KATEDRA INŻYNIERII CHEMICZNEJ I PROCESOWEJ

Transkrypt

1 KATEDRA INŻYNIERII CHEMICZNEJ I PROCESOWEJ INSTRUKCJE ĆWICZEŃ LABORATORYJNYCH Ćwiczenie nr 2 Przedmiot: Techniki Rozdzielania Mieszanin Kierunek studiów: Biotechnologia, semestr VI, studiów I-go stopnia Opracowali: mgr inż. Anita Skrzypczak mgr inż. Joanna Głazowska Zatwierdził: prof. dr hab. inż. Marian Kamiński Gdańsk, 2014

2 Spis treści 1. Wprowadzenie Chromatografia w normalnych układach faz (NP) Fazy stacjonarne stosowane w NP Fazy ruchome w NP Mechanizm retencji w NP Chromatografia w układzie faz odwróconych Fazy stacjonarne stosowane w RP Fazy ruchome w RP Mechanizm retencji Chromatografia oddziaływań hydrofilowych (HILIC) Fazy stacjonarne w HILIC Fazy ruchome w HILIC Mechanizm retencji Test kolumny chromatograficznej Wymagania do sprawdzianu Przebieg ćwiczenia Wymagania do sprawozdania Literatura... 22

3 1. Wprowadzenie Chromatografia jest przede wszystkim techniką rozdzielania substancji. Po zastosowaniu detektora, spełniającego rolę przepływowego instrumentu pomiarowego staje się techniką analityczną. Szczególna zaletą chromatografii cieczowej jest ogromnie szeroki zakres uniwersalności, jako techniki rozdzielania. Można ją zastosować do analizy mieszanin prawie wszystkich substancji, zarówno lotnych i nielotnych, jak również termicznie trwałych i nietrwałych. 2. Chromatografia w normalnych układach faz (NP) Normalne układy faz (NP ang. Normal Phase) to układy chromatograficzne, w których faza stacjonarna wykazuje wyższą polarność, niż faza ruchoma Fazy stacjonarne stosowane w NP W normalnych układach faz możemy wyróżnić dwa najczęściej występujące rodzaje sorbentów stosowanych, jako fazy stacjonarne: tlenki nieorganiczne tj. żel krzemionkowy (tlenek krzemu), tlenek glinu, tlenek cyrkonu tlenek tytanu lub inne sole nieorganiczne: siarczan magnezu, fosforan wapnia, glinokrzemiany, sadzę grafitową. Drugą grupę stanowią sorbenty (najczęściej żel krzemionkowy, rzadziej tlenek cyrkonu, tytanu lub glinu) modyfikowane, których do powierzchni sorpcyjnej zostają przyłączone podstawniki zmniejszające polarność całkowitą sorbentu. Najczęściej używanymi modyfikatorami są związkami chemiczne, posiadającymi polarne grupy: aminową (NH 2 ), nitrową (NO 2 ), nitrylową (CN), diolową (R(OH) 2 ), amidową (RCONH 2 ); stosowane są również do specjalnych zastosowań cyklodekstryny. Żel krzemionkowy jest najczęściej stosowany, jako faza stacjonarna w normalnych układach faz chromatografii cieczowej. Wynika to z niskiej ceny żelu krzemionkowego, spowodowanej powszechną obecnością krzemu i jego związków w przyrodzie, wysokiej odporności mechanicznej (możliwość stosowania w warunkach wysokiego ciśnienia) oraz możliwość kontrolowania wielkości ziaren i porowatości wypełnienia, co wpływ na duży zakres zastosowań. Jednak bardzo poważną wadą żelu krzemionkowego jest brak odporności na wzrost wartości ph powyżej 7 (niska użyteczność do rozdzielania związków o charakterze zasadowym). Bardziej odporne na wysokie ph fazy ruchomej są fazy na bazie porowatego tlenku tytanu, cyrkonu bądź glinu (do ph 9,5).

4 Na aktywność i właściwości powierzchni adsorbentów nieorganicznych istotny wpływ mają metale, najczęściej żelaza, wapnia, kadmu, sodu, magnezu, potasu, występujące w ilościach na poziomie śladowych zawartości (0,1-10 ppm). Metale te mają bezpośredni wpływ na kwasowość powierzchni (wg teorii Lewisa) i w związku z tym dąży się do najwyższego stopnia ich usunięcia z powierzchni wypełnienia Fazy ruchome stosowane w NP W normalnych układach faz stosuje się niemieszające się z wodą rozpuszczalniki, jako pojedyncze ciecze oraz dwuskładnikowe mieszaniny, w których składniki różnią się polarnością i siłą elucyjną. W niektórych przypadkach stosuje się, jako dodatek do eluentu polarny składnik np. alkohol (metanol, etanol, propan-2-ol) lub tetrahydrofuran. Znajomość siły elucyjnej ułatwia dobór fazy ruchomej do rozdzielania mieszanin określonych substancji. Snyder uporządkował rozpuszczalniki stosowane w chromatografii adsorpcyjnej w kolejności siły elucyjnej, przypisując im określoną wartość, wyrażaną parametrem ε 0 (rys.1) oraz klasyfikuje rozpuszczalniki do określonych grup na podstawie wartości parametru polarności P, który jest sumą trzech składowych: właściwości protonoakceptorowych (x e ), protonodonorowych (x d ) i właściwości dipolowych (x n ). Wartość tego parametru charakteryzuje energię oddziaływań fazy ruchomej z powierzchnią adsorbentu. najprościej pojęcie siły elucyjnej jest określić, jako energię oddziaływania składników fazy ruchomej z centrami aktywnymi powierzchni fazy stacjonarnej (zgodnie z mechanizmem retencji charakteryzującym proces rozdzielania w normalnych układach faz opisanym poniżej) Wartości siły elucyjnej dla najczęściej stosowanych rozpuszczalników w chromatografii cieczowej przedstawiono w tabeli 1. Tabela 1. Wartości siły elucyjnej wybranych rozpuszczalników najczęściej stosowanych w chromatografii adsorpcyjnej. Rozpuszczalnik Siła elucyjna (ε 0 ) n-pentan 0,00 n-heksan 0,01 czterochlorek węgla 0,11 toluen 0,23 benzen 0,25 chloroform 0,26 dichlorometan 0,30

