NA ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM

Transkrypt

1 Z48 ELEKTROFOREZA BIAŁEK NA ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM Terminem elektroforeza określa się zjawisko migracji cząstek lub cząsteczek w polu elektrycznym w zależności od posiadanego ładunku. Elektroforeza jako technika rozdzielania substancji została zainicjowana przez Tiseliusa w 1937 roku. Po umieszczeniu w rurce między roztworem buforów mieszaniny protein i po przyłożeniu pola elektrycznego zaobserwował, że składniki próbki migrują w kierunku i z szybkością zdeterminowaną ich ładunkiem oraz ruchliwością. Za tą pracę Tiselius dostał nagrodę Nobla w dziedzinie nauk separacyjnych. Na cząstkę o ładunku elektrycznym q znajdującą się w polu elektrycznym o nateżeniu E działa siła. Siła ta powoduje ruch cząstki (zgodnie z II ZDN jednostajnie przyspieszony). Jednak ruchowi temu przeciwdziała siła lepkości środowiska, która dla cząstki kulistej może być opisana wzorem Stokesa:. W związku z tym, po chwili cząstka zaczyna poruszać się ruchem jednostajnym z prędkością. W praktyce laboratoryjnej stosuje się jednak zazwyczaj wielkość zwaną ruchliwością elektroforetyczną U, tj.. Łatwo zauważyć, iż ruch cząsteczki zależy od parametrów środowiska oraz parametrów cząsteczki. Do tych pierwszych zaliczamy różnicę potencjałów, natężenie prądu, ph środowiska, temperaturę oraz przewodnictwo i lepkość roztworu. Najczęściej podczas elektroforezy staramy się zachować je wszystkie stałe. Wówczas ruch cząsteczki zależy tylko od jej ładunku oraz jej rozmiaru i geometrii, a także masy (w przypadku elektroforezy żelowej). Elektroforezę możemy podzielić ze względu na: - rodzaj nośnika (np. bibułowa, na żelu) - rodzaj stosowanego prądu (np. pulsacyjna)

2 - ze względu na rozdzielny materiał (białka, aminokwasy, RNA, DNA) W naszym doświadczeniu będziemy wykonywać elektroforezę białek na żelu poliakrylamidowym przy stałym napięciu. Kilka słów o białkach Białka pełnią kluczową rolę we wszystkich procesach biologicznych. Ich podstawowymi jednostkami strukturalnymi są aminokwasy, połączone ze sobą wiązaniem peptydowym. Pojedynczy aminokwas jest zbudowany z grupy karboksylowej, aminowej, atomu wodoru oraz charakterystycznej dla danego aminokwasu grupy R, zwanej łańcuchem bocznym. Wszystkie powyższe wiążą się kowalencyjnie z atomem węgla, określanym jako węgiel (alfa). Ze względu na obecność grupy aminowej i karboksylowej w roztworze o ph obojętnym aminokwasy występują zazwyczaj w formie zjonizowanej, jako jony obojnacze (grupa aminowa NH3+ oraz karboksylowa COO-). Stan ten można zmienić poprzez zmianę ph następuje wtedy zmiana jonizacji cząsteczki. Rysunek 1: Budowa i stopień jonizacji aminokwasu w zależności od ph roztworu. Źródło: W białkach powszechnie występuje 20 aminokwasów, których łańcuchy boczne różnią się wielkością, kształtem, ładunkiem elektrycznym, zdolnością do tworzenia wiązań wodorowych oraz reaktywnością chemiczną. Szersze omówienie i charakterystyka grup bocznych znajduje się między innymi w [1]. Dla naszych potrzeb należy zapamiętać, iż każde białko, ze względu na aminokwasy z których jest zbudowane, posiada określoną masę, ładunek

