ELEKTROFOREZA JAKO METODA ANALIZY BIAŁEK

Transkrypt

1 Ćwiczenie 2 ELEKTROFOREZA JAKO METODA ANALIZY BIAŁEK 2.1.CEL ĆWICZENIA Zapoznanie się z techniką elektroforezy białek, w szczególności elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących i wyznaczenie masy cząsteczkowej na podstawie ruchliwości elektroforetycznej PEPTYDY I BIAŁKA Budowa peptydów oraz białek Peptydy i białka zbudowane są z reszt aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. W zależności od liczby reszt aminokwasowych w cząsteczce peptydu wyróżnia się oligopeptydy (do 10 reszt aminokwasowych, np. dipeptydy, tripeptydy, itd.) oraz polipeptydy, czyli peptydy składające się z licznych reszt aminokwasowych. Przyjęto umownie, że peptydy o masie cząsteczkowej do Da (10 kda) (lub do ok. 90 reszt aminokwasowych) to polipeptydy, a peptydy o masie cząsteczkowej przekraczającej tę wartość to makropeptydy, czyli białka. Największe pojedyncze łańcuch białek mogą być zbudowane z kilku tysięcy aminokwasów. Na przykład tripeptydem jest glutation (γ-glutamylocysteinyloglicyna) związek występujący we wszystkich tkankach roślinnych i zwierzęcych, a nonapeptydami: oksytocyna i wazopresyna - hormony wydzielane przez tylny płat przysadki mózgowej. Właściwości chemiczne i fizyczne peptydów i białek są pochodną właściwości aminokwasów wchodzących w ich skład. Ze względu na możliwość występowania wiązania peptydowego w dwóch formach rezonansowych, wiązanie C-N ma częściowo charakter wiązania podwójnego, tzn. nie wykazuje swobodnej rotacji (rysunek 2.1). Rys Formy rezonansowe wiązania peptydowego Oprócz tzw. struktury pierwszorzędowej (sekwencji aminokwasów), w białkach wyróżnia się jeszcze trzy poziomy organizacji strukturalnej: struktury II-, III-rzędowe i IV-rzędowe w białkach podjednostkowych. Przestrzenne ukształtowanie cząsteczki białka (konformacja) wynika z sekwencji aminokwasów i "dążenia" układu (cząsteczki białka i środowiska) do osiągnięcia stanu o najniższej energii. Sekwencja aminokwasowa białka determinuje w sposób jednoznaczny (w danych warunkach środowiska) jego strukturę przestrzenną. Struktury II-rzędowe to lokalne struktury przestrzenne utworzone przez kolejne aminokwasy w łańcuchu polipeptydowym. Struktury drugorzędowe są stabilizowane przez wiązania wodorowe pomiędzy grupami atomów tworzącymi Wersja

2 wiązania peptydowe. Typowe, regularne struktury drugorzędowe to: α-heliks, struktura β (dywanowa lub pofałdowanej kartki) i zakręt β. Struktura trzeciorzędowa opisuje rozmieszczenie w przestrzeni całego łańcucha polipeptydowego. Oddziaływaniami determinującymi powstanie struktury trzeciorzędowej są oddziaływania grup bocznych aminokwasów ze środowiskiem (najczęściej wodnym, ale np. dla białek błonowych - lipidowym) oraz oddziaływania wodorowe, jonowe i van der Waalsa pomiędzy grupami bocznymi aminokwasów. Niekiedy struktura trzeciorzędowa jest stabilizowana mostkami disiarczkowymi. Mostki te mogą łączyć fragmenty tego samego łańcucha lub, w przypadku białek o strukturze IV-rzędowej, różne łańcuchy polipeptydowe. Strukturę IV-rzędową posiadają białka składające się z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego np. insulina (rys. 2.2.), hemoglobina, immunoglobuliny. Struktura ta powstaje z powiązania ze sobą kilku łańcuchów polipeptydowych, z których każdy ma swoją własną strukturę I-, II- i III-rzędową. Dopiero w wyniku właściwego dopasowania tych łańcuchów powstaje biologicznie aktywna cząsteczka białka. Rys Insulina - hormon zbudowany z dwóch łańcuchów polipeptydowych Ze względu na kształt cząsteczki rozróżniamy białka globularne i fibrylarne (włókienkowe). W białkach fibrylarnych łańcuchy polipeptydowe są rozciągnięte, a ich kształt przypomina długą płytkę. W białkach globularnych łańcuchy są zwinięte w zwartą strukturę sferyczną (globulę). Metodami badawczymi o największej dokładności, stosowanymi przy badaniu struktury przestrzennej białek, są krystalografia rentgenowska i dwukierunkowy magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) Właściwości peptydów oraz białek W określonym ph środowiska, powyżej lub poniżej pi, białka maja ładunek odpowiednio ujemny lub dodatni, w wyniku czego zostają otoczone dipolowymi cząsteczkami wody. Wokół cząsteczek białka powstaje warstwa solwatacyjna (otoczka wodna). Właściwość ta warunkuje zawieszenie białek w roztworze (tzw. koloidalnym). Pozbawienie cząsteczek białka ładunku lub otoczki wodnej prowadzi do łączenia się pojedynczych cząsteczek w agregaty i tworzenia się osadu (koagulacja). Dzięki temu, że białka o różnym pi w tym samym ph środowiska będą miały różny ładunek i powinowactwo do wody, możliwe jest ich frakcjonowanie. Wytrącanie poszczególnych białek z roztworu otrzymuje się przez selektywne pozbawianie ich ładunku, które można uzyskać w wyniku: zobojętnienia cząsteczek białka odpowiednimi Wersja