5 1,2-dichloroetan 0,32 tetrahydrofuran 0,44 eter tetrbutylowo-metylowy 0,48 aceton 0,50 propan-1-ol, propan-2-ol 0,55 pirydyna 0,55 acetonitryl 0,60 metanol 0,70 kwas octowy 0,91 woda 1,50 Inną miarą określającą przydatność rozpuszczalnika do rozdzielania określonych substancji jest selektywność. Selektywność można zdefiniować, jako zdolność rozpuszczalnika do selektywnego roztworzenia (a sorbentu do selektywnego zaadsorbowania) jednego składnika w porównaniu do drugiego, gdy polarności obu składników są takie same. Rys.1. Trójkąt selektywności rozpuszczalników wg. Snydera. Na podstawie parametru polarności P klasyfikacja rozpuszczalników do poszczególnych grup przedstawia się następująco: I. etery alifatyczne np. eter metylowo-t-butylowy II. alkohole alifatyczne np. metanol III. pochodne pirydyny, THF, sulfotlenki IV. glikole, kwas octowy, formamid V. dichlorometan, 1,2- dichloroetan, VI. a) ketony alifatyczne i estry, dioksan, b) nitryle np. acetonitryl

6 VII. VIII. węglowodory aromatyczne, chlorowane węglowodory aromatyczne, związki nitrowe, estry aromatyczne, toluen woda, chloroform 2.3. Mechanizm retencji w NP Do rozdzielnia związków chemicznych w normalnych układach faz, wykorzystywane są różnice w interakcjach polarnych grup funkcyjnych rozdzielanych składników z polarnymi centrami aktywnymi, obecnymi na powierzchni fazy stacjonarnej. Mechanizm retencji opisuje model Snydera-Soczewińskiego zakładający konkurencyjność oddziaływań między powierzchnią sorbentu (centrami aktywnymi), a cząsteczkami substancji rozdzielanych i cząsteczkami fazy ruchomej. Polarne cząsteczki rozdzielane oraz faza ruchoma współzawodniczą ze sobą o miejsce na powierzchni fazy stacjonarnej. Są to oddziaływania natury dyspersyjnej bądź słabe oddziaływania typu dipol-dipol i dotyczą one przede wszystkim cząsteczek małopolarnych lub niepolanrych. W tych warunkach retencja wzrasta, gdy spada polarność fazy ruchomej, a polarne anality wykazują większą retencję niż niepolarne. Należy pamiętać, że ze względu na duże powinowactwo, nawet niewielkie ilości wody w fazie ruchomej bądź próbce powodują dezaktywację powierzchni żelu krzemionkowego. W związku z tym należy, w przypadku chromatografii w układach faz normalnych, unikać obecności wody. 3. Chromatografia w odwróconych układach faz (RP) Odwrócone układy faz (ang. Reversed Phase- RP), to układy, w których faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma. Układy te stały się obecnie jednymi z najczęściej wykorzystywanych w analityce oraz zastosowaniach semi- i preparatywnych ze względu na stosunkowo dużą uniwersalność w porównaniu do faz normalnych; krótki czas kondycjonowania kolumny ( kilka objętości kolumny ); lepsza rozpuszczalność w fazie ruchomej składników polarnych; a także stosowanie wodnych faz ruchomych, co za tym idzie mniej toksycznych i tańszych Fazy stacjonarne stosowane w RP Fazy stacjonarne stosowane w odwróconych układach faz, w chromatografii cieczowej otrzymuje się najczęściej w wyniku reakcji powierzchniowych grup hydroksylowych żelu krzemionkowego z odpowiednimi silanami o ogólnym wzorze (R 1 R 2 )R 3 SiCl. Otrzymuje się

