). [0033] Jednakże, jeśli białko dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) inkubuje się z P-skrobią w obecności znakowanego ATP, wtedy może zostać oznaczony znakowany fosforan kowalencyjnie związany z P-skrobią. Korzystnie stosuje się skrobię z liści Arabidopsis thaliana, szczególnie korzystnie skrobię fosforylowaną enzymatycznie przez białko dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1) z mutanta Arabidopsis thaliana sex1-3 (Ritte i in., 2002, PNAS 99, ). Znakowane reszty fosforanowe można uwidocznić jako związane przez białko dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) z P-skrobią, np. przez oddzielenie znakowanej P-skrobi (przykładowo przez wytrącenie z użyciem etanolu, filtrację, metodami chromatograficznymi, itp.) od reszty mieszaniny reakcyjnej, a następnie wykrycie znakowanej reszty fosfo-

12 ranowej we frakcji P-skrobi. Jednocześnie znakowane reszty fosforanowe związane z frakcją P-skrobi można uwidocznić, przykładowo, przez oznaczenie ilości radioaktywności występującej we frakcji P-skrobi (np. za pomocą licznika scyntylacyjnego). Metody, które można zastosować do wykrywania białka, dla którego wymagana jest P-skrobia jako substrat dla reakcji fosforylacji, dalej opisano poniżej w Metodach Ogólnych, punkt 11, oraz w przykładzie 6. [0034] Aktywność białka dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) można wykazać w sposób opisany w literaturze, przykładowo (Mikkelsen i in., 2003, Biochemical Journal Intermediate Publication. Publikacja w październiku 2003; jako publikacja BJ ; Mikkelsen i in., 2004, Biochemical Journal 377, 2-32, Ritte i in., 2002, PNAS 99, ). [003] Pozycje atomów węgla (C-2, C-3 i C-6) monomerów glukozy w P-skrobi, które są preferencyjnie fosforylowane przez białko dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) można oznaczyć, przykładowo, analizując P-skrobie fosforylowane przez białko, jak opisano w Ritte i in. (2002, PNAS 99, ). W tym celu, P-skrobię fosforylowaną przez białko hydrolizuje się za pomocą kwasu, a następnie analizuje metodą chromatografii anionowymiennej. Korzystnie, P-skrobię fosforylowaną przez białko dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) analizuje się metodą NMR w celu ustalenia, które pozycje atomów węgla (C-2, C-3 i C-6 ) monomerów glukozy w P-skrobi są fosforylowane. Szczególnie korzystną metodę identyfikacji pozycji atomów C cząsteczki glukozy w skrobi, które są fosforylowane z zastosowaniem reakcji katalizowanej przez białko dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) opisano poniżej w Metodach Ogólnych, punkt 13. [0036] Pozycje atomów węgla (C-2, C-3 i C-6) monomerów glukozy w skrobi, które są preferencyjnie fosforylowane przez białko dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1), można ustalić, przykładowo, analizując skrobie fosforylowane przez białko dikinazę [alfa- 1,4-glukan]-woda (białko R1), jak opisano w Ritte i in. (2002, PNAS 99, ). W tym celu, skrobię fosforylowaną przez białko hydrolizuje się za pomocą kwasu, a następnie analizuje metodą chromatografii anionowymiennej. [0037] Korzystnie, P-skrobię fosforylowaną przez białko dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) lub skrobię fosforylowaną przez białko dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1) analizuje się metodą NMR w celu określenia, które pozycje atomów węgla (C-2, C-3 i C- 6) monomerów glukozy w P-skrobi lub skrobi są fosforylowane. Szczególnie korzystną metodą identyfikacji pozycji atomów C cząsteczki glukozy w skrobi, które są fosforylowane drogą reakcji katalizowanej przez białko dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) lub

