Folia Medica Lodziensia

Transkrypt

1 Folia Medica Lodziensia tom 31 zeszyt Piotr Sieroszewski SCHEMAT WYKRYWANIA WAD PŁODU W I POŁOWIE CIĄśY ZE SZCZEGÓLNYM UWZGLĘDNIENIEM ABERRACJI CHROMOSOMOWYCH PRACA HABILITACYJNA Instytut Ginekologii i PołoŜnictwa, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Dyrektor: Prof. dr hab. med. Jacek Suzin 2004

2 SPIS TREŚCI I. Wstęp... 3 I.1. Wrodzone wady rozwojowe - problematyka ogólna... 3 I.1.A Wprowadzenie I.1.B Systematyka wrodzonych wad rozwojowych... 4 I.2. Etiologia wrodzonych wad rozwojowych....5 I.2.A Uwarunkowania ogólne... 5 I.2.B Czynniki promocyjne wad rozwojowych... 5 I.2.C Mechanizmy specyficzne układowo w powstawaniu wad rozwojowych... 7 I.3. Aberracje chromosomowe jako przyczyna wad rozwojowych... 8 I.3.A Uwarunkowania ogólne....8 I.3.B Trisomia 21 pary chromosomów... 9 I.3.C Inne aneuploidie chromosomowe I.3.C.1 Trisomia 18 pary chromosomów I.3.C.2 Trisomia 13 pary chromosomów I.3.C.3 Triploidia I.4. Przegląd stosowanych przesiewowych metod diagnostycznych w prenatalnym rozpoznawaniu wad rozwojowych płodu I.4.A Badania inwazyjne I.4.B Oznaczenia biochemiczne markerów wad rozwojowych I.4.B.1 Test potrójny I.4.B.2 PAPP-A i b-hcg I.4.C Badania ultrasonograficzne w diagnostyce prenatalnej wad rozwojowych I.4.C.1 Zasady ogólne połoŝniczej diagnostyki ultrasonograficznej I.4.C.2 Zastosowanie ultrasonografii do prenatalnego wykrywania wad rozwojowych I.4.C.3 Fałd karkowy, przezierność karku płodu jako marker ultrasonograficzny wad rozwojowych I.4.C.4 Inne markery aneuploidii w badaniu ultrasonograficznym w I trymestrze ciąŝy I.4.C.5 Kość nosowa jako marker ultrasonograficzny wad rozwojowych płodu II. Cel pracy III. Materiał i metoda IV. Metoda statystyczna V. Wyniki VI. Dyskusja VII. Podsumowanie wyników przeprowadzonych badań VIII. Wnioski IX. Publikacje związane tematycznie z rozprawą habilitacyjną X. Piśmiennictwo XI. Tabele XII. Aneks XIII. Streszczenie XIV. Abstract

3 Folia Medica Lodziensia, 2004, 31:3-161 WPROWADZENIE SCHEMAT WYKRYWANIA WAD PŁODU W I POŁOWIE CIĄśY ZE SZCZEGÓLNYM UWZGLĘDNIENIEM ABERRACJI CHROMOSOMOWYCH PIOTR SIEROSZEWSKI STRESZCZENIE Rozwój medycyny dokonujący się od kilku dziesięcioleci spowodował zmianę przyczyn śmiertelności i zachorowalności okołoporodowej, noworodkowej i dziecięcej. Dominujące uprzednio czynniki etiologiczne, takie jak urazy około-porodowe, wrodzone infekcje, fetopatia cukrzycowa czy konflikt serologiczny zostały w znacznym stopniu ograniczone. Częstość występowania wrodzonych wad rozwojowych oraz chorób genetycznych utrzymuje się jednak nadal na jednakowym poziomie. Biorąc pod uwagę wady mnogie lub duŝe wady izolowane odsetek ich szacowany jest on na około 3%. Występowanie wad rozwojowych jest znacznie częstsze we wczesnym etapie rozwoju ciąŝy, ale ze względu na wiele ciąŝ kończących się niepomyślnie, częstość urodzeniowa wad jest niŝsza. W Polsce stworzono wysoce efektywny Polski Rejestr Wrodzonych Wad Rozwojowych gromadzący i analizujący przypadki nieprawidłowości płodu, noworodka i dziecka do 2 r.ŝ. w naszym kraju [Latos-Bieleńska'98]. Udział wad uwarunkowanych genetycznie wśród ogółu nieprawidłowości rozwojowych oceniany jest na około 30%. Mogą być one powodowane aberracjami chromosomowymi, mutacjami jednogenowymi lub dziedziczeniem wielogenowym. Wady strukturalne powstają na róŝnych etapach rozwoju osobniczego, a ich nasilenie i charakter związany jest z okresem w którym dochodzi do zadziałania czynnika teratogennego oraz czasu ekspozycji. W około 60% nie znana jest etiologia ich powstania, ale wiadomym jest jednocześnie, Ŝe istnieją róŝnorodne czynniki środowiskowe o działaniu teratogennym. Mnogie wady mogą sugerować występowanie zespołów których podłoŝem są mutacje pojedynczych genów lub aberracje chromosomowe. Ryzyko wystąpienia aberracji chromosomowej wzrasta wraz z wiekiem matki. Najczęściej występującą aberracją chromosomową jest zespół Downa czyli trisomia w 21 parze chromosomów (1/600-1/700 Ŝywych urodzeń). Opis charakterystycznego fenotypu osób z trisomią 21 opublikował w roku 1866 angielski lekarz Langdon Down. Dodatkowy autosom w 21 parze warunkuje charakterystyczne cechy twarzy, wady serca, niedorozwój umysłowy oraz zaburzenia budowy i funkcji tkanki łącznej. U noworodków z trisomią 21 częściej stwierdza się hipotrofię, wady serca, niedroŝność dwunastnicy. Trisomia 18 pary chromosomów czyli zespół Edwardsa występuje 1/3000 Ŝywych urodzeń.