7 w wyniku tej modyfikacji sorbenty z monomeryczną fazą na powierzchni, typu Si-O-Si(R 1 R 2 )R 3. Grupy R 1 i R 2 to przeważnie grupy metylowe, natomiast o własnościach powierzchni otrzymanego sorbentu decyduje grupa R 3. Pozostałe grupy OH po modyfikacji usuwane są w reakcji z trimetylochlorosilanem (tzw. end-capping). Przykład reakcji otrzymywania fazy C 8 przedstawia rysunek 2. Przykładowe fazy stacjonarne stosowane w układach faz odwróconych przedstawia tabela 2. Rys. 2. Schemat otrzymywania żelu krzemionkowego modyfikowanego grupami C 8. Zalety żelu krzemionkowego, jako materiału do produkcji wypełnień kolumn w układach faz odwróconych to odporność mechaniczna, możliwość sterowania porowatością ziaren, dobra sprawność kolumn oraz stosunkowo niska cena. Ograniczeniem w stosowaniu wypełnień Si-O-SiR 3 (podobnie jak niemodyfikowanego żelu krzemionkowego) jest ograniczony zakres wartości ph w którym powierzchnia sorpcyjna wykazuje najwyższą aktywność od 2,5 do 7,5! Tabela 2. Fazy Stacjonarne stosowane w układach faz odwróconych na bazie żelu krzemionkowego. Rodzaj modyfikacji Grupa funkcyjna (R 3 ) Stosowany skrót n-alkanami -CH 2 CH 3 ; -CH 2 (CH 2 ) 2 CH 3 ; -CH 2 (CH 2 ) 4 CH 3 ; CH 2 (CH 2 ) 6 CH 3 ; -CH 2 (CH 2 ) 16 CH 3 ; C2 C4 C6 C8 C18 grupą fenylową -CH 2 (CH 2 ) x C 6 H 5 ; fenylowa propylonitrylowa lub podobną -CH 2 (CH 2 ) 2 CN; nitrylowa grupą perfluorową -CH 2 (CF 2 )xcf 3 ; fluoroalkanowa

8 grupą polarną, np amidową, karbaminianową, eterową -CH 2 (CH 2 ) 2 NHCO(CH 2 ) n CH 3 ; 3.2. Fazy ruchome stosowane w RP W chromatografii cieczowej w odwróconych układach faz eluent stanowi mieszanina wody lub odpowiedniej mieszaniny buforowej z rozpuszczalnikami organicznymi mieszającymi się w dowolnym stosunku z wodą. Najczęściej stosowane rozpuszczalniki organiczne to: metanol, acetonitryl, oraz rzadziej: izopropanol, tetrahydrofuran, aceton, metoksymetanol lub 2-metoksyetanol. Ze względu na hydrofobowy charakter faz stacjonarnych w odwróconych układach faz woda lub bufor o odpowiednim ph jest rozpuszczalnikiem o najsłabszej sile elucyjnej (praktycznie zero), przez co dodatek rozpuszczalnika organicznego do wody powoduje wzrost siły elucyjnej fazy ruchomej i spadek wartości współczynnika retencji. Faza ruchoma powinna być dobrana tak, aby współczynnik retencji mieścił się w zakresie od 1 do 10. Dodatek kwasu organicznego (najczęściej kwasu trifluorooctowego, octowego, mrówkowego, siarkowego, solnego lub ortofosforowego) do eluentu powoduje cofnięcie dysocjacji słabych lub średniomocnych kwasów nieorganicznych i organicznych, przez to zwiększenie ich hydrofobowości. Zaletą kwasów nieorganicznych (np. ortofosforowego) w stosunku do organicznych (np. trifluorooctowego, octowego) jest bardzo niski molowy współczynnik absorbcji w zakresie promieniowania nadfioletowego (niski cut-off). Z kolei kwasy organiczne dodane do fazy ruchomej powodują znaczne zwiększenie hydrofobowości polarnych związków organicznych, w wyniku ich solwatacji i tworzenia par jonowych, co korzystnie wpływa na sprawność i selektywność układu. Dodatkowo cechują się wyższą lotnością ( w stosunku do kwasów nieorganicznych), co umożliwia łatwiejsze połączenie takiego układu chromatograficznego ze spektrometrią mas. Ze względu na niepolarny charakter fazy stacjonarnej nie należy dopuścić do zastosowania fazy ruchomej o 100% składzie wody lub rozpuszczalnika organicznego. Prowadzi to do zmiany stopnia zwilżenia(z ang. dewetting) fazy stacjonarnej, co ma istotny wpływ na właściwości rozdzielcze takiej fazy. Dlatego też zaleca się stosowanie maksymalnie 97 %