13 białko dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1) opisano poniżej w Metodach Ogólnych, punkt 13. [0038] Fosforylowane białko, które jest wytwarzane jako produkt pośredni w wyniku fosforylacji P-skrobi przez białko dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1), można wykazać dla białka dikinazy [alfa-1,4-glukan ]-woda (białka R1) jak opisano, przykładowo, w Ritte i in. (2002, PNAS 99, ) i Mikkelsen i in. (2003, Biochemical Journal Intermediate Publication. Publikacja w październiku 2003; jako publikacja BJ , Mikkelsen i in., 2004, Biochemical Journal 377, 2-32) [0039] W celu wykazania obecności autofosforylowanego produktu pośredniego, białko dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) najpierw inkubuje się bez skrobi ze znakowanym ATP, korzystnie z ATP specyficznie znakowanym w pozycji fosforanowej beta, szczególnie korzystnie z ATP specyficznie znakowanym 33 P w pozycji fosforanowej beta. Równolegle preparat reakcyjny 2, który zamiast znakowanego ATP zawiera odpowiednie ilości nieznakowanego ATP, inkubuje się w warunkach identycznych pod każdym innym względem. Następnie nieznakowany ATP dodaje się w nadmiarze do powyższej mieszaniny reakcyjnej 1, oraz mieszaninę nieznakowanego ATP i znakowanego ATP (taką samą ilość znakowanego ATP jaką wcześniej zastosowano w mieszaninie reakcyjnej 1 oraz taką samą ilość nieznakowanego ATP jaką dodano w nadmiarze do mieszaniny reakcyjnej 1) dodaje się do mieszaniny reakcyjnej 2 i dalej inkubuje się przed dodaniem P-skrobi do odpowiednio części A mieszaniny reakcyjnej 1 (Część 1A) lub do części A mieszaniny reakcyjnej 2 (Część 2A). Reakcję w pozostałych częściach 1B i 2B mieszanin reakcyjnych zatrzymuje się przez denaturację białka. Reakcję części B mieszaniny reakcyjnej można zatrzymać metodami znanymi fachowcom, które prowadzą do denaturacji białek, najlepiej przez dodanie laurylosiarczanu sodu (SDS). Części 1A i 2A mieszanin reakcyjnych inkubuje się przez co najmniej kolejnych minut przed zatrzymaniem również i tych reakcji. Skrobię obecną w częściach A i B odpowiednich mieszanin reakcyjnych oddziela się od reszty mieszaniny reakcyjnej. Jeśli odpowiednią skrobię oddziela się przykładowo przez wirowanie po zakończeniu wirowania, skrobia z odpowiednich części A lub B mieszaniny reakcyjnej znajduje się w osadzie, a białka odpowiedniej mieszaniny reakcyjnej znajdują się w supernatancie odpowiedniej odwirowanej próbki. Supernatant części odpowiednio 1A lub 2A, części odpowiednio 1B lub 2B mieszaniny reakcyjnej można następnie analizować metodą elektroforezy w żelu akryloamidowym w warunkach denaturujących, a następnie autoradiografii uzyskanego żelu akryloamidowego. W celu ilościowego oznaczenia radioaktywnie znakowanych białek, które zostały rozdzielone z zastosowaniem elektroforezy w żelu akryloamidowym, przykładowo można zastosować tzw. metodę fosfoobrazowania,

14 znaną fachowcom. Jeżeli autoradiografia lub analiza za pomocą aparatu Phospho-imager białek z supernatantu po odwirowaniu części B mieszaniny reakcyjnej 1 wykaże znacznie zwiększony sygnał w porównaniu z supernatantem po odwirowaniu części A mieszaniny reakcyjnej 1, wskazuje to, że białka pośredniczące w fosforylacji skrobi występują jako autofosforylowany produkt pośredni. Części A i B mieszaniny reakcyjnej 2 będą służyć jako kontrola, a zatem nie powinny wykazywać znacznego wzrostu sygnału w supernatancie po odwirowaniu w analizie autoradiograficznej lub w analizie za pomocą aparatu Phosphoimager. Ponadto, skrobię z odpowiednich części mieszanin reakcyjnych 1 i 2, pozostającą w odpowiednich osadach można zbadać, jeżeli jest to potrzebne, po kolejnych etapach przemycia poszczególnych skrobi, pod względem obecności fosforanu skrobi, który zawiera znacznik odpowiadający zastosowanemu znakowanemu ATP. Jeżeli skrobie w części A mieszaniny reakcyjnej 1 zawierają znakowane reszty fosforanowe oraz