4 U noworodków z trisomią 18 stwierdza się skrajną hipotrofię oraz liczne wady strukturalne szczególnie częste są cięŝkie wady serca. Tylko 10% dzieci doŝywa do 1 roku Ŝycia. Trisomia 13 pary chromosomów to zespół Patau, którego częstość jest obliczona na 1/5000 Ŝywo urodzonych noworodków. CięŜka hipotrofia, liczne wady strukturalne i charakterys-tyczne cechy fenotypowe, w tym powaŝne wady serca, małogłowie, małoocze, holoprozencephalia - to cechy charakterystyczne tej trisomii. Triploidia jest wadą letalną i Ŝywe porody zdarzają się niezmiernie rzadko. Noworodki z triploidią obarczone są licznymi wadami strukturalnymi. Badania inwazyjne: Pierwsze badania diagnostyczne zostały oparte na spostrzeŝeniu dotyczącym znacznie częstszego występowania zespołu Downa u starszych matek powyŝej 40-go roku Ŝycia (1909). Wprowadzenie ciągłej kontroli ultrasonograficznej podczas amniopunkcji radykalnie obniŝyło odsetek powikłań po zabiegu. Obecnie odsetek powaŝnych powikłań po zabiegu amniopunkcji w ośrodkach dysponujących doświadczeniem ocenia się na 0,5% (1/200). Uzyskane amniocyty poddawane są hodowli w celu oznaczenia kariotypu płodu, a ocena biochemiczna płynu owodniowego ma celu wykrywanie takich wad, jak otwarte wady ośrodkowego układu nerwowego oraz powłok jamy brzusznej płodu. Ryzyko populacyjne występowania trisomii 21 u kobiet cięŝarnych od 37 roku Ŝycia zaczyna przekraczać ryzyko wynikające z diagnostyki inwazyjnej. W krajach rozwiniętych, w tym w Polsce, ta grupa podwyŝszonego ryzyka obejmuje ok. 10% populacji cięŝarnych, co stanowi około 30% wszystkich ciąŝ z zespołem Downa. Oznaczenia biochemiczne: Jako pierwsze oznaczenie przesiewowe wprowadzono AFP (α-fetoproteinę), której stęŝenie we krwi cięŝarnej w przypadku otwartych wad OUN lub wad powłok jamy brzusznej jest znacznie podwyŝszone (pomiędzy 16 a 20 tygodniem ciąŝy). W 1988 roku Wald skorelował opisywane oznaczenia hormonalne w surowicy cięŝarnej z wiekiem matki ustanawiając nową metodę badań przesiewowych nazywaną powszechnie testem potrójnym (triple screen test). Obliczono Ŝe wykonywanie opisywanego testu potrójnego jako badania przesiewowego pozwala na wykrycie w całej populacji około 60% ciąŝ z zespołem Downa przy poziomie 5% wyników fałszywie dodatnich. W ostatnich latach w niektórych krajach Europy Zachodniej wprowadzono test diagnostyczny oparty na oznaczeniu białka PAPP-A i wolnej podjednostki β-hcg w I trymestrze ciąŝy. Na podstawie analizy kilku badań stwierdzono, Ŝe test PAPP-A+β- HCG przeprowadzany w I trymestrze ciąŝy odznacza się około 60% czułością przy 5% odsetku wyników fałszywie dodatnich. Jest to wartość analogiczna jak dla testu potrójnego wykonywanego na początku II trymestru ciąŝy. Zaletą oznaczenia PAPP-A + wolna β-hcg jest wcześniejsze uzyskanie wyniku w niŝ w przypadku AFP + HCG + ue3, ale wykrywa on jedynie aneuploidie chromosomowe (trisomia 21 i 18). Kolejnym minusem jest jak na razie wyŝszy koszt oznaczeń PAPP-A + b-hcg od masowo stosowanego testu potrójnego. Aktualnie systemy ochrony zdrowia np. USA i Wielkiej Brytanii uwzględniają jako metodę przesiewową test potrójny (takŝe dla otwartych wad OUN oraz powłok brzucha płodu).

5 Badania ultrasonograficzne: Diagnostyka opisywanych wad rozwojowych poczyniła w ciągu ostatnich 30 lat olbrzymie postępy ze względu na zrozumienie patogenezy określonych zespołów oraz dokonanemu w ostatnich latach dynamicznemu postępowi w diagnostyce ultrasonograficznej. Podstawowymi zaletami ultrasonografii w aspekcie badań prowadzonych ze wskazań połoŝniczych jest na pierwszym miejscu jej bezpieczeństwo i nieinwazyjność. Cechy takie jak łatwość zastosowania, powtarzalność, natychmiastowe uzyskanie wyniku badania i stosunkowo niewielki jego koszt jednostkowy odgrywają takŝe waŝną rolę. Do 14 tygodnia ciąŝy jest zalecane aby badanie było prowadzone przy uŝyciu głowicy endovaginalnej znacznie podnoszącej dokładność obrazowania [Spaczyński'93]. Nieprawidłowości chromosomowe zazwyczaj wiąŝą się z występowaniem mnogich wad rozwojowych. Stworzone zostały róŝne protokoły badania mającego na celu wyłonienie grupy cięŝarnych o wysokim ryzyku wystąpienia wady genetycznej lub strukturalnej [Benaceraff, Vintzileos]. Nicolaides podzielił uwidaczniane w trakcie badania USG wady strukturalne na duŝe z reguły nasuwające dalsze złe rokowanie dla płodu oraz małe. Małe wady, spotykane jako izolowane, nie powodują obciąŝenia co do dalszego rokowania, ale niejedno-krotnie mogą być dyskretnym objawem trisomii lub teŝ mogą mieć podłoŝe nie związane z aneuploidiami. Fałd karkowy, przezierność karku płodu: Koniecznym stało się znalezienie cech ultrasonograficznych jednoznacznie nasuwających podejrzenie aberracji chromosomowej płodu. Szczególnie istotny wydało się stwierdzanie w obrazie ultrasonograficznym poszerzenie fałdu skórnego w okolicy karku [Benaceraff'85], które ma w 1/3 przypadków jako podłoŝe nieprawidłowości chromosomowej, z czego 75% to trisomie 21 i 18 [Nicolaides'92]. W latach 90-tych ukazała się seria publikacji omawiających moŝliwą współzaleŝność poszerzonej przezierności karkowej (NT) w I trymestrze ciąŝy z nieprawidłowościami chromosomowymi płodu [Nicolaides'92, Johnson'93, Pandya'95]. Wyniki przeprowadzonych w Wielkiej Brytanii badań populacji ogólnej wykazały 77% czułość wykrywania zespołu Downa dla 5% odsetka wyników fałszywie dodatnich [Snijders, Nicolaides]. Przyczyny poszerzenia przezierności karku zarówno w przypadku płodów o nieprawidłowym jak i prawidłowym kariotypie są róŝne. Wśród nich wymienia się wady serca, zwęŝenie cieśni aorty, nieprawidłowy rozwój naczyń limfatycznych, przeciąŝenie Ŝył głowy i szyi płodu, zmiany w składzie matrix zewnątrzkomórkowym tkanki łącznej [von Kaisenberg'98]. Inne markery aneuploidii w badaniu ultrasonograficznym w I trymestrze ciąŝy: Podejmowano próby znalezienia innych markerów aneuploidii poprawiających charakterystykę testu wykrywczego. Znane są doniesienia mówiące o zmianie częstości podstawowej akcji serca płodu, zaleŝności oporu przepływu w naczyniach pępowinowych. JednakŜe wnioski płynące z opublikowanych obserwacji są sprzeczne [Hyett'96, Schats'90]. Znane są obserwacje łączące nieprawidłowy przepływ w przewodzie Ŝylnym z istnieniem aneuploidii, wykrywanych za pomocą tej metody w 90% przypadków [Matias'98]. Trudność techniczna związana z prawidłowym uwidocznieniem tego przepływu powoduje, Ŝe badanie powinno być zarezerwowane dla ośrodków