3 przeciwjonami, doprowadzenie ph roztworu do pi danego białka. Wytrącanie białek uzyskuje się także przez usunięcie warstwy solwatacyjnej, dodając związki o wyższym powinowactwie do wody niż cząsteczka białka (wysalanie) lub też zmniejszenie ilości dipolowych cząsteczek wody na powierzchni białka w wyniku dodania rozpuszczalnika o niskiej stałej dielektrycznej (etanol, aceton). Aby uzyskać natywne białka, należy proces prowadzić w niskiej temperaturze (0-5 o C) i dość wolno (np. powolny wzrost stężenia soli lub rozpuszczalnika). Zbyt nagłe i drastyczne zmiany środowiska będą prowadziły do zniszczenia struktur białka (denaturacja). Denaturacją nazywane są wszystkie zmiany w strukturze cząsteczki białka, prowadzące do utraty właściwości biologicznych (jest to przejście od wysoko uporządkowanej i rozwiniętej struktury do nieuporządkowanych łańcuchów polipeptydowych z jednoczesną utratą właściwości biologicznych). Denaturacja cząsteczek białka, polegająca na zniszczeniu słabych oddziaływań stabilizujących cząsteczkę, najczęściej jest odwracalna, zniszczenie wiązań kowalencyjnych na ogół prowadzi do denaturacji nieodwracalnej. Do denaturacji dochodzi pod wpływem czynników chemicznych lub fizycznych. Do czynników denaturujących należą: duże stężenia soli nieorganicznych, jony metali ciężkich, silne kwasy, zasady, reakcje utlenienia i redukcji, wysoka temperatura, promieniowanie UV, rentgenowskie, uszkodzenia mechaniczne. Rozpuszczalniki organiczne obniżające potencjał elektrokinetyczny (alkohole, aceton, eter dietylowy) i detergenty osłabiają wiązania hydrofobowe cząsteczek białka; oddziaływują bezpośrednio z naładowanymi grupami na powierzchni cząsteczki, przez co dezorganizują warstwę solwatacyjną. Działanie denaturujące tych związków pojawia się przy stosowaniu ich w większych stężeniach lub po dłuższym czasie działania i często w wyższych temperaturach (powyżej 30 o C). Do selektywnego wytrącania białek stosuje się najczęściej siarczan(vi) amonu, a niekiedy siarczan(vi) magnezu lub etanol. Różnice stężeń tych odczynników, w których poszczególne rodzaje białek dają się wysalać, służą do rozdzielenia mieszanin różnych rodzajów białek. Globuliny w środowisku o ph 5-6 wytrącają się już przy stężeniu 15% etanolu, albuminy w środowisku o ph 4,8 przy 40% stężeniu etanolu. W przypadku albumin w roztworze o ph znacznie różniącym się od pi (4,8) konieczne jest użycie wyższych stężeń etanolu ELEKTROFOREZA Uwaga! Wiadomości dotyczące samego zjawiska elektroforezy są tylko przypomnieniem, materiału który powinien być opanowany na laboratorium,,chemia Analityczna". Przyłożenie pola elektrycznego do roztworu wodnego elektrolitu zawierającego cząsteczki obdarzone nierównomiernym ładunkiem elektrycznym (makrojony) zawsze powoduje ruch jonów, zarówno elektrolitu jak i makrojonów do elektrody o przeciwnym znaku. Przemieszczaniu jonów zawsze towarzyszą zjawiska fizyczne nazywane elektrolizą i elektroforezą. Elektroliza jest procesem zachodzącym ma powierzchni elektrod i polega na odkładaniu się substancji pochodzących z roztworu pod wpływem prądu. Procesy te opisywane są prawami elektrolizy Faraday'a (patrz wykład Chemia fizyczna). Elektroforeza natomiast jest to proces elektrokinetyczny zachodzący w elektrolicie polegający na przemieszczaniu się jonów i makrojonów w polu elektrycznym w zależności od ich ruchliwości. Różnice w ruchliwości wynikają z różnic w ładunku elektrycznym cząsteczek, ich kształtu, a także ośrodka w którym sie znajdują i natężenia prądu elektrycznego. Wersja

