Metody chromatograficzne w chemii i biotechnologii, wykład 3. Łukasz Berlicki

Transkrypt

1 Metody chromatograficzne w chemii i biotechnologii, wykład 3 Łukasz Berlicki

2 Rozdział chromatograficzny Przepływ Faza ruchoma mieszanina Faza stacjonarna

3 Chromatografia cieczowa adsorbcyjna Faza stacjonarna: Ciało stałe -> chromatografia adsorbcyjna Faza ruchoma: Ciecz -> chromatografia cieczowa

4 Układy chromatograficzne Układ faz normalnych (normal phase): Faza stacjonarna jest bardziej polarna niż faza ruchoma Układ faz odwróconych (reverse phase): Faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma

5 Układ faz normalnych Faza stacjonarna: Sole nieorganiczne: krzemian magnezu, węglan magnezu, węglan wapnia Tlenki nieorganiczne: tlenek krzemu - żel krzemionkowy, krzemionka, tlenek glinu alumina, tlenek cyrkonu, tlenek tytanu, tlenek magnezu

6 Żel krzemionkowy Otrzymywanie Z wodnego roztworu krzemianu sodu Na 2 SiO 3 + HCl SiO 2 * H 2 O + NaCl Z alkoholanu krzemu Si(OEt) 4 + EtOH + NH 4 OH SiO 2 * H 2 O

7 Żel krzemionkowy Zalety Bardzo popularny Najtańszy Szerokie zastosowanie Wady Wrażliwy na wysokie ph (ph>8) Wrażliwy na wysokie stężenia alkoholu lub wodę

8 Żel krzemionkowy Struktura

9 Żel krzemionkowy Powierzchnia

10 Żel krzemionkowy porowatość 50 %; S = 150 m 2 /g porowatość 70%; S = 300 m 2 /g

11 Żel krzemionkowy Skala mesh liczba oczek w sicie na cal bieżący 230 mesh = 63 mm 70 mesh = 200 mm

12 Żel krzemionkowy Kolumny do chromatografii Flash Wielkość ziarna: 15, mm Wielkość porów: 60 Å Powierzchnia: 500 m 2 /g Stabilność ph: Ciśnienie do 22 bar

13 Żel krzemionkowy Kolumny do HPLC: Nazwa Producent wielkość ziarna Wielkość porów Powierzchnia (μm) (Å) (m 2 /g) ACE ACT 3, 5, Chromolith Merck Cosmosil Nacalai Tesque 3, Exsil Grace Davison 3, 5, Genesis Thermo Scientific 4, 7, Hypersil GOLD Silica Thermo Scientific 1.9, 3, Inertsil GL Sciences 3, Kromasil Eka Chemicals 1 3.5, 5, 7, 10 60, , 320 LiChrosorb Merck 5, 10 60, , 300 LiChrospher Merck 5 60, , 400 NUCLEODUR - Macherey-Nagel 3, 5, NUCLEOSIL Macherey-Nagel 3, 5, , , 200

14 Żel krzemionkowy Wielkość ziarna - ciśnienie p = f u xηl πr 2 d p 2 f czynnik opisujący kształt ziaren h lepkość r promień kolumny

15 Kolumny monolityczne Jednorodne kawałki żelu krzemionkowego Makropory 2 mm Mezopory 13 nm Powierzchnia ok. 300 m 2 /g Porowatość 80%

16 Kolumny monolityczne

17 Kolumny monolityczne

18 Kolumny monolityczne Zalety: Zwiększona przepuszczalność dla rozpuszczalników Mniejsza wysokość półki teoretycznej Selektywność podobna do pakowanych kolumn Możliwe wyższe przepływy

19 Żel krzemionkowy

20 Żel krzemionkowy Substancja rozdzielana wymienia cząsteczki rozpuszczalnika na powierzchni krzemionki Siła elucji zależy od zdolności rozpuszczalnika do tworzenia wiązań wodorowych (z krzemionką)

21 Rozpuszczalniki odpowiednia lepkość, kompatybilność z detektorem, dostępność o czystości wymaganej w chromatografii, mała toksyczność, niski koszt, brak reaktywności z fazą stacjonarną i analitami.