jeżeli autoradiografia supernatantu osadu po odwirowaniu części B mieszaniny reakcyjnej 1 wykaże znaczny wzrost sygnału autoradiograficznego w porównaniu z supernatantem po odwirowaniu części A mieszaniny reakcyjnej 1, oznacza to, że fosforylacja białka pośredniczącego w fosforylacji skrobi występuje w postaci autofosforylowanego produktu pośredniego. Części A i B mieszaniny reakcyjnej 2 służą jako kontrole i dlatego nie wykazują znacznego wzrostu sygnału alfa-1,4-glukanu znakowanego, przykładowo 33 P, w osadzie zawierającym alfa-1,4- glukany. Możliwe do stosowania sposoby wykazania fosforylacji produktu pośredniego białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) opisano poniżej w Metodach Ogólnych, punkt 12, oraz w Przykładzie 7. [0040] Fakt, że białko dikinaza [P-glukan]-woda (białko OK1) ma zwiększoną aktywność wiązania P-skrobi w porównaniu ze skrobią niefosforylowaną, można wykazać drogą inkubacji białka OK1 z P-skrobią i skrobią niefosforylowaną w oddzielnych preparatach. Wszystkie niefosforylowane skrobie są zasadniczo odpowiednie do inkubacji białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) ze skrobią niefosforylowaną. Korzystnie stosuje się niefosforylowaną skrobię roślinną, szczególnie korzystnie skrobię pszenną, a w szczególności korzystnie granulowaną skrobię z liści mutanta Arabidopsis thaliana sex1-3. Przykładowe metody izolowania skrobi z roślin są znane fachowcom. Wszystkie metody znane fachowcom są w zasadzie odpowiednie do izolowania niefosforylowanej skrobi z odpowiednich gatunków roślin. Korzystnie stosuje się opisane poniżej metody izolowania niefosforylowanej skrobi (patrz Metody Ogólne, punkt 2). [0041] Wszystkie skrobie, które zawierają fosforan skrobi są zasadniczo odpowiednie do inkubacji białek dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) z P-skrobią. Można w tym celu

15 zastosować także chemicznie fosforylowane skrobie. Korzystnie, do inkubacji z białkami dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) stosuje się P-skrobie, szczególnie korzystnie skrobie roślinne wcześniej fosforylowane enzymatycznie, w szczególności wcześniej fosforylowane enzymatycznie skrobie roślinne, które zostały wyizolowane z mutanta Arabidopsis thaliana sex-1. [0042] Aby wykazać zwiększoną aktywność wiązania białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) z P-skrobią w porównaniu ze skrobią niefosforylowaną, białka dikinazy [Pglukan]-woda (białka OK1) inkubuje się w oddzielnych preparatach z P-skrobią (Preparat A) i skrobią niefosforylowaną (Preparat B). Po zakończeniu inkubacji białka, które nie są związane z odpowiednimi skrobiami z Preparatów A i B oddziela się od skrobi i białek z nimi związanych. Następnie wiązanie pomiędzy białkami i P-skrobią w Preparacie A oraz wiązanie pomiędzy białkami i skrobią niefosforylowaną w Preparacie B usuwa się, tj. odpowiednie białka są rozpuszczane. Rozpuszczone białka z Preparatu A i Preparatu B można oddzielić od danych skrobi, które są obecne w odpowiednich preparatach. Następnie wyizolowane białka wiążące P-skrobię z Preparatu A i wyizolowane białka wiążące skrobię niefosforylowaną z Preparatu B można rozdzielić metodami znanymi fachowcom, takich jak, przykładowo, filtracja na żelu, metody chromatograficzne, elektroforeza w żelu akryloamidowym z SDS itp. Przez porównanie ilości białek wydzielonych z Preparatu A z ilościami odpowiednich białek wydzielonych z Preparatu B, można ustalić, czy białko wykazuje zwiększoną aktywność wiązania w stosunku do P-skrobi w porównaniu z skrobią niefosforylowaną. Metody, które można stosować do wykazania preferencyjnego wiązania przez białka P-skrobi w porównaniu ze skrobią niefosforylowaną, opisano poniżej w Przykładzie 8. [0043] Sekwencja aminokwasowa przedstawiona w SEQ ID