9 stężenia danego składnika rozpuszczalnika w fazie ruchomej. Ilustrację obrazującą wpływ zastosowania 100% wody, jako fazy ruchomej przedstawia rysunek 3. Rys. 3. Ilustracja przedstawiająca zmianę konformacji hydrofobowej fazy stacjonarnej pod wpływem zastosowanej fazy ruchomej: (A) mieszanina metanol-woda, (B) 100 % woda. Związki chemiczne i wysokim stopniu hydrofobowości, tj.: witaminy rozpuszczalne w tłuszczach, lipidy, karotenoidy, polimery syntetyczne w konwencjonalnym układzie RP wykazują zbyt dużą retencję, przez co nie zostaną wyeluowane nawet przy zastosowaniu eluentu o składzie 100% acetonitrylu. Z tego powodu niezbędne jest zastosowanie w takim przypadku niewodnej fazy ruchomej, w której składnikiem A (tym o niższej sile elucyjnej) będzie acetonitryl lub metanol, a składnikiem B (o wyższej sile elucyjnej) tetrahydrofuran, aceton, propan-2-ol, chlorek metylenu, eter t-butylowo-metylowy itp. takie powstępowanie pozwoli na rozdzielenie mieszaniny z oczekiwanym stopniem selektywności oraz umożliwi elucję składników w rozsądnym czasie, tzn. ostatni eluowany składnik będzie się charakteryzował współczynnikiem retencji nie wyższym, niż 10. Należy pamiętać, że w każdym przypadku wybrany eluent powinien być dostosowany do wykorzystywanego detektora Mechanizm retencji Przeprowadzone do tej pory badania pozwoliły stwierdzić, iż retencja analitów opiera się głównie i jest wypadkową oddziaływań typu: Siły van der Waalsa pomiędzy hydrofobową fazą stacjonarną, a cząsteczkami analitów; Siły elektrostatyczne pomiędzy cząsteczkami substancji rozdzielanej, zawierającej polarne grupy funkcyjne a cząsteczkami fazy ruchomej. Siły van der Waalsa pomiędzy cząsteczkami substancji rozdzielanej i składnikami fazy ruchomej, Wiązania wodorowe pomiędzy cząsteczkami substancji rozdzielanej i składnikami fazy ruchomej. Rozdzielane cząsteczki, w przypadku większej hydrofobowości, niż składniki fazy ruchomej, wypychane są w kierunku niepolarnej fazy stacjonarnej, gdzie oddziałują z fazą stacjonarną. W zależności od budowy oraz obecności i ilości polarnych grup funkcyjnych w

10 strukturze rozdzielanych cząsteczek energia oddziaływań z fazą stacjonarną większa lub mniejsza, co w konsekwencji prowadzi do wzrostu, bądź spadku retencji. Siła oddziaływań pomiędzy fazą stacjonarną, a substancją rozdzielaną zależy od budowy, wielkości i właściwości fizykochemicznych rozdzielanych cząsteczek. W tym przypadku duże znaczenie ma długość łańcuchów węglowodorowych, którymi pokryta jest faza stacjonarna. Wraz ze wzrostem długości łańcuchów zwiększa się retencja rozdzielanych cząsteczek. Właściwość ta pozwala na rozdzielenie związków będących homologami strukturalnymi (np. węglowodorów aromatycznych). Retencja substancji rośnie ze wzrostem: Stopnia pokrycia powierzchni fazy stacjonarnej związaną fazą organiczną, Długości łańcucha fazy związanej, Hydrofobowości grupy funkcyjnej decydującej o charakterze powierzchni sorpcyjnej, Hydrofobowości substancji rozdzielanych, Zawartości wody w fazie ruchomej, Natomiast retencja substancji maleje ze spadkiem Temperatury, w której prowadzona jest separacja ph fazy ruchomej stosowanej do rozdzielania Na kolejność elucji wpływ mają przede wszystkim: Polarność substancji rozdzielanej (elucja od najbardziej polarnych do najmniej polarnych), Miejsca w szeregu homologicznych (od nisko- do wielkocząsteczkowych substancji). 4. Chromatografia oddziaływań hydrofilowych (HILIC) Chromatografia oddziaływań hydrofilowych (ang. Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography HILIC) to technika łącząca w sobie elementy chromatografii normalnych i odwróconych układów faz oraz wymiany jonowej (rysunek 4).

11 RP faza ruchoma IEx analit HILIC NP faza stacjonarna Rys. 4. Schemat przedstawiający zależności pomiędzy HILIC-, a NP-, RP-LC oraz chromatografią jonowymienną. Pierwsze doniesienie o zastosowaniu takiego układu ukazało się w 1975 roku, jednakże termin HILIC został wprowadzony dopiero wprowadził w 1990 przez A.J Aplert a. Jest to alternatywna technika do rozdzielania polarnych substancji, początkowo uważana za specjalny typ chromatografii adsorpcyjnej z wodnym eluentem wodne układy faz (ang. aqueous Normal Phase - anp) ) Fazy stacjonarne w HILIC Jako fazę stacjonarną w chromatografii oddziaływań hydrofilowych można wykorzystać każdą polarną fazę, jednakżee najczęściej wykorzystuje się żel krzemionkowy, a także żel krzemionkowy modyfikowanyy grupami aminowymi, amidowymi, cyjanowymi bądź grupami hydroksylowymi (faza stacjonarna typu diol) lub polarne polimery. Obecnie stosowanych jest wiele faz różniących się miedzy sobą strukturą i właściwościami (Tabela 3) ). Tabela 3. Zestawienie najpopularniejszych faz stacjonarnych stosowanych w HILIC. (Buszewski i in. 2012) Nazwa fazy stacjonarnej Struktura