4 Elektroforeza może zachodzić w roztworze (elektroforeza swobodna) lub w nośniku, którym mogą być różne substancje takie jak bibuła, naturalne żele (dekstran, agaroza, agar) lub żele syntetyczne (poliakrylamid). Zadaniem nośnika jest nie tylko stabilizacja elektrolitu, ale przede wszystkim lepsze rozdzielenie makrocząsteczek. Szczególnie zastosowanie nośników porowatych (agaroza, poliakrylamid) potęguje efekt rozdziału poprzez frakcjonowanie na zasadzie sita molekularnego. Metody elektroforetyczne stosowane w praktyce są pochodnymi lub kombinacją trzech rodzajów separacji. Są to: elektroforeza strefowa, izotachoforeza i ogniskowanie izoelektryczne (rys.2.3.). Rys.2.3. Rodzaje metod elektroforetycznych [1] - elektroforeza strefowa (ang. Zone electophoresis) - podstawowy i najczęściej stosowany rodzaj elektroforezy. Odbywa się w nośniku, którego elektrolit ma w całej objętości stałe ph. Różnica dystansów migracji poszczególnych jonów (w ciągu określonego czasu) w bezpośredni sposób wynika z różnicy ruchliwości elektroforetycznej. - izotachoforeza (ang. isotachophoresis) - rozdział odbywa się w nośniku, w którym występuje nieciągłość ph. Makrojony migrują w obszarze pomiędzy dwoma systemami elektrolitów o różniej wartości ph i różnej ruchliwości jonów elektrolitu. Elektrolit wiodący zawiera jony o dużej ruchliwości, większej od ruchliwości jonów próbki, natomiast elektrolit zamykający zawiera jony o bardzo małej ruchliwości. W obszarze pomiędzy tymi elektrolitami znajduje się próbka. Wszystkie jony - wiodące, zamykające i rozdzielane migrują z tą samą prędkością, ale w ściśle określonym porządku, od najbardziej do najmniej ruchliwych. Wynikiem tego rodzaju elektroforezy jest uporządkowanie makrojonów, przy czym zachodzi ono na granicy dwóch systemów elektrolitów. Uzyskuje się w ten sposób dodatkowo efekt zagęszczenia makrojonów w malej objętości próbki. - ogniskowanie izoelektryczne (ang. isoelectricfocusing) - rozdział przeprowadza się w nośniku, w którym wartość ph buforu zmienia się w sposób ciągły, od wartości najwyższej przy katodzie do wartości najniższej przy anodzie. Ustalenie gradientu ph możliwe jest dzięki Wersja