22 Rozpuszczalniki Rozpuszczalniki można uporządkować zgodnie z ich siłą elucji, która wyrażona jest parametrem e 0 Siła elucji charakteryzuje energię oddziaływania rozpuszczalnika z faza stacjonarną e 0 = 0 przyjęto dla oddziaływania pentanu z adsorbentem Siła elucji jest proporcjonalna do polarności rozpuszczalnika Siła elucji zależy od adsorbentu: ε 0 (SiO 2 ) = 0.77*ε 0 (Al 2 O 3 ) ε 0 (MgO) = 0.58*ε 0 (Al 2 O 3 )

23 Rozpuszczalniki

24 Rozpuszczalniki Mieszaniny rozpuszczalników o sile elucji e 0 = 0.4 na żelu krzemionkowym: 40 % tetrahydrofuranu w heksanie, 50 % octanu etylu w heksanie, 15 % izopropanolu w heksanie, 50 % octanu etylu dichlorometanie.

25 Rozpuszczalniki Współczynnik retencji jest zależny od składu fazy ruchomej: log k = c - n log (% B) %B zawartość rozpuszczalnika bardziej polarnego Im więcej składnika polarnego tym mniejszy współczynnik retencji.

26 Żel krzemionkowy Przykłady Który związek będzie eluowany pierwszy w układzie faz normalnych: A) kwas benzoesowy i bezoesan metylu B) alkohol benzylowy i eter benzylowo-metylowy C) o-nitrofenol i p-nitrofenol

27 Modyfikowany żel krzemionkowy

28 Modyfikowany żel krzemionkowy Związana faza stacjonarna

29 Modyfikowany żel krzemionkowy Pochodne z grupami metylowymi są wrażliwe na niskie ph Grupy izobutylowe zwiększają stabilność w niskim ph

30 Modyfikowany żel krzemionkowy Podwójne przyłączenie grup siloksanowych powoduje ich stabilność w zakresie ph

31 Układ faz odwróconych Faza ruchoma jest bardziej polarna niż faza stacjonarna Najbardziej typowym przykładem fazy stacjonarnej jest C18

32 Układ faz odwróconych Modyfikacje żelu krzemionkowego Rodzaj modyfikacji Grupa funkcyjna Skrót n-alkany -CH 2 CH 3 C2 -CH 2 (CH 2 ) 2 CH 3 -CH 2 (CH 2 ) 6 CH 3 -CH 2 (CH 2 ) 16 CH 3 C4 C8 C18 fenyl -CH 2 (CH 2 ) n C 6 H 5 Fenylowa cyjanopropyl -CH 2 (CH 2 ) 2 CN cyjanowa perfluoroalkan -CH 2 (CF 2 ) n CF 3 amid -CH 2 (CH 2 ) 2 NHCO(CH 2 ) n CH 3

33 Układ faz odwróconych Sposób otrzymywania modyfikowanego żelu krzemionkowego ma bardzo duży wpływ na retencję Współczynniki retencji toluenu i etylobenzenu dla różnych faz C18.

34 Układ faz odwróconych Eluenty: woda i rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą Rozpuszczalnik Absorbcja światła [nm] Współczynnik załamania światła Lepkość Woda Metanol Acetonitryl tetrahydrofuran Temperatura wrzenia [ o C]

35 Układ faz odwróconych Najbardziej polarny rozpuszczalnik woda ma najmniejszą siłę elucji. (1) Metanol (2) Metanol/woda, 9/1 (3) Metanol/woda, 8/2 H(CH 2 ) n COOMe C n H 2n+2 PhC n H 2n+1

36 Układ faz odwróconych Używanie wody bez dodatku rozpuszczalnika organicznego może zaburzyć strukturę fazy stacjonarnej Typowo chromatografię prowadzi się od 10% AcCN do 90% AcCN

37 Układ faz odwróconych Substancje kwaśne lub zasadowe Równowaga kwasowo-zasadowa zaburza proces chromatograficzny k = k 0 + k K a H + K a H + k współczynnik retencji k 0 współczynnik retencji formy uprotonowanej (neutralnej) k 1 współczynnik retencji formy zjonizowanej K a stała dysocjacji kwasu

38 Układ faz odwróconych ph = kwas 2-nitrobenzoesowy 2 kwas ftalowy 3 * 4 kwas 2-fluorobenzoesowy 5 kwas 3-cyjanobenzoesowy 6 - kwas 2-chlorobenzoesowy 7 kwas 3-nitrobenzoesowy 8 kwas 3-fluorobenzoesowy 9 kwas 2,6-dimetylobenzoesowy ph = 3.0 ph = 3.5 ph = 4.0

39 Układ faz odwróconych Aby uniknąć problemów z równowagami kwasowozasadowymi do eluentów można dodać się silnego kwasu organicznego. Typowo 0.05% kwasu trifluorooctowego. pk a = 0.23

40 Podsumowanie Najczęściej stosowane fazy stacjonarne to: żel krzemionkowy i C18. W zależności od rodzaju substancji rozdzielanych można użyć układu faz normalnych lub odwróconych.