6 specjalistycznych do których kierowane są cięŝarne z nieprawidłowym wynikiem screeningu celem dalszej weryfikacji. Kość nosowa: SpostrzeŜenia Langdona Downa opisującego u osobników z trisomią 21 płaską twarz z małym nosem skojarzono z radiologicznymi obserwacjami opóźnionego rozwoju kostnego w przypadku płodów z trisomią 21 [Keeling'97, Stempfle'99]. Przyczyną opóźnionego kostnienia jest prawdopodobnie wspomniana zmiana składu funkcjonalnego matrix zewnątrzkomórkowego w obrębie tkanki łącznej, co ma wpływ na szybkość procesu kostnienia [Moss'62]. W ostatnich latach ukazały się doniesienia pilotaŝowe mówiące o ewentualnej moŝliwości zastosowania stwierdzenia obecności punktu kostnienia kości nosowej jako markera trisomii [Cicero'01, Sonek'02, Bromley'02]. Autorzy zwracają jednocześnie uwagę na potrzebę unifikacji techniki pomiaru ze względu na róŝnice wyników pomiędzy danymi pochodzącymi z róŝnych ośrodków [Orlandi'2003]. Wnioski płynące z opublikowanych do chwili obecnej prac są jednak niejednokrotnie sprzeczne. CEL PRACY WaŜnym wydaje się być zbadanie wartości pomiaru kości nosowej dla badań przesiewowych prowadzonych w populacji ogólnej. ZałoŜenie, Ŝe kość nosowa moŝe stać się oprócz pomiaru przezierności karku jednym z głównych markerów aneuploidii wydaje się być w świetle przytoczonego rozumowania obiecująca perspektywą. Istotne jest takŝe opracowanie dla parametrów mających wejść w skład proponowanego schematu nieinwazyjnych badań przesiewowych własnych norm wynikających z median uzyskanych na podstawie pomiarów dokonanych w duŝej grupie cięŝarnych (ze względu na zmienność etniczną). W planowanym opracowaniu schematu screeningu naleŝy uwzględnić takŝe zgłaszalność cięŝarnych na pierwsze badanie ultrasonograficzne w ciąŝy. W wielu przypadkach odbywa się ono na początku drugiego trymestru, co powodowałoby nieskuteczność systemu opartego głównie na badaniach w pierwszym trymestrze ciąŝy [Bromley'2002]. Jest to niezwykle aktualne w Polsce, gdzie nie ma obowiązku wykonywania pierwszego badania ultrasonograficznego w pierwszym trymestrze ciąŝy. Ponadto badanie wykonywane na początku drugiego trymestru niewątpliwie poprawia dokładność rozpoznania poprzez moŝliwość szczegółowej oceny budowy strukturalnej płodu według protokołu sonogramu genetycznego. Pod tym pojęciem rozumiane jest dokładne uwidocznienie morfologii płodu z oceną ewentualnego występowania szeregu mniejszych markerów wad rozwojowych. Proponowany schemat postępowania moŝe znacznie poprawić czułość i swoistość wykrywania wad rozwojowych płodu i uściślić stawianie wskazań do diagnostyki inwazyjnej. Celem pracy jest opracowanie schematu wykrywania wad rozwojowych płodu w I połowie ciąŝy poprzez: 1. wyznaczenie norm (wielokrotności median) dla szerokości przezierności karkowej/fałdu karkowego (NT) oraz długości kości nosowej (NB) pomiędzy 12 a 20 tygodniem ciąŝy w populacji polskiej (korelacja z parametrami biometrycznymi CRL i BPD dla zwiększenia dokładności oznaczeń).

7 2. ustalenie wartości powyŝszych parametrów jako markerów występowania wad rozwojo-wych płodu. 3. ocena stworzonego algorytmu wykrywania wad rozwojowych płodu opartego na: a. teście ultrasonograficznym polegającym na pomiarach przezierności karku/fałdu karkowego kości nosowej skorelowanych z ryzykiem wynikającym z wieku matki, b. oznaczeniach biochemicznych testu potrójnego - α-fetoproteiny (AFP), gonadotropiny kosmówkowej (HCG), wolnego estriolu (E3), c. uzupełniającego protokołu sonogramu genetycznego wykonywanego równolegle z pobra-niem krwi na oznaczenia testu potrójnego, d. kwalifikowaniu do diagnostyki inwazyjnej i przeprowadzaniu amniopunkcji z następowym oznaczeniem kariotypu i oznaczeń biochemicznych z płynu owodniowego w przypadku dodatniego wyniku powyŝszego schematu. MATERIAŁ I METODA Badania zostały wykonane w latach w Instytucie Ginekologii i PołoŜnictwa Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. Badanie przesiewowe populacji cięŝarnych objęły grupę 1490 kobiet znajdujących się pod opieką ambulatoryjną lekarzy Instytutu lub hospitalizowanych w trakcie ciąŝy ze wskazań połoŝniczych. W populacji objętej badaniami nie dokonywano wstępnej preselekcji za wyjątkiem potwierdzenia ukończenia 11-go tygodnia ciąŝy według wyliczenia metrykalnego. Badania ultrasonograficzne wykonywano aparatem ultrasonograficznym Hitachi EUB 525 LI o cyfrowym przetwarzaniu obrazu, wyposaŝonym w funkcję 10x powiększenia (zoom) umoŝliwiającego prowadzenie pomiarów z dokładnością 0,1 mm. UŜywano głowicy endovaginalnej o częstotliwości 6,5 MHz lub abdominalnej o częstotliwości 3,5 MHz. Badania prowadzono wg schematu projektu: 1. Dokonywano pomiaru długości ciemieniowo-siedzeniowej płodu (CRL) jako parametru biometrycznego stanowiącego kryterium włączenia do populacji badanej powyŝej wartości 38 mm. Pomiarów NT dokonywano według standardów opracowanych przez Nicolaidesa, a pomiar jądra kostnienia kości nosowej (NB) przeprowadzano umiejscawiając znaczniki na zewnętrznych biegunach kości (wg Cicero). 2. Analogiczne badanie wykonywano po 4 tygodniach (15-19 tydzień ciąŝy) lub jako pierwsze u cięŝarnych później zgłaszających się na I badanie USG (u których CRL > 84 mm). Jako podstawowy parametr biometryczny uznano wymiar dwuciemieniowy BPD jako parametr odniesienia. Badanie ultrasonograficzne ukierunkowane na stwierdzenie lub wykluczenie obecności markerów powaŝnych wad strukturalnych płodu prowadzono według szczegółowego protokołu (wg Vintzileos). 3. Równolegle z powyŝej opisywanym badaniem ultrasonograficznym wykonywano oznaczenia testu potrójnego, polegającego na ocenie stęŝeń α-fetoproteiny (AFP), gonadotropiny kosmówkowej (HCG) i estriolu (E3) w surowicy krwi kobiet cięŝarnych. Kryterium wieku ciąŝowego zastąpiono jak w przypadku badań ultrasonograficznych pomiarem biometrycznym wymiaru