NO 2 koduje białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) z Arabidopsis thaliana i sekwencja aminokwasowa przedstawiona w SEQ ID NO 4 koduje białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) z Oryza sativa. [0044] W kolejnej postaci niniejszego wynalazku, sekwencje aminokwasowe kodujące białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) wykazują co najmniej 60% identyczności z sekwencją wyszczególnioną w SEQ ID NO 2 lub SEQ ID NO 4, w szczególności co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 80%, szczególnie korzystnie co najmniej 90%, w szczególności korzystnie co najmniej 9%. [004] W kolejnej postaci niniejszego wynalazku, białko (białka) dikinaza [P-glukan]- woda (białko OK1) zawiera domenę fosfohistydynową. Sekwencje aminokwasowe kodujące białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białka OK1) zawierają domenę fosfohisty-

16 dynową, która wykazuje identyczność co najmniej 60% z sekwencją aminokwasową domeny fosfohistiydynowej białka (białek) dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) z Arabidopsis thaliana przedstawioną w SEQ ID NO, w szczególności co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 80%, szczególnie korzystnie co najmniej 90%, w szczególności korzystnie co najmniej 9%. [0046] Niniejszy wynalazek dotyczy genetycznie modyfikowanej komórki roślinnej według wynalazku lub genetycznie modyfikowanej rośliny według wynalazku, przy czym modyfikacja genetyczna polega na wprowadzeniu co najmniej jednej obcej cząsteczki kwasu nukleinowego do genomu komórki roślinnej lub do genomu rośliny. [0047] W tym kontekście określenie modyfikacja genetyczna oznacza wprowadzanie homologicznych i/lub heterologicznych obcych cząsteczek kwasu nukleinowego do genomu komórki roślinnej lub do genomu rośliny, przy czym wspomniane wprowadzenie tych cząsteczek prowadzi do zwiększenia aktywności białka (białek) dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) oraz zwiększenia aktywności białka dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1). Komórki roślinne według wynalazku lub rośliny według wynalazku są zmodyfikowane w odniesieniu do swojej informacji genetycznej przez wprowadzenie obcych cząsteczek kwasu nukleinowego. Obecność lub ekspresja obcych cząsteczek kwasu nukleinowego prowadzi do zmian fenotypowych. Tutaj zmiana fenotypowa oznacza korzystnie mierzalną zmianę jednej lub większej liczby funkcji komórek. Przykładowo, genetycznie modyfikowane komórki roślinne według wynalazku i genetycznie modyfikowane rośliny według wynalazku wykazują zwiększenie aktywności białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) oraz zwiększenie aktywności białka dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) ze względu na obecność lub ekspresję wprowadzonej cząsteczki kwasu nukleinowego. [0048] W związku z niniejszym wynalazkiem, określenie obca cząsteczka kwasu nukleinowego należy rozumieć jako oznaczające taką cząsteczkę, która nie występuje naturalnie w odpowiednich komórkach roślinnych typu dzikiego lub która nie występuje naturalnie w danym układzie przestrzennym w komórkach roślinnych typu dzikiego lub która jest umiejscowiona w takim miejscu w genomie komórki roślinnej typu dzikiego, w którym nie występuje ona naturalnie. Korzystnie obca cząsteczka kwasu nukleinowego jest cząsteczką rekombinowaną, która składa się z różnych elementów, których połączenie lub specyficzny układ przestrzenny nie występuje naturalnie w komórkach roślinnych. [0049] W związku z niniejszym wynalazkiem, określenie genom należy rozumieć jako całość materiału genetycznego obecnego w komórce roślinnej. Fachowiec zdaje sobie sprawę, że zarówno jądro komórkowe, jak i pozostałe kompartmenty (np. plastydy, mitochondria) zawierają materiał genetyczny.