12 Żel krzemionkowy niemodyfikowany Faza typu Diol Faza modyfikowana grupami nitrylowymi Faza modyfikowana grupami aminowymi Faza alkiloamidowa Faza mieszana Faza modyfikowana glikolem polietylenowym Faza cyklodekstrynami modyfikowana Faza typu ZIC-HILIC Ze względu na bardzo dużą różnorodność stosowanych faz stacjonarnych możliwe jest rozdzielanie bardzo szerokiej gamy związków o zróżnicowanych właściwościach fizykochemicznych. Nowopowstające fazy różnią się charakterystyką retencji

13 i selektywnością. Jednakże nie udało się jak do tej pory stworzyć fazy o podobnych właściwościach do tych stosowanych w chromatografii, w odwróconych układach faz. Ciekawą fazą stacjonarną jest tzw. ZIC-HILIC (ang. Zwitterionic - amfoteryczna) zbudowana z sulfobetainy przyłączonej do powierzchni nośnika (żel krzemionkowy lub polimer) posiadającej zarówno jon dodatki (grupa sulfonowa), jak i ujemny(ivrz. grupa aminowa). Złoże to charakteryzuje się oddziaływaniami jonowymi z rozdzielanymi substancjami oraz wodorowymi, poprzez silnie zaabsorbowaną na powierzchni wodę Fazy ruchome w HILIC W chromatografii oddziaływań hydrofilowych fazę ruchomą stanowią mieszaniny rozpuszczalników organicznych, takich jak: acetonitryl, metanol, etanol z wodą lub buforem. Stosowanie buforu ma wpływ na jonizację i polarność analitów, a także poprawia kształt pików oraz ogranicza ich ogonowanie (z ang. tailling). Stosowanie buforów jest zbędne w przypadku rozdzielania naturalnie polarnych analitów takich jak cukry. Dodatek soli do fazy ruchomej zawierającej wysoką zawartość składnika organicznego zwiększa polarność fazy ruchomej zmieniając jej właściwości rozdzielcze. Im większa zawartość wody w eluencie tym siła elucji fazy ruchomej wzrasta. W przypadku stosowania elucji gradientowej, podczas rozdzielania substancji z zastosowaniem chromatografii oddziaływań hydrofilowych, najczęściej rozpoczyna się program od 97% zawartości rozpuszczalnika organicznego (celem wytworzenia na powierzchni sorbentu dynamicznie generowanej warstwy wodnej), a następnie zwiększa się zawartość wody w fazie ruchomej, co umożliwia wyeluowanie wszystkich składników próbki z kolumny Mechanizm retencji W chromatografii oddziaływań hydrofilowych główną role odgrywają oddziaływania, występujące pomiędzy analitami, fazą ruchomą i fazą stacjonarną: Wiązania wodorowe tworzone pomiędzy wodorem związku będącego protonodonorem, atomem będącym protonoakceptorem, może tworzyć się wewnątrz jednej cząsteczki jak i pomiędzy dwoma różnymi cząsteczkami; Oddziaływania typu donor-akceptor tworzone pomiędzy parą cząsteczek, z których jedna jest donorem elektronu (zasadą Lewisa), a druga elektrono akceptorem (kwasem Lewisa); Oddziaływania typu jon-dipol, gdzie jon oddziaływuje z cząsteczką neutralną;

14 Oddziaływania typu dipol- dipol, oddziaływania pomiędzy dwoma neutralnymi cząsteczkami, których energia zależy od momentu dipolowego działających na siebie cząstek, polaryzowalności i stałej dielektrycznej, Oddziaływania typu dipol-dipol indukowany oddziaływanie pomiędzy cząsteczką posiadającą moment dipolowy a cząsteczką niepolarną Siły van der Waalsa słabe oddziaływania pomiędzy fragmentami lub cząsteczkami, zależne od odległości między cząsteczkami, nieprowadzące do trwałych połączeń; Oddziaływania hydrofobowe siły występujące w środowisku wodnym pomiędzy cząsteczkami o słabym powinowactwie do wody cząsteczkami hydrofobowymi. Ze względu na bardzo dużą ilość oddziaływań warunkujących rozdzielenie substancji w układach HILIC technika ta stwarza szerokie możliwości rozdzielania skomplikowanych mieszanin. Uważa się, że na powierzchni hydrofilowej fazy stacjonarnej tworzy się dynamicznie cienka warstwa wody zaadsorbowanej z eluentu, Jej grubość zależy od rodzaju fazy stacjonarnej oraz stężenia wody w fazie ruchomej. Warstwa ta pozwala polarnym analitom na podział pomiędzy hydrofilową warstwą wodną na powierzchni stacjonarnej, a mniej hydrofilowym rozpuszczalnikiem (np. acetonitrylem). Cząsteczki analitów modą oddziaływać z grupami funkcyjnymi fazy stacjonarnej lub rozdzielać się w zależności od polarności, na cząsteczki pozostające bardziej w fazie organicznej i te bardziej polarne dyfundujące w głąb wodnej warstewki. Trzeba brać pod uwagę także możliwość jonowych interakcji rozdzielanych cząsteczek z fazą stacjonarną. Kolejność elucji substancji może być częściowo odwrotna, niż w RP-HPLC tzn. hydrofilowe związki wykazują większą retencję niż związki hydrofobowe.