3 oraz kształt (struktura białek patrz [2]). To bogactwo właściwości implikuje olbrzymi zakres funkcji kontrolowanych i realizowanych przez białka. Rodzaje nośników elektroforetycznych Rozdziały elektroforetyczne mogą być prowadzone bezpośrednio w objętości elektrolitu, lub w nośniku elektroforetycznym wypełnionym odpowiednim elektrolitem. W tym drugim przypadku nośnik elektroforetyczny (bibuła, azotan celulozy, agaroza, poliakrylamid i inne) nie tylko stabilizuje elektrolit (m.in. poprzez tłumienie prądów konwekcyjnych), ale często przyczynia się do lepszej separacji makrocząsteczek. Szczególnie zastosowanie porowatych nośników (agarowa, poliakrylamid) potęguje efekt separacji poprzez dodatkowe frakcjonowanie makrocząsteczek na zasadzie sita molekularnego cząsteczki, których rozmiary są małe w porównaniu z porami żelu łatwo w nim wędrują, natomiast cząsteczki znacznie większe od porów są prawie nieruchome. Jako nośnika najczęściej używa się żeli poliakrylamidowych, ponieważ są one chemicznie obojętnie i łatwo się je otrzymuje poprzez polimeryzację poliakrylamidu. Są również, w stosunku do żeli agarozowych, trwalsze. Aby przeprowadzać rozdział elektroforetyczny tylko ze względu na masę cząsteczkową, stosuje się elektroforezę w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących. W tym celu mieszaninę białek rozpuszcza się najpierw w roztworze dodecylosiarczanu sodu (SDS). Aniony tego detergentu wiążą się z łańcuchami głównymi białka nadając powstałemu kompleksowi duży ujemny ładunek wypadkowy proporcjonalny do masy białka i zazwyczaj znacznie większy niż ładunek natywnego białka, który staje się tym samym nieistotny. Parametry elektryczne Zjawisko elektroforezy zachodzi dzięki obecności pola elektrycznego. Siła, z jaką pole to oddziałuje na ładunek elektryczny jonu jest proporcjonalna do natężenia tego pola (E [V/m]), a ta wielkość jest z kolei proporcjonalna do napięcia U [V] przyłożonego do elektrod. W zakresie niskich sił jonowych istnieje prosta relacja wynikająca z prawa Ohma regulująca zależność pomiędzy przyłożonym napięciem U, a płynącym w wyniku tego prądem I [A] oraz oporem elektrycznym (rezystancją) R [Ω] elektrolitu: V = I R. Podczas przepływu prądu elektrycznego, w wyniku wykonywania pracy przeniesienia ładunku elektrycznego przez pole, na opornościach obwodu tracona jest moc P [W]. Pracy tej towarzyszy wydzielanie się ciepła, zwanego ciepłem

4 Joule'a. Ilość wydzielonego ciepła Q [J] można obliczyć korzystając z równania: Q = U I t. Oczywiście ciepło to jest wydzielane na wszystkich oporach obwodu, ale największy udział w tym zjawisku posiada elektrolit. Zasilacze stosowane do elektroforezy zwykle mogą utrzymywać stałą wartość jednego z parametrów: prądu I, napięcia U lub mocy P. Dla pozostałych parametrów ustala się tylko górny limit wartości. W ciągu trwania elektroforezy oporność elektrolitu ulega zmianom - zwykle obniża się ze wzrostem temperatury wynikającym z ciepła Joule'a. W zależności od składu elektrolitu oraz wyboru stabilizowanego parametru obserwuje się wzrost lub spadek ilości wydzielanego ciepła. I tak przy stałym prądzie wzrasta oporność układu i wraz z tym wzrasta ilość wydzielanego ciepła. Układ wymaga aktywnego odprowadzania ciepła. Z drugiej strony, gdy stabilizowane jest napięcie, ze wzrostem oporu następuje ograniczenie prądu, a w ślad za tym spadek ilości oddawanego ciepła. Układ nie wymaga termostatowania, ale znacznie wydłuża się czas trwania elektroforezy. Układ doświadczalny Układ doświadczalny jest pokazany na poniższym rysunku: Znajdują się na nim kolejno: Rysunek 2: Zestaw do elektroforezy. Opis w tekście. 1. Komora do przeprowadzania rozdziału elektroforetycznego wraz z kablami zasilającymi