5 zastosowaniu specjalnych nośników ph nazywanych amfolinami. Amfoliny są to mieszaniny różnych związków o charakterze amfoterycznym (homologi kwasów poliaminopolikarboksylowych) i o różnym punkcie izoelektycznym. Otrzymuje się je przez kopolimeryzację, np. amfolina Pharmalytes jest to kopolimer glicyny, glicyloglicyny, innych amin i epichlorohydryny o masie Da. Amfoteryczne substancje (białka, peptydy) wędrują w polu elektrycznym do elektrod o znaku przeciwnym ich ładunkowi. Napotykając po drodze zmieniające się wartości ph elektrolitu zatrzymują się w miejscu, w którym ph=pi. Uzyskuje się w ten sposób separację biomolekuł zgodnie z ich pi. W biochemii najczęściej wykorzystuje się elektroforezę żelową. Żele agarozowe i poliakrylamidowe mają postać przestrzenne usieciowanych struktur o porach wielkości porównywalnej z rozmiarami typowych makrojonów, a zatem większe cząsteczki doświadczają większych oporów ruchu w polu elektrycznym, czyli wędrują wolniej niż cząsteczki mniejsze (Rys. 2.4). Dodatkowo można zwiększyć efekt separacji przez zastosowanie żeli gradientowych, czyli takich w których gęstość sieciowania rośnie wraz z drogą migracji. Akrylamid pozwala przygotować żele o bardzo gęstym usieciowaniu i małych porach, co umożliwia rozdzielenie cząsteczek białek o masach kda lub polinukleotydów o wielkości pz. Nośniki agarozowe charakteryzują się znacznie mniejszym sieciowaniem i większymi porami, więc stosuje się je do rozdziału większych białek np. immunoglobin IgM (-1000 D a ) oraz fragmentów kwasów nukleinowych ( pz). Rys Elektroforeza w porowatym żelu [2] Elektroforezę białek prowadzi się najczęściej w żelu poliakrylamidowym, w skrócie nazywa się ją PAGE (ang. polyacrylamidegelelectrophoresis). Żel poliakrylamidowy ma wiele zalet: jest łatwy i szybki w przygotowaniu, chemicznie obojętny, bezbarwny i pozbawiony ładunków elektrostatycznych. Odznacza się dużą wytrzymałością mechaniczną i termiczną, a także ma określone rozmiary oczek sita molekularnego. Wielkość oczek sieci zależy od proporcji pomiędzy monomerami substancji polimeryzujących: akrylamidu i substancji sieciującej N,N -metylenobisakrylamidu (pot. bis-akrylamid). Od ilości bis-akrylamidu w mieszaninie zależy liczba wiązań poprzecznych, która decyduje o gęstości sita molekularnego. Do przeprowadzenia polimeryzacji konieczny jest dodatek inicjatora czyli nadsiarczanu(v1) amonu (NH 4 ) 2 S (APS), który pod wpływem katalizatora N,N,N',N'-tetrametylo-etylenodiaminy (TEMED) rozpada się na wolne rodniki Wersja

6 tlenowe, pod wpływem których tworzą się rodniki akrylamidowe i zostaje rozpoczęta reakcja polimeryzacji (rys. 2.5). a) S 2 O SO 4 -. Rys 2.5. Reakcja polimeryzacji żelu poliakrylamidowego [1,3]:a) rozpad APS na rodniki, b) inicjacja polimeryzacji, c) reakcja polimeryzacji Uwaga! Należy zawsze pamiętać, że akrylamid w postaci monomerycznej jest bardzo silną neurotrucizną i nawet po procesie polimeryzacji stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia, ponieważ w objętości żelu mogą pozostawać wolne monomery. Pracując z akrylamidem należy zawsze używać rękawiczek. W praktyce przygotowuje się żele poliakrylamidowe 3-40%, gdyż żele o stężeniu akrylamidu mniejszym niż 3% łatwo się kruszą, o większym zaś niż 40% są łamliwe. Elastyczne i w pełni przezroczyste żele uzyskuje się kiedy stosunek akrylamidu do bis-akrylamidu wynosi od 15:l do 40: 1. Własności żelu opisuje się dwoma parametrami. Najczęściej mówi się o całkowitym stężeniu akrylamidu (T[%]): T[%] = (akrylamid + bis-akrylamid) [g] 1 objętość [ml]) x 100% Wersja