15 5. Test kolumny chromatograficznej W celu sprawdzenia poprawności naładowania kolumny oraz okresowej kontroli technicznej, wykonuje się rozdzielanie testowe, a na podstawie otrzymanego chromatogramu oblicza się charakterystyczne parametry. Pełny test kolumny powinien opisywać: sprawność kolumny (N), przepuszczalność kolumny (Φ), selektywność kolumny (k, α), asymetrię pików (As 0,1, lub / i As 0,5 ), impedancję rozdzielania (E), efekty poza-kolumnowego rozmycia stref ( ext), ocenę przydatności separacyjnej kolumny. Należy zapewnić reprezentatywność i dobrą odtwarzalność warunków testu, tzn., wybrać substancje zdolne charakteryzować różne cechy oddziaływań sorpcyjnych w kolumnie (charakteryzujące się zróżnicowaną energią oddziaływań, w tym - mogące, w konkretnych warunkach rozdzielania, być przyczyną asymetrii pików. Wraz z dozowaną mieszaniną wzorców konieczne jest zadozowanie składnika niewykazującego retencji na badanym złożu. Może to być odpowiedni związek chemiczny lub powietrze. Przykładowy Chromatogram testowy przedstawia rysunek 5. Do testowania kolumny powinno się wybrać: substancje łatwo rozdzielające się o prostej budowie cząsteczek, niskie stężenie substancji w mieszaninie testującej (w liniowym zakresie izotermy sorpcji), małą objętość dozowania (Vi <= 20µl, gdy dc=4 mm, Lc> 100 mm), warunki dobrej dynamiki układu detektor rejestrator.

16 Rys. 5. Schemat przedstawiający przykład chromatogramu testowego oraz sposób wyznaczenia najważniejszych parametrów kolumny. Mieszanina parabenów (metylowy, etylowy, propylowy), kolumna: LiChrospher RP x 4mm, 5m, 100Å, eluent: metanol:woda 6:4, objętościowe natężenie przepływu 1,5 ml/min, detekcja spektrofotometryczna w zakresie UV = 254 nm. 6. Wymagania do sprawdzianu Na sprawdzianie obowiązuje treść niniejszej instrukcji, jak również odpowiednie, związane z treścią instrukcji rozdziały książki*. Dodatkowo Student winien być zaznajomiony materiałem podstawowego kursu Inżynierii Chemicznej i Procesowej oraz Technologii Chemicznej. 7. Przebieg ćwiczenia Grupa laboratoryjna zostanie podzielona na trzy podgrupy. Każda z podgrup będzie samodzielnie wykonywać wybrany moduł ćwiczenia (A, B lub C). Każdy moduł składa się z dwóch części: 1) Test kolumny analitycznej

17 2) Rozdzielenie wskazanej mieszaniny/ekstraktu wraz z zebraniem odpowiednich frakcji za pomocą jednego z układów: NP, RP-HPLC lub NILIC. Każda podgrupa wykonuje test kolumny, na jakiej będzie wykonywane ćwiczenie w warunkach odpowiednich dla testu, wskazanych przez Prowadzącego. Wynikiem wykonanego testu jest chromatogram na podstawie, którego podgrupa wykonuje obliczenia wskazane w pkt. 5 niniejszej instrukcji. Studenci po krótkim wstępie i zapoznaniu z aparaturą wykonują samodzielnie wskazane rozdzielania oraz zbierają frakcje. Moduł A Zadaniem podgrupy jest uzyskanie chromatogramu rozdzielenia składników serwatki w warunkach RP-HPLC z zastosowaniem detektorów UV-Vis-DAD oraz elucji gradientowej, a także zebranie frakcji eluatu zawierającego będące obiektem zainteresowania białka serwatkowe. Warunki prowadzonego rozdzielania przedstawi Prowadzący. Zadaniem podgrupy jest zadozowanie wskazanej mieszaniny wzorców oraz próbki, a także zebranie odpowiedniej frakcji. Dobór w skali modelowej układu chromatograficznego do rozdzielania białek: - układ faz odwróconych (RP-HPLC) Materiały i Sprzęt Laboratoryjny Wzorzec α-laktoalbuminy, acetonitryl o czystości gradient grade, woda dejonizowana, probówki i fiolki szklane, pipeta automatyczna, strzykawka do HPLC z płaską igłą, naczynie na ścieki; Aparatura Aparat chromatograficzny typu HPLC: pompa z programowanym składem elucji, dozownik zaworowy, kolumna LiChrospher RP 18e (5μm) 250 x 4 mm, detektor UV-VIS lub UV typu DAD, integrator albo komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych. Warunki rozdzielania i detekcji W trakcie analizy roztworu wzorcowego α-laktoalbuminy jak i próbki serwatki warunki prowadzenia rozdzielania (oprócz programu składu elucji) powinny być stale i nie zmienne. Program elucji: A- acetonitryl, B- woda, 0 min.- A-3%, B-97%, 40 min. A-95%, B-5%. Natężenie przepływu fazy ruchomej powinno wynosić 1 ml/min., temperatura pokojowa, objętość próbki dozowanej do kolumny: 20 μl, długość fali detekcji: 280 nm;