5 2. Grzebienie, tworzące dołki dla wprowadzenia białek w przygotowywanych żelach 3. Płytki podstawkowe (grubsze) 4. Płytki nakrywkowe (cieńsze) 5. Przegrody ułatwiające wprowadzanie białek do żelu 6. Stojak i okienka do przygotowywania żeli W okienkach (rysunek 3) umieszcza się założone na siebie płytki nakrywkową i postawową. Dociska się je poprzez otwarcie okienka jak na rysunku poniżej. Całość montuje się na stojaku na gumowych paseczkach, zapobiegającym wypływaniu żelu. W tak ustawionym układnie można rozpocząć przygotowanie żeli. Rysunek 3: Po lewej: "okienko" do umieszczania płytek. Po prawej: Dwustanowiskowy stojak do przygotowania żeli. W komorze do rozdziału elektroforetycznego warto wyróżnić dwie kasetki do żeli (rysunek poniżej). Po lewej stronie znajduje się przykład kasetki zamkniętej, po prawej otwartej. Płytki z żelem umieszcza się w szczelinie pomiędzy białym wnętrzem a zielonymi, ruchomymi elementami.

6 Rysunek 4: Kasetka z komory do umieszczania żeli. Całość zasilana jest przy pomocy zasilacza, którego obsługa jest bardzo intuicyjna. Rysunek 5: Zasilacz do układu elektroforetycznego. Przebieg ćwiczenia Poliakrylamid w postaci ciekłej jest substancją neurotoksyczną dlatego należy zachować odpowiednie warunki bezpieczeństwa. Przed przygotowaniem roztworów należy ubrać fartuch laboratoryjny, rękawiczki gumowe oraz okulary laboratoryjne a cała procedura powinna być wykonana pod dygestorium. Odczynniki: 1. Akrylamid 2. Bisakrylamid 3. 10% SDS 4. TEMED 5. 10% Nadsiarczan amonu (APS) 6. 1,5 M Bufor Tris-HCl, ph 8,8 7. 0,5 M Bufor Tris-HCl, ph 6,8 8. Bufor redukujący do próbek 9. Bufor elektrodowy

7 Tabela 1: Skład żelu rozdzielającego i zagęszczającego przy założeniu końcowej objętości 5ml, wystarczającej na 2 płytki. Odczynnik Żel dolny Żel górny Odczynnik 12% 4% Woda 3,35 ml 3,0 ml Woda 1,5 M Tris-HCL, ph 8,8 2,5 ml 1,25 ml 0,5 M Tris-HCL, ph 6,8 30% Akrylamid/bisakrylamid* 4,0 ml 0,67 ml 30% Akrylamid/bisakrylamid* 10% SDS 0,1 ml 50 µl 10% SDS 10% APS 50 µl 30 µl 10% APS TEMED 5 µl 3 µl TEMED * 30% T; 2,66% C Akrylamid/bisakrylamid [zobacz: 2, s. 11] Np. 29,2 g akryl amidu; 0,8 g bisakrylamidu; 100 ml wody destylowanej. Żel dolny: Umieścić szklane, odtłuszczone płytki z ogranicznikami w zestawie do polimeryzacji żelu. Przygotować żel rozdzielający o pożądanym stężeniu (stopniu polimeryzacji tabelka) i wprowadzić między płytki do 2/3 wysokości. Nawarstwić wodą destylowaną. Polimeryzacja trwa około 1,5 godziny. Żel górny: Zlać wodę znad żelu dolnego, lekko osuszyć górną krawędź żelu (np. bibułką) i wprowadzić wcześniej przygotowany żel zagęszczający. Włożyć grzebień między płytki i, w razie potrzeby, uzupełnić płynnym roztworem żelowym do maksymalnego wypełnienia przestrzeni między płytkami. Zostawić do polimeryzacji na około pół godziny. Rysunek 6: Schemat żelu do elektroforezy. Źródło: [3].