8 dwuciemieniowego (BPD). Ilościowe oznaczenia markerów wchodzących w skład testu potrójnego wykonano immunoenzymatyczną metodą ELISA/Sandwich na spektrofotometrze Cecil CE 2501 firmy BioQuest. W pierwszym etapie badania wyznaczono normy dla populacji badanej. Dla oceny ryzyka występowania wad rozwojowych stworzono autorski program komputerowy będący zmodernizowanym programem PRISCA zakupionym w ramach prowadzonego przez autora projektu badawczego finansowanego przez Komitet Badań Naukowych (nr umowy 0687/P05/99/17). W przypadku nieprawidłowego wyniku uzyskanego powyŝej opisaną metodą cięŝarna była kwalifikowana do diagnostyki inwazyjnej. 4. Amniopunkcja z pobraniem płynu owodniowego do oceny kariotypu i badania biochemicznego płynu owodniowego. Komórki płynu owodniowego słuŝyły do hodowli a następnie oznaczenia kariotypu płodu. W płynie owodniowym oznaczano poziom a1-fetoproteiny (AFP) metodą immunoelektroforezy, poziom acetylocholinesterazy (AChE) metodą Ellmana oraz przeprowadzano identyfikację prąŝka specyficznej AChE metodą elektroforezy. PowyŜsze badania prze-prowadzono w Zakładzie Genetyki Medycznej Akademii Medycznej w Łodzi, kierownik Zakładu: prof. dr hab. med. Bogdan KałuŜewski. Grupa cięŝarnych nie poddanych prenatalnej diagnostyce inwazyjnej była monitorowana do porodu. Po urodzeniu dzieci poddawane były specjalistycznemu badaniu neonatologicznemu z ukierunkowaniem na rozpoznawanie wad rozwojowych. Projekt badań przedstawiony został Komisji Etyki Badań Naukowych i uzyskał jej aprobatę, przed kaŝdym z etapów badania cięŝarne były dokładnie poinformowane i wyraŝały zgodę. Wyniki badań były archiwizowane w postaci plików zachowywanych w pamięci komputerowej. Uzyskane wyniki zostały poddane analizie statystycznej. WYNIKI Badanie przesiewowe populacji cięŝarnych objęły grupę 1490 kobiet znajdujących się pod opieką lekarzy Instytutu. Z populacji badanej wyłączono ciąŝe mnogie, utracone z dalszej obserwacji, u których nie dokonano pomiarów przezierności karku lub fałdu karkowego, u których nie udało się uwidocznić i przeprowadzić pomiaru kości nosowej. Ostatecznie do analizy statystycznej pozostała grupa 1375 cięŝarnych, które zostały podzielone na dwie grupy: kobiet cięŝarnych o prawidłowym przebiegu ciąŝy - 63 cięŝarne u których wykryto wady płodu uwarunkowane genetycznie lub wady strukturalne, w tym: ciąŝe z aneuploidiami chromosomowymi - 34 kobiety, wady strukturalne - 29 cięŝarnych. Wśród wad uwarunkowanych genetycznie stwierdzono: 16 płodów z trisomią 21, 6 płodów z trisomią 18, 5 płodów z trisomią 13, 2 płody z triploidią, 2 płody z inwersją w 9 parze chromosomów oraz 1 płód z delecją w 16 parze chromosomów. Zespół Downa w 2 przypadkach stwierdzono pourodzeniowo (przypadki fałszywie ujemne w trakcie prowadzonych badań). W badanej populacji oceniano charakterystyki poszczególnych metod badawczych dla ryzyka 1:200 ze względu na analogiczne ryzyko utraty ciąŝy jako powikłanie przesiewowego wykonywania

9 amniopunkcji. Wiek kobiet zakwalifikowanych do badań wahał się od 16 do 47 roku Ŝycia. Zaobserwowano istotne róŝnice pomiędzy wiekiem kobiet w grupie kontrolnej a cięŝarnymi w grupach badanych powyŝej 35 roku Ŝycia. W grupie ciąŝ prawidłowych odsetek ten wynosi 11% w obu trymestrach, podczas gdy w grupie aberracji chromosomowych jest to aŝ 37%. Odsetek kobiet cięŝarnych z zespołem Downa w ogólnej populacji polskiej znacznie odbiega od populacji badanej. W Polsce wynosi on 0,15%, natomiast w grupie kobiet cięŝarnych poddanych badaniom jest to 1,4% grupy badanej. Wyniki otrzymane w grupie cięŝarnych o prawidłowym przebiegu ciąŝy stanowiły podstawę do wyliczenia norm dla badanych parametrów. Opracowano normy dla markerów ultrasonograficznych - długości kości nosowej NB, szerokości przezierności karkowej/fałdu karkowego NT oraz biochemicznych - oznaczeń stęŝeń w surowicy cięŝarnych (test potrójny): AFP, HCG, E3. Pomiary długości kości nosowej NB oraz przezierności karku/fałdu karkowego NT wykazały liniowy wzrost wartości wraz z rozwojem ciąŝy. W przypadku kości nosowej, jej długość rośnie ze znacznie większą dynamiką w stosunku do szerokości przezierności karku/fałdu karkowego. Wartości uzyskane w oznaczeniach stęŝeń poszczególnych składowych testu potrójnego wykazały tendencję rosnącą dla AFP i estriolu, natomiast dla β-hcg zaobserwowano spadek wartości wraz ze wzrostem ciąŝy. 1. Wartość średnia pomiarów szerokości przezierności karku dla długości ciemieniowosiedzeniowej zawierającej się pomiędzy 35 a 85 mm wykazuje tendencję wzrostową od wartości 1,29 mm do 1,86 mm. Podobnie zachowuje się przebieg średnich dla długości kości nosowej, który wzrasta od wartości 1,88 mm dla długości ciemieniowo-siedzeniowej równej 35 mm do 3,69 mm dla CRL 85 mm. Wyliczono takŝe górny i dolny przedział ufności dla badanych parametrów, wartości w nich zawarte interpretowane są jako wartości prawidłowe dla omawianych parametrów. Uwzględniając patofizjologiczne podstawy zachowania badanych markerów wad płodu, jako zakres normy stosowanej w praktyce wyliczone zostały linie odcięcia dla badanych parametrów w przyjętym przedziale długości ciemieniowo-siedzeniowej płodu (CRL) i wymiaru dwuciemieniowego (BPD) (przedział predykcji - granica 95% wyników prawidłowych). Jako charakterystykę testu przyjęto wartości predykcyjne pomiarów dla wykrywania aberracji chromosomowych u płodu. W odniesieniu do CRL ostatecznie stwierdzono 11 płodów z aneuploidiami, w 10 przypadkach przeprowadzono badanie kości nosowej, a u wszystkich 11 płodów pomiar fałdu karkowego. NB: Dla pomiarów długości kości nosowej czułość wykrywania wad utrzymuje się na poziomie 60%, podobnie swoistość która wynosi 98%. Wartość predykcyjna dodatnia (PPV(+)) równa jest 43% (przeciętnie niemal co drugi dodatni wynik testu oznacza istnienie wady). Wartość predykcyjna ujemna (PPV(-)) wynosi 98.9% - fałszywie ujemny wynik 1/100 badań. JeŜeli przyjmiemy, Ŝe załoŝeniem testu jest obecność lub brak kości nosowej w obrazie ultrasonograficznym w pierwszym trymestrze ciąŝy, to stwierdzamy 40% czułość ale 100% swoistość testu.