7 Dopełniającym parametrem jest stosunek wagowy ilości substancji sieciującej do sumy akrylamidu i substancji sieciującej (C[%]): C[%] = (bis-akrylamid [g] 1 (akrylamid + bis-akrylamid) [g]) x 100% Wraz ze wzrostem wartości T maleje średni rozmiar porów. Natomiast udowodniono, że minimalny rozmiar porów (przy zadanej wartości T) uzyskuje się dla C=5%. Powyżej i poniżej tej wartości rozmiary porów wzrastają. Żele o różnym stosunku akrylamid/bis-akrylamid mają różne zastosowanie (tabela 2.1), zazwyczaj pracując z białkami stosuje się roztwory monomerów o C=2,6%. Tabela 2.1. Zastosowanie roztworów monomerów w zależności od wartości T/C (dla 40% roztworu monomerów) Lp. Skład akrylamid/bisakrylamid C [%] T [%] Zastosowanie 1 19 : 1 5,0 40 Sekwencjonowanie DNA 2 29 : 1 3,3 40 IEF, SDS-PAGE 3 37,5 : 1 2,6 40 SDS-PAGE Ponieważ akrylamid i bis-akrylamid są silnymi truciznami wygodnym rozwiązaniem jest wykorzystanie gotowych roztworów monomerów, chociaż w przypadku nietypowych zastosowań można roztwory przygotować samodzielnie. Zazwyczaj stosuje się roztwory o T=30% lub 40% (w/v). Drugim parametrem narzucającym stężeniu monomerów w gotowym żelu są masy cząsteczkowe białek, kt6re będą rozdzielane. Standardowo dla białek o masach kda stosuje się żele o stężeniu 12,5%. Żelem do polimeryzacji napełnia się płytki o określonej grubości lub rurki szklane. Podczas elektroforezy stosuje się różne układy elektrolitów w zależności od rodzaju analizowanych białek. Początkowo elektroforeza prowadzona była w tzw. układzie ciągłym, który wykorzystywał ten sam bufor jako elektrolit i środowisko, w którym polimeryzuje żel (metoda Webera i Osborna [4]). Obecnie jednak głównie wykorzystuje się metodę Laemmli'ego w układzie nieciągłym [5], w której stosuje się różne bufory elektroforetyczny i do przygotowania żelu. Układ nieciągły wykorzystuje względnie duże stężenie molowe elektrolitu w żelu rozdzielającym (resolving gel) (0,375 M Tris-HC1; ph 8,8) oraz małe stężenie molowe buforu elektroforetycznego (0,025 M Tris; 0,192 M glicyna). Jakość rozdziału białek w takim układzie rośnie dzięki zastosowaniu żelu zagęszczającego (starking gel) o większej porowatości, niższym stężeniu i ph (0,125 M Tris-HC1; ph 6,8). Elektroforeza w układzie nieciągłym wykorzystuje odmienną ruchliwość elektroforetyczną jonów chlorkowych i glicynianowych przy ph 6,8, co powoduje przesuwanie się naniesionej próbki jako ostrego pasma w żelu zatężającym, przed rozdziałem w żelu rozdzielającym (ph 8,8). Powoduje to, że szerokość pasma wchodzącego w żel rozdzielający nie zależy od objętości naniesionej próbki. Na początku rozdziału, po włączeniu prądu, ujemnie naładowane jony glicynianowe wchodząc w żel zagęszczający tracą ładunek (pigly = 6,7) ponieważ równowaga dysocjacji przesuwa się w stronę jonu obojniaczego (rys.2.6a). W tych warunkach białka i barwny wskaźnik czoła elektroforezy (błękit bromofenolowy) obecne w nałożonej próbce wykazują większą ruchliwość, ale mniejszą ruchliwość niż jony chlorkowe. Powoduje to, że białka lokalizują się pomiędzy tymi rodzajami jonów, aż osiągną granicę żelu Wersja

8 rozdzielającego o ph 8,8. W tym ph jony glicynia nowe odzyskują ładunek i wyprzedzają białka, które migrują w żelu z szybkością zgodną z ich masami cząsteczkowymi (Rys. 2.6b). a) H 3 NCH 2 COO - H 2 NCH 2 COO - H + + b) Rys Elektroforeza w układzie nieciągłym: a) równanie dysocjacji glicyny; b) przebieg elektroforezy [1] Techniki elektroforetyczne wykorzystujące żele poliakrylamidowe dzieli się na dwie kategorie: przebiegające w warunkach denaturujących (najczęściej stosuje się metodę SDS-PAGE) lub natywnych. Do denaturacji białek używa się najczęściej dodecylosiarcznu sodu (SDS), który oddziaływuje w podobny sposób z większością polipeptydów, ponieważ ujemnie naładowane cząsteczki detergentu wiążą się z białkami w stałym stosunku wagowym (1,4 g SDS na 1 g białka) i maskują ich natywny ładunek. Standardowo wystarczające są roztwory zawierające 0,1% w/v SDS, także w buforze elektroforetycznym. Kompleksy SDS-białko charakteryzują się stałym stosunkiem ładunku do masy i identycznym kształtem, ponieważ SDS powoduje rozwinięcie struktur globularnych. Aby uzyskać najlepszy efekt próbkę gotuje się przez 2-5 min i dodatkowo, w przypadku białek składających się z kilku podjednostek lub zwierających wiązania disiarczkowe, stosuje się dodatek czynnika redukującego (najczęściej jest to 2-merkaptoetanol lub DTT). Kompleksy SDS-białko wędrują wtedy od katody do anody, przy czym ich ruchliwość jest funkcją tylko masy cząsteczkowej. Na podstawie stwierdzonej doświadczalnie zależności liniowej między względną ruchliwością elektroforetyczną a logarytmem masy cząsteczkowej można wyznaczyć masę nieznanego białka (Rys. 2.7.). Wersja