17 [000] W kolejnej postaci, komórki roślinne według wynalazku i rośliny według wynalazku charakteryzują się tym, że jedna obca cząsteczka kwasu nukleinowego koduje białko dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1), najlepiej białko dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) z Arabidopsis thaliana lub białko dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) z Oryza sativa. [001] W kolejnej postaci, obca cząsteczka kwasu nukleinowego koduje białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQ ID NO 2 lub SEQ ID NO 4. [002] W kolejnej postaci, komórki roślinne według wynalazku i rośliny według wynalazku charakteryzują się tym, że jedna obca cząsteczka kwasu nukleinowego koduje białko (białka) dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1), najlepiej białko (białka) dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1) z ziemniaka lub białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) z Oryza sativa. [003] W kolejnej postaci, obca cząsteczka kwasu nukleinowego koduje białko R1 z ziemniaka o sekwencji aminokwasowej przedstawionej pod nr dostępu GenBank: (22-Jul-2003 Rel Y , ostatnia aktualizacja, wersja 2). Cząsteczki kwasu nukleinowego i sekwencje aminokwasowe kodujące białko (białka) dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1) z ziemniaka (Nr dostępu GenBank: Y0933) formalnie włączono do opisu niniejszego zgłoszenia przez powołaanie. [004] W kolejnej postaci, komórki roślinne według wynalazku i rośliny według wynalazku charakteryzują się tym, że pierwsza obca cząsteczka kwasu nukleinowego koduje białko (białka) dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1), a druga obca cząsteczka kwasu nukleinowego koduje białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1). [00] Obce cząsteczki kwasu nukleinowego złożone do genetycznej modyfikacji komórki roślinnej lub rośliny może stanowić pojedyncza cząsteczka kwasu nukleinowego lub kilka cząsteczek kwasu nukleinowego. Mogą one zatem być cząsteczkami kwasu nukleinowego, które zawierają sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białko (białka) dikinazę [Pglukan]-woda (białka OK1) i sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białko (białka) dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1), jak również cząsteczkami kwasu nukleinowego, w przypadku których sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białka OK1) i sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białko (białka) dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) występują w różnych cząsteczkach kwasu nukleinowego. Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białko (białka) dikinazę [P-glukan]-woda (białko OK1) i sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białko (białka) dikinazę [alfa-1,4-glukan]-woda (białko R1) mogą być zawarte jednocześnie, przykłado-

18 wo, w wektorze, plazmidzie lub liniowych cząsteczkach kwasu nukleinowego albo mogą być składnikami dwóch wektorów, plazmidów lub liniowych cząsteczek kwasu nukleinowego odpowiednio oddzielonych od siebie. [006] Jeśli sekwencje kwasu nukleinowego białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) i sekwencje kwasu nukleinowego białka dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) występują w dwóch oddzielonych od siebie cząsteczkach kwasu nukleinowego, mogą zostać wprowadzone równocześnie ( kotransformacja ) lub też jedna po drugiej, tzn. kolejno ( supertransformacja ) do genomu komórek roślinnych lub rośliny. Cząsteczki kwasu nukleinowego oddzielone od siebie można wprowadzać do różnych pojedynczych komórek roślinnych lub roślin danego gatunku. W ten sposób można wytworzyć komórki roślinne lub rośliny, w których zwiększona jest aktywność co najmniej jednego białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) lub co najmniej jednego białka dikinazy [alfa-1,4- glukan]-woda (białka R1). Takie rośliny można wytworzyć przez późniejsze skrzyżowanie roślin, w których zwiększona jest aktywność białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1), z roślinami, w których zwiększona jest aktywność białka dikinazy [alfa-1,4- glukan]-woda (białka R1). [007] Ponadto, zmutowaną komórkę lub mutanta, które charakteryzują się tym, że mają już zwiększoną aktywność białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) lub zwiększoną aktywność białka dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) można zastosować zamiast komórki roślinnej typu dzikiego lub rośliny typu dzikiego do wprowadzenia obcej cząsteczki kwasu nukleinowego. Mutanty mogą być mutantami występującymi spontanicznie (naturalnie), jak również takimi, które wytworzono przez ukierunkowane zastosowanie mutagenów (takich jak, przykładowo, środki chemiczne, promieniowanie jonizujące) lub metodami inżynierii genetycznej (przykładowo drogą aktywacji transkrypcyjnej T-DNA, aktywacji transkrypcyjnej z zastosowaniem transpozonu, aktywacji in situ, mutagenezy in vivo). Zatem komórki roślinne według wynalazku i rośliny według wynalazku można również wytworzyć przez wprowadzenie obcej cząsteczki kwasu nukleinowego, co prowadzi do zwiększenia aktywności białka dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) w zmutowanej komórce lub mutancie, które już mają zwiększoną aktywność białka dikinazy [P-glukan]- woda (białka OK1). Komórki roślinne według wynalazku lub rośliny według wynalazku mogą zostać również wytworzone przez wprowadzenie obcej cząsteczki kwasu nukleinowego, co prowadzi do zwiększenia aktywności białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) w zmutowanej komórce lub mutancie, które już mają zwiększoną aktywność białka dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1).