18 Sposób wykonania: Warunki rozdzielania, detekcji i kalibracji 1) Ustawić w programie komputerowym początkowy oraz końcowy skład eluentu: A- acetonitryl, B- woda, 0 min.- A-3%, B-97%, 40 min. A-95%, B-5% oraz natężenie przepływu 1 ml/min. 2) Ustabilizować warunki rozdzielania (stabilna linia podstawowa detektora UV-VIS typu DAD, powierzchnia sorpcyjna kolumny zrównoważona z początkowym składem eluentu). 3) Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania wprowadzić do pętli zaworu dozującego o pojemności 20 µl, co najmniej 50 µl próbki w położenie load zaworu. Po stwierdzeniu gotowości systemu rejestracji i przetwarzania danych (komunikat ready for injection, znika ikona klepsydry - w przypadku stosowania komputerowego systemu rejestracji i przetwarzania danych), wprowadzić próbkę do kolumny ( zadozować, wstrzyknąć próbkę, przekręcić zawór w pozycję inject ). Obserwować przebieg rozdzielania, kontrolować prawidłowość pracy aparatu, zanotować warunki rozdzielania i detekcji oraz naszkicować schemat aparatu, a także wyjaśnić z prowadzącym ewentualne wątpliwości. 4) Po zarejestrowaniu chromatogramu, odczytać czas retencji poszczególnych pików. 5) W wyżej opisany sposób wykonać analizę chromatograficzną sporządzonego roztworu wzorca α-laktoalbuminy. Zarejestrować chromatogramy oraz odczytać czas retencji piku α-laktoalbuminy. 6) W identycznych jak wcześniej warunkach, które stosowano podczas analizy wzorca α- laktoalbuminy i w taki sam sposób, zadozować do kolumny roztwór próbki serwatki. 7) Zarejestrować chromatogram oraz odczytać czas retencji piku α-laktoalbuminy rozdzielonej od innych składników serwatki. Moduł B Zadaniem podgrupy jest uzyskanie chromatogramu rozdzielenia składników serwatki w warunkach HILIC z zastosowaniem detektorów UV-Vis-DAD oraz elucji gradientowej/izokratycznej, a także zebranie frakcji eluatu zawierających cukry oraz białka serwatkowe. Warunki prowadzonego rozdzielania przedstawi Prowadzący. Zadaniem

19 podgrupy jest zadozowanie wskazanej mieszaniny wzorców oraz próbki, a także zebranie odpowiedniej frakcji. Oznaczenie zawartości laktozy w serwatce za pomocą chromatografii oddziaływań hydrofilowych. Zebranie frakcji eluatu, bogatego w laktozę. Materiały i Sprzęt Laboratoryjny Wzorzec laktozy, acetonitryl o czystości do HPLC, woda dejonizowana, probówki i fiolki szklane, pipeta automatyczna, strzykawka do HPLC z płaską igłą, naczynie na ścieki; Aparatura Aparaty chromatograficzne typu HPLC: pompa, dozownik zaworowy, kolumna NH 2 (5μm) 250 x 4 mm, detektor refraktometryczny RI, detektor UV-VIS lub UV typu DAD, integrator albo komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych. Warunki rozdzielania i detekcji W trakcie analiz roztworów wzorcowych laktozy (otrzymanych od prowadzącego) jak i próbki serwatki warunki prowadzenia rozdzieleń powinny być stale i niezmienne. Skład eluentu - acetonitryl: woda 85:15, natężenie przepływu fazy ruchomej powinno wynosić 1ml/min., temperatura pokojowa, objętość próbki dozowanej do kolumny: 20 μl. Sposób wykonania: Warunki rozdzielania, detekcji i kalibracji 1) Ustawić skład eluent- acetonitryl: woda 85:15, natężenie przepływu fazy ruchomej 1 ml/min. 2) Ustabilizować warunki rozdzielania (stabilna linia podstawowa detektora RI oraz detektora UV-VIS typu DAD, powierzchnia sorpcyjna kolumny zrównoważona ze stosowanym eluentem). 3) Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania wprowadzić do pętli zaworu dozującego o pojemności 20 µl, co najmniej 50 µl próbki w położenie load zaworu. Po stwierdzeniu gotowości systemu rejestracji i przetwarzania danych (komunikat ready for injection i znikła ikona klepsydry, w przypadku stosowania komputerowego systemu rejestracji i przetwarzania danych), wprowadzić próbkę do kolumny ( zadozować wstrzyknąć próbkę, przekręcić zawór w pozycję inject ). Obserwować przebieg rozdzielania, kontrolować prawidłowość pracy aparatu,