10 NT: W przypadku pomiarów szerokości przezierności karkowej czułość badania to 63,6% (wykryto 7 na 11 wad chromosomowych) a swoistość 98,2%. W 38,9% przypadków nieprawidłowy wynik badania oznacza rzeczywiście wadę chromosomową płodu (PPV(+)), a w 11 przypadkach na 600 jest fałszywie dodatni (PPV(-) równa 98,2%). NT+NB: Charakterystykę podobną do powyŝszych badań posiada test ultrasonograficzny złoŝony z pomiaru szerokości przezierności karku i długości kości nosowej w pierwszym trymestrze ciąŝy. Wykryto 5 na 9 wad uwarunkowanych genetycznie (czułość 55,6%), przy czym swoistość testu wynosiła 98,6%. Średnio co drugi wynik dodatni pokrywał się z faktycznie istniejącą wadą (PPV(+) 50%), a tylko u 1 cięŝarnej na 100 wynik jest fałszywie dodatni (PPV(-) 98,9%). 2. Wyniki prawidłowe dla pomiarów szerokości fałdu karkowego zawierają się pomiędzy średnimi wartościami NT 1,62 mm dla wymiaru dwuciemieniowego BPD wynoszącego 20 mm do szerokości NT 2,87 mm dla BPD równego 55 mm. Norma dla długości kości nosowej wzrasta od wartości 2,52 mm dla BPD równego 20 mm do NB 7,29 mm dla wymiaru dwuciemieniowego wynoszącego 55 mm. Obserwowany jest wzrost liniowy wartości obu badanych markerów ultrasonograficznych w analizowanym okresie ciąŝy zarówno w stosunku do długości ciemieniowo-siedzeniowej, jak i wymiaru dwuciemieniowego główki płodu - o znacznie większej dynamice w przypadku kości nosowej, co widoczne jest wyraźnie w odniesieniu do parametrów biometrycznych. NB: Dokonując pomiaru długości kości nosowej w odniesieniu do BPD zaobserwowano czułość rzędu 68,4%, wykrywając tą metodą 13 z 19 przypadków aneuploidii chromosomowych płodu. Swoistość wyniosła 97,4%. PPV(+) o wartości 56,5%, oznacza Ŝe w ponad 1/2 wyników dodatnich obserwowane płody rzeczywiście miały wadę chromosomową. Natomiast w 371/381 badań uzyskany wynik ujemny oznacza prawdziwe wykluczenie istnienia aberracji chromosomów (PPV(-) 98,4%). NT: Dla pomiaru szerokości fałdu karkowego czułość jest jeszcze wyŝsza i wynosi 73,9% (wykryto 17 z 23 przypadków patologii chromosomowych), takŝe swoistość jest na wysokim poziomie 97,9%. PPV (+) i (-) pomiaru szerokości NT kształtują się na podobnym poziomie jak w przypadku pomiaru NB - odpowiednio 54,8% i 99,2%. NT+NB: Wysokie wartości wszystkich parametrów charakteryzujących badanie wykazuje test scalony łączący w jednym obie metody diagnostyki ultrasonograficznej. Charakterystyki testu wyliczone zostały dla pomiaru NT oraz NB w odniesieniu do pomiarów biometrycznych, ze względu na moŝliwość dokładnego porównania wartości mierzonego markera wad do wartości naleŝnej. W przypadku odnoszenia pomiaru markera do wieku ciąŝowego wspomniana dokładność jest gorsza co szczególnie wyraźnie jest widoczne w przypadku długości kości nosowej. Jej wymiar zwiększa się szybko w trakcie ciąŝy i porównywanie wyników pochodzących z początku i końca tego samego tygodnia mogłoby dawać wyŝszą ilość fałszywych wyników testu. Test scalony składający się z pomiaru szerokości fałdu karkowego NT i długości kości nosowej NB charakteryzuje się następującymi wartościami predykcyjnymi: czułość wynosi 94,7% (wykryto

11 18 na 19 aneuploidii), swoistość jest na poziomie 98,9% czyli wynik ujemny tylko u co setnej cięŝarnej jest nieprawdziwy, PPV(+) równa jest 90% (dodatniego wyniku testu 9/10 płodów oznacza rzeczywistą wadę chromosomową), PPV(-) to 99,7%, a więc tylko w przypadku 3/1000 zbadanych kobiet cięŝarnych wynik testu jest fałszywie ujemny. TT: Wyznaczono normy dla składowych oznaczeń biochemicznych testu potrójnego w odniesieniu do wymiaru dwuciemieniowego BPD główki płodu wyznaczanego w trakcie poprzedzającego pobranie krwi badania ultrasonograficznego. Pobranie krwi w celu wykonania testu potrójnego (AFP, HCG, Estriol) przeprowadzono w przypadkach gdy wymiar BPD był równy lub większy niŝ 30 mm (co odpowiada 15 i więcej tygodni ciąŝy), ze względu na wymogi metodyczne dotyczące testu. Wyliczone średnie wartości prawidłowe wynoszą: α-fetoproteina (AFP) wzrost stęŝenia w surowicy krwi matki od 35,3 IU/ml dla BPD 30 mm do 110 IU/ml dla BPD 55 mm, gonadotropina kosmówkowa (HCG) spadek stęŝenia w surowicy krwi matczynej od miu/ml dla BPD 30 mm do miu/ml dla BPD 55 mm, wolny estriol (free E3) wzrost koncentracji w surowicy krwi matki od 1,97 ng/ml dla BPD 30 mm do 7,69 ng/ml dla BPD 55 mm. Normy uzyskano poprzez wyliczenie wartości oczekiwanych dla poszczególnych wartości pomiarów biometrycznych oraz określono górną i dolną granicę 95% przedziału ufności. W przypadku wad chromosomowych płodu znamienny jest spadek stęŝenia alfafetoproteiny i wolnego estriolu oraz analogiczny wzrost koncentracji choriongonadotropiny kosmówkowej. Dlatego w celu zastosowania testu do wykrywania aneuploidii chromosomowych wyznaczone zostały odpowiednie linie odcięcia, przy czym obszar predykcji dla AFP i E3 zawiera się poniŝej linii odcięcia, natomiast dla HCG wspomniany obszar predykcji zawiera się powyŝej linii odcięcia prowadzonej poprzez wartości predykcyjne dla BPD. Do zastosowania oznaczeń stęŝenia AFP do diagnostyki otwartych wad OUN i powłok brzucha płodu wyznaczono obszar predykcji znajdujący się powyŝej linii odcięcia (odwrotnie niŝ w przypadku wykrywania aberracji chromosomowych) uzyskano czułość 94,4%, swoistość 95%. Dokonano oceny testu zintegrowanego - korelacji scalonego testu ultrasonograficznego (NT+NB) z biochemicznym testem potrójnym: czułość wykrywcza aneuploidii wyniosła 94,7% (rozpoznano 18 na 19 wad). Swoistość wyniosła 99,2 % czyli uzyskano 375/ 378 przypadków prawidłowego przebiegu ciąŝy. PPV(+) wyniosła 85,7% (5/6 wyników dodatnich było rzeczywistym wykryciem wady). PPV(-) na poziomie 99,7% oznacza, Ŝe wyników fałszywie ujemnych stwierdzono tylko 0,3%. Dokonano takŝe oceny charakterystyki badania ultrasonograficznego wykonywanego według szczegółowego protokołu oceny markerów wad. Stwierdzono czułość o wartości 80% dla badań ultrasonograficznych ukierunkowanych na wykrywanie wad strukturalnych w odniesieniu do CRL oraz 100% swoistość powyŝszej metody. PPV (+) badania wyniosła 100%, a negatywna 99,7%. W odniesieniu do BPD uzyskano wartość absolutną wynoszącą 100% dla wszystkich cech charakteryzujących powyŝsze badanie ultrasonograficzne.