19 Można również wytworzyć komórki roślinne według wynalazku lub rośliny według wynalazku, gdzie mutant, w którym zwiększona jest aktywność białka dikinazy [P-glukan]- woda (białka OK1) krzyżuje się z rośliną, która ma zwiększoną aktywność białka dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) przez wprowadzenie obcej cząsteczki kwasu nukleinowego. Podobnie, można wytworzyć komórki roślinne według wynalazku lub rośliny według wynalazku, gdzie mutant, w którym zwiększona jest aktywność białka dikinazy [alfa-1,4-glukan]-woda (białka R1) krzyżuje się z rośliną, która ma zwiększoną aktywność białka dikinazy [P-glukan]-woda (białka OK1) przez wprowadzenie obcej cząsteczki kwasu nukleinowego. [008] Dostępnych jest wiele technik, które pozwalają wprowadzać DNA do roślinnej komórki gospodarza. Techniki te obejmują transformację komórek roślinnych za pomocą T-DNA z zastosowaniem Agrobacterium tumefaciens lub Agrobacterium rhizogenes jako nośnika do transformacji, fuzję protoplastów, iniekcję, elektroporację DNA, wprowadzenie DNA z zastosowaniem strzelby genowej, jak również inne techniki. Zastosowanie transformacji komórek roślinnych za pomocą Agrobacterium zostało obszernie zbadane i odpowiednio opisane w EP12016; Hoekema, w: Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam (198), rozdział V; Fraley i in., Crit. Rev Plant Sci. 4, 1-46 oraz An i in. EMBO J. 4, (198), Transformacja ziemniaka, patrz, przykładowo Rocha-Sosa i in., EMBO J. 8, (1989), [009] Transformacja roślin jednoliściennych za pomocą wektorów opartych na transformacji Agrobacterium została również opisana (Chan i in., Plant Mol. Biol. 22 (1993), ; Hiei i in., Plant J. 6, (1994 ) ; Deng i in., Science in China 33, (1990), 28-34; Wilminutk i in., Plant Cell Reports 11 (1992), 76-80; May i in., Bio/Technology 13, (199), ; Conner i Domisse, Int. J. Plant Sci. 13 (1992), 0-; Ritchie i in., Transgenic Res. 2, (1993), 22-26). Innym systemem transformacji roślin jednoliściennych jest transformacja z zastosowaniem strzelby genowej (WAN i Lemaux, Plant Physiol. 4, (1994), 37-48; Wasyl i in., Bio/Technology 11 (1993), 13-18; Ritala i in., Plant Mol. Biol. 24 (1994), ; Spencer i in., Teor. Appl. Genet. 79, (1990), ), transformacja protoplastów, elektroporacja komórek częściowo permeabilizowanych i wprowadzenie DNA za pomocą włókien szklanych. W szczególności, transformację kukurydzy wielokrotnie opisano w literaturze (porównaj, np., WO9/06128, EP013849, EP04687, EP029243; Fromm i in., Biotechnology 8, (1990), ; Gordon-Kamm i in., Plant Cell 2, (1990), ; Koziel i in., Biotechnology 11 (1993), ; Moroc i in., Teor. Appl. Genet. 80, (1990), ). Skuteczną transformację innych rodzajów zbóż również opisano, przykładowo dla jęczmienia (WAN i Lemaux, patrz powyżej; Ritala