9 Rys Półlogarytmiczny wykres zależności ruchliwości elektroforetycznej od masy cząsteczkowej białka w warunkach denaturujących [1] W elektroforezie w warunkach natywnych białka nie są poddawane działaniu żadnych czynników denaturujących, więc ich wędrówka wykorzystuje tylko posiadany przez nie ładunek elektryczny. W elektroforezie tej migracja zależy nie tylko od masy cząsteczkowej, ale tez od ładunku i kształtu cząsteczki. Dlatego też metoda ta jest rzadziej stosowana i ma znaczenie w analizie oddziaływań białko-białko lub badania kompleksów białkowych. Elektroforezę PAGE białek prowadzi się w aparatach, które wyposażone są w dwa naczynia elektroforetyczne zaopatrzone w elektrody platynowe, w których mocuje się płyki z żelami. Do wizualizacji białek rozdzielonych podczas elektroforezy stosuje się barwniki wykazujące duże powinowactwo do nich. Najczęściej wykorzystuje się barwniki z rodziny błękitu brylantowego Coomassie R-250 i G-250. Barwniki te określane są jako kwasowe, rozpuszcza się je w alkoholu (metanol lub etanol) z dodatkiem kwasu octowego. Alkohol spełnia dwie funkcje: rozpuszcza barwnik i wytraca białko w żelu co zmniejsza jego dyfuzję podczas barwienia, natomiast kwas octowy umożliwia tworzenie kompleksu pomiędzy barwnikiem a grupami aminowymi białkiem. Tworzenie kompleksu stabilizują wiązania wodorowe, van der Waalsa i hydrofobowe. Wiązanie barwnika wykazuje liniową zależność od ilości białka w prążku w dużym zakresie stężenia białka (do 20 mg/ml). Nadmiar barwnika odpłukuje się roztworem alkoholu z kwasem octowym. Metoda ta pozwala na detekcję co najmniej 1 µg białka w prążku (Rys.2.8c). Metodą bardziej czułą ( ng białka w prążku), ale jednoczenie bardziej skomplikowaną i powodującą większe zniszczenie żelu podczas barwienia jest zastosowanie metody srebrowej (barwienie roztworem AgNO 3 ) (Rys.2.8b.). Należy także wspomnieć o także bardzo czułych metodach z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych np. SYPRO Ruby (czułość 5 ng) (Rys.2.8a). Wersja

10 Rys Porównanie czułości barwienia [8]: a) SYPRO Ruby, b) solami srebra, c) błękitem brylantowym Coomassie R-250, 2.4. SKRÓTY I WZORY a) ddh 2 O - woda dwukrotnie destylowana b) APS - nadsiarczan(v1) amonu (NH 4 ) 2 S 2 O 8 c) TEMED - N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina H 3 C N CH 3 N CH3 d) Tris - 2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propandiol (substancja buforująca) HO HO CH 3 NH 2 OH e) Tris-HC1 - bufor Tris (ph w zależności od ilości HC1) f) SDS - dodecylosiarczan sodu g) 2-ME -2-merkaptoetanol h) DTT - 1,4-dimerkapto-2,3-butanodiol i) Coomassie R O O S O N CH 3 O CH 3 (CH 2 ) 10 CH 2 O S O - Na + HS OH O SH H OH HO H SH CH 3 Na + O N H N O S O O - H 3 C Wersja

11 2.5. WYKONANIE ĆWICZENIA Aparatura 1. Aparat do elektroforezy Mini-Protean Tetra Cell z wyposażeniem (Bio-Rad): a) zbiornik z modułami do elektroforezy; b) płytki szklane z grzebieniami; c) prowadnice; d) statyw do wylewania żeli 2. Zasilacz prądu stałego 3. Pipety automatyczne 20 µ1; 200 µ1; 1000 µ1 4. Termoblok 5. Wytrząsarka Odczynniki i materiały 1. Do przygotowania 12,5% żelu SDS-PAGE potrzebne są: a) Roztwór monomerów: 40% roztwór akrylamidu-bisakrylamidu w stosunku 37,5: 1 b) Bufor żelowy A: 1,5 M Tris-HC1 ph 8,8 c) Bufor żelowy B: 0,5 M Tris-HC1 ph 6,8 d) 20% SDS e) 10% APS f) TEMED g) ddh 2 O 2. Bufor redukujący do próbek (5x): M Tris-11C1, ph 6.8; 50% glicerol; 5% SDS; 0.05%; Bromofenol blue; 5% 2-ME 3. Bufor nieredukujący do próbek (5x): M Tris-HC1, ph 6.8; 50% glicerol; 5% SDS; 0.05%; Bromofenol blue 4. Bufor elektrodowy (10x): 0,25 M Tris; 1,92 M glicyna, 1% SDS. Roztwór roboczy (lx), przygotuj przez zmieszanie 100 ml buforu i 900 ml ddh Roztwór do barwienia żeli: 45% metanol, 10% kwas octowy, 0,25% Coomassie R Roztwór odbarwiający A: 45% metanol, 10% kwas octowy 7. Roztwór odbarwiający B: 10% kwas octowy Wersja