12 Na podstawie uzyskanych wyników oraz analizy danych epidemio-logicznych dla ogółu kobiet cięŝarnych w Polsce dokonano statystycznej ekstrapolacji wartości prognostycznej analizowanego testu. Jako załoŝenie przyjęto zastosowanie go w ogólnej populacji polskiej. Dla wykrywania aneuploidii poprzez wdroŝenie testu scalonego opartego na pomiarach fałdu karkowego NT i długości kości nosowej NB (w odniesieniu do wymiaru dwuciemieniowego BPD) PPV(+) wyniesie 21,2% a negatywna wartość predykcyjna 99,99%. Dla testu zintegrowanego, gdzie dodatkowo przeprowadzane byłyby równolegle oznaczenia biochemiczne testu potrójnego wartości predykcyjne kształtowałyby się na poziomie analogicznym. Wyniki prognostyczne proponowanego schematu diagnostycznego oznaczają Ŝe co piąta amniopunkcja będzie rzeczywiście potwierdzała aneuploidię. Dla porównania policzono charakterystykę prognostyczną inwazyjnego badania przesiewowego (amniopunkcji) wykonywanego na podstawie ryzyka wystąpienia aneuploidii określanego na podstawie wieku cięŝarnych. W tym przypadku dla punktu odcięcia 1/200 kobiety cięŝarne 37 letnie i starsze PPV(+) wynosi 0,9%, czyli 1/100 amniopunkcji przyniesie wynik pozytywny. Na podstawie połoŝniczych danych populacyjnych dla Polski w 2002 roku przyjęto, Ŝe powyŝej 37 roku Ŝycia jest około kobiet cięŝarnych/rocznie. Przyjmując predykcję przesiewowego badania inwazyjnego amniopunkcji, w przypadku zastosowania jej w popu-lacji polskich cięŝarnych 37-letnich i starszych - oznaczałoby to wykrycie około 200 przypadków aneuploidii (1/100) przy jednoczesnej utracie około 100 prawidłowych ciąŝ (0,5% powikłań). Natomiast dla proponowanego schematu badań w omawianej grupie cięŝarnych dla wykrycia 200 aneuploidii wystąpi konieczność wykonania w przybliŝeniu 1000 amniopunkcji z utratą 5 przypadków ciąŝ prawidłowych (0,5%). Program badań ultrasonograficznych (test scalony obejmujący ocenę szerokości NT i długości NT) ze względu na swoją nieinwazyjność, wysoką wartość predykcyjną i niski koszt mógłby objąć całą populacją cięŝarnych w Polsce. Przyjmując powyŝsze załoŝenie w 2002 roku zostałby zastosowany u cięŝarnych. PoniewaŜ ogólną częstość urodzeniową aneuploidii szacuje się w naszym kraju na 0,3%, to wynika z tego arytmetyczne obliczenie około 1050 przypadków. Biorąc pod uwagę charakterystykę proponowanego schematu, wykryciu w trakcie badań uległoby około 1000 z 1050 przypadków aberracji chromosomowych (czułość 94,7%), a konieczne dla potwierdzenia ostatecznego aneuploidii byłoby wykonanie około 5000 amniopunkcji (pozytywna wartość predykcyjna wyliczona dla populacji w Polsce 21,2%). Przeanalizowano teŝ wartość prognostyczną badania ultrasonograficznego prowadzonego według protokołu wykrywania wad strukturalnych. Porównano dane epidemiologiczne populacji badanej i ogólnopolskiej - wyliczono Ŝe statystycznie powinno być w badanej populacji 19 wad strukturalnych. Zaobserwowano wyŝszą częstość (29 przypadków), jednak zarówno czułość jak i swoistość w odniesieniu do BPD wyniosła 100% więc PPV (+) i (-) w populacji Polski teŝ wyniesie 100%.

13 Reasumując: 1. Skorygowano przebieg normy dla pomiarów ultrasonograficznych szerokości przezierności karkowej/fałdu karkowego (NT) w odniesieniu do długości ciemieniowo-siedzeniowej CRL oraz wymiaru dwuciemieniowego płodu BPD. 2. Wyznaczono przebieg normy dla pomiarów ultrasonograficznych długości kości nosowej płodu (NB) w odniesieniu do długości ciemieniowo-siedzeniowej CRL oraz wymiaru dwuciemieniowego płodu BPD. 3. Skorygowano przebieg norm dla oznaczeń biochemicznych w surowicy krwi cięŝarnych α- fetoproteiny, choriongonadotropiny kosmówkowej, wolnego estriolu w odniesieniu do wymiaru dwuciemieniowego płodu BPD. 4. Dokonano analizy wartości predykcyjnych badań ultrasonograficznych i biochemicznych w korelacji z wiekiem matki jako markerów występowania wad rozwojowych u płodu. Stwierdzono wyŝsze wartości predykcyjne dla badań korelowanych z wymiarem dwuciemieniowym główki płodu. 5. Oznaczono wartości predykcyjne proponowanego schematu badań prenatalnych dla wykrywania wad rozwojowych płodu w ogólnej populacji kobiet cięŝarnych w Polsce. WNIOSKI: Na podstawie przedstawionych wyników wyciągnięto następujące wnioski: 1. Opracowano nowy parametr biometryczny długość kości nosowej (NB) oraz skorygowany szerokość przezierności karkowej/fałdu karkowego (NT). Stanowią one uŝyteczne markery wad rozwojowych płodu, w szczególności aberracji chromosomowych. 2. Wysokie wartości predykcyjne schematu badań zarówno dla wykrywania aneuploidii jak i wad strukturalnych rekomendują stosowanie go w odniesieniu do wymiaru dwuciemieniowego dla wykrywania wad płodu. 3. Proponowany schemat badań prenatalnych stanowi skuteczny algorytm diagnostyczny o wysokich wartościach predykcyjnych wykrywania wad płodu w I połowie ciąŝy. 4. Wprowadzenie proponowanego algorytmu diagnostycznego mogłoby istotnie zmniejszyć ilość badań inwazyjnych w grupie cięŝarnych o podwyŝszonym ryzyku wystąpienia wady rozwojowej, obniŝając ilość potencjalnych utrat ciąŝy w wyniku zabiegów diagnostyki inwazyjnej. 5. Proponowany schemat badań ultrasonograficznych charakteryzujący się wysoką predykcją dla wykrywania wad rozwojowych, niskim kosztem wykonania i absolutnym bezpieczeństwem dla płodu mógłby zostać zastosowany w ogólnej populacji cięŝarnych w Polsce.

14 DIAGNOSTIC SCHEMA FOR FETAL MALFORMATIONS IN THE FIRST HALF OF PREGNANCY WITH SPECIAL REMARK ON THE CHROMOSOMAL ABNORMALITIES PIOTR SIEROSZEWSKI ABSTRACT Introduction The rapid development of the medicine science has changed the reasons of the perinatal and neonatal mortality and morbidity. Previously dominant factors like labour complications, congenital infections, diabetes or Rh immunization are now largely limited. But the frequency of the fetal malformations and genetic syndromes is still at the same level of 3%. In Poland was created a highly effective Polish Register for the congenital malformations in which are recorded and analysed all cases of the fetal and neonatal defects in our country (until 2 year of age) [Latos- Bieleńska'98]. About 30% of all malformations are of genetic origin. Here are chromosomal aberrations, single mutations or multifactor inheritance of importance. The structural malformations come into existence on various stages of fetal development. Therefore the character and degree of the abnormality are dependent on the moment of the harmful, teratogenic exposition. The risk of the chromosomal aberration increase together with the age of the pregnant woman. The most common chromosomal aberration is trisomy 21 called Down syndrome (1/600-1/700 of live births). The consequences of the additional autosom in the 21 chromosome pair are characteristic features of the face, heart defects, mental handicap. The other chromosomal abnormalities like Edwards syndrome (trisomy 18), Patau syndrome (trisomy 13) and triploidy are connected with a high rate of intrauterine and postnatal mortality, severe growth restriction and multiple structural defects. Invasive diagnostic. The first diagnostic policy was to perform invasive procedures for karyotyping by mothers over 36 years of age seen as high risk group. Introduction of ultrasound guided amniocentesis provided a rapid decrease in the complications rate of the method (now about 0,5%). The biochemical examination of the amniotic liquid can detect open neural and abdominal wall defects. The high risk group makes in Poland ca. 10 % of the pregnant women and this group comprise about 30% of the Down syndrome cases. Biochemical tests. The serological examinations were introduced as screening method for diagnostic of chromosomal aberrations. Here are concentrations of following substances examined: AFP alfafetoprotein which is important not only as aneuploidy marker but also as open neural and abdominal wall defects detector, then choriongonadotropine HCG and free estriol E3. All of these components with correlation to the mother's age are well known as triple screen test which has about 60% sensitivity for the Down syndrome detection with 5% false positive results. Next serological investigation which is also useful for the diagnostic of the trisomy 21 and 18 is PAPP-A and β-hcg test. The sensitivity and false positive results rate is similar to the triple screen