20 zanotować warunki rozdzielania i detekcji oraz naszkicować schemat aparatu, a także wyjaśnić z prowadzącym ewentualne wątpliwości. 4) Po zarejestrowaniu chromatogramu, odczytać czas retencji i powierzchnie poszczególnych pików z detektora RI. 5) *W wyżej opisany sposób wykonać analizy chromatograficzne wszystkich sporządzonych roztworów kalibracyjnych laktozy. Zarejestrować chromatogramy i wyznaczyć powierzchnie pików laktozy dla poszczególnych roztworów kalibracyjnych. Wykonać krzywą kalibracyjną za pomocą programu Microsoft Exel, wyznaczyć równanie współczynniki a i b z równania y = ax + b 6) W identycznych jak wcześniej warunkach, które stosowano podczas wzorcowania i w taki sam sposób, zadozować roztwór próbki serwatki o nieznanym stężeniu laktozy 7) Zarejestrować chromatogram i odczytać powierzchnię piku oznaczanej laktozy w analizowanej próbce serwatki 8) Na postawie uzyskanej krzywej kalibracyjnej wyznaczyć zawartość laktozy w próbce serwatki wyrażonej w mg/l W celu uzyskania frakcji laktozy należy, w sposób podany powyżej zadozować próbkę serwatki, a następnie podczas rozdzielania, na podstawie wyznaczonego czasu retencji laktozy z próbek wzorcowych, zebrać, w odpowiednim czasie retencji, do przygotowanej fiolki eluat z kapilary wychodzącej z detektora. Moduł C Podgrupa, oprócz wykonania testu kolumny w warunkach układów faz normalnych, wykonuje rozdzielanie mieszaniny wzorców oraz próbki ekstraktu roślinnego. Warunki prowadzenia rozdzielania chromatograficznego podane zostaną przez prowadzącego. Podczas zajęć zastosowana zostanie detekcja UV-Vis-DAD. Materiały i Sprzęt Laboratoryjny Roztwory, ekstrakty metabolitów roślinnych, ekstrakty olejów jadanych, strzykawka do HPLC z płaską igłą, naczynie na ścieki; Aparatura

21 Aparat chromatograficzny typu HPLC: pompa z programowanym składem elucji, dozownik zaworowy, kolumna LiChrospher Si (5μm) 250 x 4 mm, detektor UV-VIS lub UV typu DAD, integrator albo komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych. Warunki rozdzielania i detekcji W trakcie rozdzielania ekstraktu chlorofili warunki prowadzenia rozdzielania (oprócz programu składu elucji) powinny być stale i nie zmienne. Faza ruchome: MTBE:nheksan:izopropanol 5:6:6 (v/v). Natężenie przepływu fazy ruchomej powinno wynosić 1 ml/min., temperatura pokojowa, objętość próbki dozowanej do kolumny: 20 μl; Sposób wykonania: Warunki rozdzielania, detekcji i kalibracji 1) Ustawić w programie komputerowym natężenie przepływu eluentu. 2) Ustabilizować warunki rozdzielania (stabilna linia podstawowa detektora UV-VIS typu DAD, powierzchnia sorpcyjna kolumny zrównoważona z początkowym składem eluentu). 3) Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania wprowadzić do pętli zaworu dozującego o pojemności 20 µl, co najmniej 50 µl próbki w położenie load zaworu. Po stwierdzeniu gotowości systemu rejestracji i przetwarzania danych (komunikat ready for injection, znika ikona klepsydry - w przypadku stosowania komputerowego systemu rejestracji i przetwarzania danych), wprowadzić próbkę do kolumny ( zadozować, wstrzyknąć próbkę, przekręcić zawór w pozycję inject ). Obserwować przebieg rozdzielania, kontrolować prawidłowość pracy aparatu, zanotować warunki rozdzielania i detekcji oraz naszkicować schemat aparatu, a także wyjaśnić z prowadzącym ewentualne wątpliwości. 4) Po zarejestrowaniu chromatogramu, odczytać czas retencji poszczególnych pików. 5) W wyżej opisany sposób wykonać analizę chromatograficzną pozostałych roztworów. 6) Zarejestrować chromatogram oraz odczytać czas retencji pików rozdzielonych chlorofili od innych składników ekstraktu.

22 8. Wymagania do sprawozdania Sprawozdanie grupy powinno składać się z strony tytułowej, trzech sprawozdań podgrup wykonanych, oraz wniosków końcowych, sformułowanych po wykonaniu poszczególnych sprawozdań, podsumowujących całe ćwiczenie. Każde sprawozdanie i jego części powinny być odręcznie podpisane przez autorów. Szczegółowe wytyczne i wskazówki dotyczące przygotowania sprawozdania znaleźć można na stronie domowej Katedry: zakładka: Dydaktyka/Przedmioty/Technologia Chemiczna/Techniki Rozdzielania/Wytyczne do sprawozdań.pdf ( 9. Literatura Snyder L.R., Kirkland J.J., Dolan J.W. Introduction to Modern Liquid Chromatography, Third Edition, Wiley Witkiewicz Z., Podstawy chromatografii, WNT-W-wa, wyd lub 2005; Linden JC, Lawhead CL J Chromatogr A 105 (1975) 125. Alpert A.J., J. Chromatogr. 499 (1990) 177 Buszewski B., Noga S. Anal Bioanal Chem 402 (2012) 231. *Kamiński M. (ed.) Chromatografia Cieczowa, CEEAM, Gdańsk, 2004