12 8. Mieszanina standardów białkowych M: β-galaktozydaza (116 kda), albumina z surowicy wołowej (66kDa), owalbumina (45 kda), dehydrogenaza mleczanowa (35 kda), REaza Bsp98I (25 kda), β-laktoglobulina (18,4kDa), lizozym (14,4kDa) 9. Roztwory białek wzorcowych (W) (0,5 mg/ml w 0,9% chlorku sodu) 9. Roztwór ludzkiej γ-globuliny (1 mg/ml w buforze elektrodowym (lx)) 10. Roztwór ludzkiej kinazy kazeinowej CK2 (1 mg/ml w 0,9% chlorku sodu) Wykonanie Przygotowanie próbek a) Mieszanina standardów białkowych M: próbówka zawiera 10 µl mieszaniny. Zdenaturować przez 2 min w 95 o C. b) Roztwory białek wzorcowych: odmierzyć do probówek eppendorf po 20 µl roztworów β-galaktozydazy (W1), BSA (W2) i mioglobiny(w3), dodać po 5 µl buforu redukującego (2) i denaturować przez min w 95 o C. c) Próbki niezdenaturowane: do dwóch probówek eppendorf odmierzyć po 20 µl roztworów γ-globuliny i kinazy kazeinowej, następnie dodać po 5 µl buforu nieredukującego (3). Nie denaturować! Oznaczyć je jako 1 i 3. d) Próbki zdenaturowane: do dwóch probówek eppendorf odmierzyć po 20 µl roztworów γ-globuliny i kinazy kazeinowej, następnie dodać po 5 µ1 buforu redukującego (2) i denaturować przez 2 min w 95 o C. Oznaczyć je jako 2 i 4. UWAGA: Pracując z akrylamidem należy zawsze używać rękawiczek. Przygotowanie mieszanin do polimeryzacji Składnik mieszaniny Żel rozdzielający 12,5 % Żel zagęszczający 4 % Akrylamid/bisakrylamid Bufor żelowy A Bufor żelowy B ddh 2 O 20 % SDS 2,00 ml 2,10 ml - 2,10 ml 30 µl 0,50 ml - 1,10 ml 2,50 ml 20 µl Delikatnie wymieszać Polimeryzacja żelu 10 % APS TEMED 45 µl 6,5 µl 40 µl 8 µl a) Przygotowanie kasety do polimeryzacji: dwie płytki szklane (jedna z przekładkami, druga cieńsza, gładka) dokładnie odtłuścić etanolem i złożyć razem (Rys. 2.9). Płytki umieścić w ramce do wylewania żeli, dbając aby krawędzie płytek były ułożone równo i zacisnąć klamry. Ramkę umieścić w statywie, dokładnie dociskając dolną krawędź do pianki uszczelniającej. b) Polimeryzacja żelu rozdzielającego: w probówce typu falcon o poj. 15 ml przygotować mieszaninę do polimeryzacji żelu rozdzielającego zgodnie z powyższą tabelą. Po dokładnym wymieszaniu przenieść roztwór za pomocą pipety Pasteura pomiędzy płytki do poziomu 1 cm Wersja