15 test but PAPP-A and β-hcg could be performed earlier in pregnancy. The negative aspects of the PAPP-A and β-hcg in comparison with triple screen test are usefulness only for detection of the trisomies 21 and 18 and higher cost of the laboratory kits. Ultrasound diagnostic. Ultrasound diagnostic of the fetal abnormalities made a dramatic progress during the last 30 years. The most important advantages of the diagnostic are safety, non-invasive character, repeatability, real time result and relative low cost of the method. Until 14 weeks of pregnancy there is recommended to perform the obstetrical scan using an endovaginal probe [Spaczynski'93]. Chromosomal abnormalities are mostly connected with multiple morphological defects of the fetus. There are proposed and used many protocols of the genetic sonograms [Benaceraff, Vintzileos]. Nicolaides differentiate the defects as major and small. The major ones are bounded with bad prognostic for the further fetal development. The small ones are often isolated and produce no complications in the intrauterine growth. Furthermore the small defects are not connected with chromosomal aberrations. Nuchal translucency there was a need to find ultrasound features with a strong prognostic value for chromosomal aberrations. The first observation about specific thickening of the nuchal fold in case of trisomy 21 reported Benaceraff (1985). Numerous studies in the next years confirmed this observation and gave the proofs to bring over the main point of nuchal translucency diagnostic to the first trimester [Szabo'90, Nicolaides'92]. The multicentre studies in the low-risk populations gave the evidence of the about 77% sensitivity by 5% false positive rate of this ultrasound test for the chromosome abnormalities detection [Snijders, Nicolaides'98, Pajkrt'98]. The reasons of the nuchal thickening are heart defects, narrowing of the aortic isthmus, abnormal development of the lymphatic vessels and jugular vein and the changes in the composition of the matrix of the connective tissue. The last fact is very specific for the trisomy 21 because the expression genes of the collagen production are situated on this chromosome pair [von Kaisenberg'98]. The other aneuploidy markers there were many studies published about possible connection between various ultrasound markers and chromosomal abnormalities. The examples are fetal, basic heart rate or increased blood flow resistance in the umbilical artery in the case of chromosomal aberration but the results stay still very controversial. The opposite significance possess the assessment of the blood flow in the ductus venosus which is helpful in the detection of aneuploidy but there is a technical difficulty to carry out such investigation. Therefore this method is preserved for the perinatal centres and not suitable for the screening. Nasal bone the flat face with a small nose (Langdon Downs observation) were associated with morphological observations of the delayed skeletal development in the trisomic fetuses [Keeling'97, Stempfle'99]. The reason is already described change in the composition of the extracellular matrix what has an influence on the ossification process [Moss'62]. In the last years were published first publications about possible application of the nasal bone measurement for trisomy detection [Cicero'2001, Sonek'2002, Bromley'2002]. The authors emphasize the need for

16 the unification of the ultrasound measurement method because of the different results obtained in the various centres [Orlandi'2003]. Therefore the conclusions drawn from the studies vary. The assessment of the prognostic value of nasal bone measurement as one of the main aneuploidy markers seems to be a significant aim. Moreover, very important is to estimate normal ranges in polish population for the studied parameters of the prenatal diagnostic (nasal bone, nuchal translucency and triple screen test in correlation to biometric data CRL and BPD). Then the next main target is to work out a diagnostic schema for fetal abnormalities with taking into consideration the average gestational age in Poland in which the pregnant women come for the first ultrasound scan. The recommendation of the national consultant for gynaecology & obstetrics says about the first scan at the start of the second trimester (16-20 weeks). This pregnancy period makes possible to get the best ultrasound window for precise ultrasound assessment of the fetal morphology. For this reason is the special genetic sonogram protocol proofed already in many studies in common clinical use. The proposed non-invasive algorithm of the prenatal diagnostic could improve the sensitivity of the method and precise the indications for invasive procedures (amniocentesis). The aim The main aim of the study is to work out a diagnostic schema for prenatal diagnostic in the first half of the pregnancy with special remark on the chromosomal aberrations. This will proceed in the following phases: 1. Normal values estimation for the nuchal translucency (NT) and nasal bone (NB) measurement in a gestational age between 12 and 20 weeks (correlation with biometric parameters CRL and BPD for the improvement of the assessment precision). 2. Prognostic value analysis of the parameters as markers of fetal abnormalities. 3. The evaluation of the created diagnostic schema for the fetal malformations detection. The schema contains the following components: - ultrasound test comprising the measurements of the nuchal translucency and nasal bone length correlated with mother's-age risk, - biochemical triple screen test - a-fetoprotein (AFP), choriongonadotropin (HCG), free estriol (E3), - complementary genetic sonogram protocol carried-out parallel to the triple screen test, - invasive diagnostic (amniocentesis) in a case of positive result of the schema. Material and method The study was done in years in the Institute of Gynecology and Obstetrics Medical University of Łódź. Under examination was put the population of 1490 pregnant women who were under the ambulant care or hospitalised in the Institute during the pregnancy. In the studied population no preselection was done only the ultrasound confirmation that the calculated gestational age was over 11 weeks. Ultrasound scans were performed by Hitachi EUB 525 LI

17 digital scanner possessing 10x zoom function what makes possible the measurements with 0.1 mm precision. The research was carried out following the schema: 1. Crown-rump length of the fetus was measured as an inclusion criterion for the study collective (over 38 mm). The measurements of the nuchal translucency was performed following the standards of Nicolaides and nasal bone following the method published by Cicero. 2. Then the next scan was performed after 4 weeks or as the first examination in the group of pregnant women who came for the start visit over 14 weeks (CRL over 84 mm). The basic biometric parameter as reference for the pregnancy age was taken BPD (biparietal diameter). Ultrasound scan designed to check out the fetal morphology according to genetic markers examination protocol was made at the same time. 3. Parallel to the ultrasound examination was performed the triple screen test including estimation of a-fetoprotein (AFP), choriongonadotropin (HCG) and free estriol (E3) serum levels. The reference criterion to establish the correlation was taken also BPD. Quantitative biochemical estimation was performed using immunoenzymatic method ELISA/Sandwich by means of spectrophotometer Cecil CE 2501 (BioQuest company). At the first phase of the research were estimated the normal values for polish population. For the fetal abnormalities risk assessment was made own computer programme on the basis of PRISCA software. In case of an abnormal result of the examination the pregnant woman underwent the invasive diagnostic (amniocentesis). 4. Amniocentesis was carried out under the ultrasound real-time visualisation. Amniotic fluid cells was used for the culture and then karyotyping, this procedure was done in the Department of Medical Genetic Medical University of Łódź. The studied population was observed until delivery, then the babies underwent an detailed examination in the Neonatology Department of the Institute. The research project was proofed and approved by the Scientific Research Ethics Committee. All pregnant women were thoroughly informed and written consent was obtained. The examination results were recorded and saved as PC computer memory files. The all results were put into the statistical analysis. The results The study population comprised 1490 pregnant women but from the analysed group were excluded multiple pregnancies, lost in follow, the cases without NT or NB measure. Finally for the statistical analysis were put the collective of 1375 pregnant women divided into 2 groups: women with normal course of pregnancy women with diagnosed fetal abnormalities of chromosomal or structural origin. There were 34 cases of chromosomal abnormalities and 29 cases of structural malformations. Following aneuploidies were found out: 16 cases with trisomy 21, 6 with trisomy 18, 5 with trisomy 13, 2 with triploidy, 2 with unbalanced inversion 9 and 1 with deletion in the 16 pair. In 2 cases Down syndrome remained unexplored until delivery (false negative outcomes). The characteristics of the investigated methods were calculated for the risk cut-off point of 1:200

18 because of the same risk level for the invasive diagnostic. The age of the women in the studied population were between 16 and 47 years. There were observed significant differences between women's age in controls and studied groups over 35 years of age. In the normal collective there is 11% but in the chromosomal aberrations there is 37% of the older mothers group. The percentage of the Down syndrome group in the normal polish population of pregnant women is 0.15% and in the studied population this is 1.4%. The results obtained in the collective of normal pregnancies established a base for the normal values calculation. There were calculated normal values for ultra-sound markers nasal bone length (NB), nuchal translucency (NT) and biochemical estimations of the triple screen test AFP, HCG, E3 serum levels. The measurements of NB and NT showed linear value increase with the pregnancy course. 1. For the nuchal translucency measurement correlated with CRL (38-85 mm) the values increased from 1.29 mm to 1.86 mm. Similar were the tendency for the nasal bone length which grows from 1.88 mm to 3.69 mm. There were also calculated confidence intervals for the measured parameters (normal values). Taking into consideration the pathology of the fetal abnormalities were calculated cut-off points for the markers (prediction partition including 95% of the normal values). For the fetal abnormalities caused by chromosomal aberrations the measurements of markers were done. Following test characteristics (correlation to CRL) were noted: - nasal bone NB sensitivity 60%, specificity 98%, positive predictive value (PPV+) 43%, negative predictive value (NPV-) 98,9%. For the assumption that the test outcome means presence or absence of the nasal bone in the ultrasound scan sensitivity was 40% but specificity 100%. - nuchal translucency NT sensitivity 63,6%, specificity 98,2%, PPV+ 38,9%, PPV- 98,2%. - NT + NB presents similar characteristic to the NB or NT alone - sensitivity 55,6%, specificity 98,6%, PPV+ 50%, NPV- 98,9%. 2. The normal values of the markers in correlation with biparietal diameter BPD (20-55 mm) were observed as follows: nuchal translucency NT from 1.62 mm increases to 2.87 mm, nasal bone length NB from 2.52 mm to 7.29 mm. The linear increase of the nasal bone length has markedly greater dynamic than nuchal translucency thickness. Following test characteristics for chromosomal aberrations markers (correlation to BPD) were noted: - nasal bone NB - sensitivity 68,4%, specificity 97,4%, PPV+ 56,5%, NPV- 98,4%. - nuchal translucency NT - sensitivity 73,9%, specificity 97,9%, PPV+ 54,8%, NPV- 99,2%. - NT + NB - sensitivity 94,7%, specificity 98,9%, PPV+ 90%, NPV- 99,7%. In the test characteristics calculations was used correlation to the biometric parameters because of the better precision when compared with gestational age in weeks. This is especially good visible if nasal bone length was analysed. The bone growth progress is fast and the values from the start and the end of the same week differ substantially. It could be lead to greater number of false results of the test.

19 - triple screen test TT - there were estimated normal values correlated with BPD (starting from BPD over 30 mm). Mean normal values in BPD partition between 30 and 55 mm: - AFP IU/ml, HCG miu/ml, free E ng/ml. For chromosomal aberrations significant is decrease of the concentration of AFP and free E3 with parallel increase of the HCG concentration. Therefore were calculated cut-off points for the components of the triple test - for AFP and E3 detection compartments are under and for HCG over the 95% confidence intervals. For the detection of the open neural and abdominal defects the cut-off points were indicated over the 95% confidence interval. For the structural defects were observed the sensitivity of 94.4% and specificity of 95%. Then were calculated integrated test characteristics (NT+NB+TT) for the chromosomal aberrations detection sensitivity 94.7%, specificity 99.2%, PPV+ 85,7%, NPV- 99.7%. There were also analysed characteristic of the genetic sonogram protocol for the structural defects detection: the sensitivity was 80%, specificity 100%, PPV+ 100%, NPV- 99.7%. On the basis of the obtained results and evaluation of the epidemiological data was done a statistical extrapolation on general population of pregnant women in Poland. For the detection of chromosomal aberrations the characteristics of the integrated test (correlated to BPD) was calculated as follows: PPV+ 21.2% and NPV %. The prognostic values means that each fifth amniocentesis could really confirm an aneuploidy. If the screening method remains amniocentesis by each woman over 36 years of age then PPV+ is 0.9% - means that 1 in 100 amniocenteses could detect a chromosomal aberration. Basing on the obstetrical data for polish population in 2002 was found out that there is approximately pregnant women over 36 years of age in a year. Taking into consideration the predictive values of the invasive diagnostic this policy could detect about 200 aneuploidies in a year but complicated by the 100 miscarriages as a side effect of the invasive procedure (0.5%). For the proposed diagnostic schema to detect 200 aneuploidies may be needed to perform about amniocenteses what could be associated with only 5 miscarriages. The ultrasound examinations algorithm (integrated test containing NT and NB) characterised as non-invasive, highly predictive and inexpensive could be introduced in the whole population of pregnant women in Poland. Taking the assumption in 2002 the test would concern about women. The chromosomal aberrations frequency is estimated for 0.3% that makes about 1050 aneuploidies in a year. The integrated test application could result in a detection of about 1000 of the cases (sensitivity 94.7%) and for an definite confirmation of the abnormalities would be needed about 5000 amniocenteses (PPV+ for the population in Poland 21.2%). Recapitulation of the study results: 1. The estimation of the normal values for nasal bone length NB and correction for nuchal translucency NT correlated to biometric parameters CRL and BPD. 2. The correction of the normal values for biochemical triple screen test (AFP, HCG, E3) correlated to BPD (30-55 mm).

20 3. The evaluation of the predictive values of the ultrasound and biochemical tests as markers of chromosomal abnormalities of the fetus. Higher prediction were observed for the correlation with biparietal parameter. 4. The assessment of the predictive values of proposed prenatal diagnostic schema for detection of fetal abnormalities in general obstetrical population in Poland. Conclusions: On the base of the presented results were drawn following conclusions: 1. The new biometric parameter nasal bone length (NB) and corrected nuchal translucency thickness (NT) are useful markers of fetal abnormalities, especially of chromosomal aberrations. 2. High predictive values of the diagnostic schema for the detection of aneuploidies and structural defects recommend its use in correlation with biparietal diameter (BPD). 3. The proposed schema is an effective algorithm for prenatal diagnostic characterised by high prognostic values. 4. The possible introduction of the schema could have an influence on the decrease of the invasive procedures rate what could minimise the miscarriage number as side effect of the amniocenteses. 5. The proposed ultrasound test characterised by a high prediction in the fetal abnormalities detection, low cost of the performance and absolute safeness for the fetus could be introduced to general obstetrical population in Poland. It could help on the one hand in the protection of pregnant women from stress connected with uncertainty about the fetal development. On the other hand it could prevent the family shock in the cases of the abnormalities detection.