13 poniżej krawędzi krótszej płytki. Na powierzchnię nanieść ostrożnie warstwę wody i pozostawić do polimeryzacji na 20 min. c) Polimeryzacja żelu zagęszczającego: zlać wodę znad żelu, a powierzchnię delikatnie osuszyć paskiem bibuły 3mm, uważając żeby nie uszkodzić spolimeryzowanego żelu. Następnie przygotować mieszaninę do polimeryzacji żelu zagęszczającego w próbówce typu falcon 15 ml. Przenieść mieszaninę na żel zagęszczający do krawędzi pyłki (uważać, żeby mieszanina nie spieniła się) i wsunąć grzebień (Rys. 2.9) (pod zębami nie mogą powstać pęcherzyki). Pozostawić do polimeryzacji na 20 min. Elektroforeza a) Płytki z żelem SDS-PAGE umieścić w aparacie do elektroforezy. Nalać buforu elektrodowego pomiędzy płytki, tak aby grzebienie były całkowicie zanurzone, a także do głównego pojemnika do oznaczonego poziomu. Delikatnie wyjąć grzebienie i założyć prowadnice do wprowadzania próbek. b) 10 µl każdej z próbek przenieść do studzienek żelu poliakrylamidowego w kolejności: M, W1, W2, W3, 1, 2, 3, 4. Zamknąć pokrywę i podłączyć zasilacz. Elektroforezę prowadzić przez 30 min pod napięciem 200V. Wyłączyć zasilacz. c) Płytki wyjąć z aparatu, bufor zlać do butelki. Koniec plastikowej szpachelki wsunąć pomiędzy płytki, delikatnie podważyć i rozdzielić płytki. Ostrożnie przenieść żel do plastikowego pojemnika. Żel zalać roztworem do barwienia żeli (5) i umieścić na 5 min na wytrząsarce. Roztwór zlać z powrotem do butelki. Żel odbarwiać w buforze (6) przez 5 min, a następnie zalać go 10% kwasem octowym i pozostawić na wytrząsarce do całkowitego uwidocznienia białek. Rys Przygotowanie kasety i polimeryzacja Wersja

14 Wyniki Odbarwiony żel umieścić pomiędzy dwoma arkuszami folii (np. w koszulce krystalicznej) i zeskanować. Zmierzyć odległości przebyte przez poszczególne białka wzorcowe i obliczyć współczynniki ruchliwości względnej dla poszczególnych białek w stosunku do ruchliwości barwnika (błękitu bromofenolowego). Wykonać wykres zależności ruchliwości względnej białek od ich masy (w skali półlogarytmicznej). Wyznaczyć masy cząsteczkowe podjednostek γ-globuliny i CK2 oraz wyjaśnić różnice w ruchliwości przed i po denaturacji PYTANIA I ZADANIA 1. Narysuj tripeptyd: Ala-Gly-Trp. 2. Scharakteryzuj struktury białek (I-, II-, III- i IV-rzędową) i omów wiązania chemiczne biorące udział w tworzeniu każdej z nich. 3. Podaj przykłady białek o strukturze IV-rzędowej i omów ich budowę. 4. Wyjaśnij na czym polega proces denaturacji białek. Wymień czynniki, które ją powodują. 5. Wymień i krótko omów metody elektroforetyczne. 6. Wyjaśnij na czym polega elektroforeza SDS-PAGE. 7. Wyjaśnij na czym polega elektroforeza w warunkach nieciągłych. 8. Ile gram APS należy odważyć, aby przygotować 15 ml roztworu 10% w/v. 9. Ile gram Tris i glicyny oraz ile ml 20% SDS należy odmierzyć aby przygotować 500 ml buforu elektrodowego 0,25 M Tris; 1,92 M glicyna, 1% SDS. 10. Mając do dyspozycji 1 M NaH 2 PO 4, 5 M NaCl, 1 M DTT i 0,5 M MgCl 2 przygotować 200 ml roztworu o składzie: 20 mm NaH 2 PO 4, 500 mm NaCl, 500 µm DTT, 2 mm MgCl Ile gram Tris należy odważyć, aby przygotować 150 ml 0,5 M roztworu? 2.5. LITERATURA [l] Westermeier, R. Electrophoresis in Practice, Wiley 2005 [2] Berg, J.M.; Stryer, L.; Tymoczko, J.L. Biochemia, PWN 2011 [3] Kłyszejko-Stefanowicz L. Ćwiczenia z Biochemii, PWN 1999 [4] Weber K, Osborn M. J. Biol. Chem. 1968,244, [5] Laemmli UK. Nature1970,227, ; praca rozwijająca metodę w układzie nieciągłym opracowaną przez Ornsteina [6] i Davisa [7] [6] Ornstein L. Ann NY Acad Sci.1964, 121, [7] Davis BJ. Ann NY Acad Sci. 1964, 121, [8] Boyer, R.F. Biochemistry Laboratory- Modern Theory and Techniques (2nd Edition) Wersja