8 Przygotowanie próbek: Przygotować próbki wybranych przez prowadzącego białek zgodnie z instrukcją prowadzącego (sposób przygotowania zależy od rodzaju białek). Rozcieńczyć przygotowane próbki białek buforem do próbek w stosunku próbka:bufor = 1:3 i inkubować we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut. Inkubowanie w łaźni wodnej można zastąpić umieszczeniem próbek na łaźni olejowej lub w gotującej się wodzie. Montowanie zestawu: Delikatnie usunąć grzebień spomiędzy płytek. Zamontować płytki szklane w kasetkach (holderach), a następnie całość umieścić w komorze elektroforetycznej. Wlać bufor elektrodowy do wysokości uzależnionej od ilości wykorzystywanych kaset (1-dolna kreska, 2-górna kreska). Nałożyć przygotowane próbki (5-40 µl) oraz podobną objętość roztworu wzorcowych białek do studzienek wytworzonych przez grzebień. Zamknąć pokrywę. Uwaga: w przypadku pomiaru 1 lub 3 żeli włożyć odpowiednio zaślepkę. Pomiar przy pomocy jednej kasetki (1 lub 2 żele) należy przeprowadzać w części podłączanej bezpośrednio do elektrod. Przeprowadzenie pomiaru: Włączyć zasilacz. O jego działaniu informują pojawiające się w roztworze pęcherzyki. Prowadzić rozdział przy stałym napięciu U=100V przez około pół godziny (do czasu osiągnięcia przez próbki żelu rozdzielającego). Następnie zmienić wartość napięcia na 160V i prowadzić rozdział do czasu osiągnięcia końca płytki przez front z barwnikiem. Po tym czasie odłączyć zasilanie, wylać z komory bufor, wyciągnąć z kasetek płytki z żelem.

9 Rysunek 7: Drabinka uzyskana na żelu przy wykorzystaniu różnych roztworów wzorcowych. Źródło: Wybarwiane otrzymanych żeli: Delikatnie oderwać górną płytkę od dolnej. Oderwać żel zagęszczający. Delikatnie przenieść cały żel rozdzielający do osobnego pojemnika i zalać błękitem Comassiego na około godzinę. Po tym czasie powinny się pojawić wyraźne, błękitne prążki białek. Zlać roztwór barwiący, zalać żel wodą destylowaną, przepłukać trzykrotnie lub więcej w razie potrzeby. Rysunek 8: Przykład elektroforezy w obecności SDS. Źródło: [3].

10 Analiza otrzymanych żeli W wyniku poprzednich czynności otrzymujemy charakterystyczną drabinkę prążków. Pod każdym z dołków w którym umieściliśmy białko obserwujemy charakterystyczne prążki, których odległość jest zależna od masy białka. Zwyczajowo w pierwszej (i ostatniej) kolumnie umieszcza się roztwór wzorcowy. Najprostszą metodą analizy białek jest skorzystanie z faktu, iż dla znakomitej większości z nich logarytm masy jest zależny liniowo od ich ruchliwości elektroforetycznej. Ruchliwość elektroforetyczną definiujemy jako, gdzie d i jest dystansem przebytym przez substancję rozdzielaną, zaś d w odległością przebytą przez czoło elektroforezy. Dla roztworu wzorcowego (o znanej masie poszczególnych prążków) mierzymy odległości kolejnych prążków, a następnie tworzymy wykres log(mw) od R f. Do otrzymanych punktów dopasowujemy prostą, na podstawie parametrów której określamy masy nieznanych białek w pozostałych kolumnach. Powyższe zabiegi nazywamy analizą jakościową, mająca na celu pokazanie obecności danego białka i określenie jego względnej migracji w nośniku elektroforetycznym poprzez porównanie położenia poszczególnych prążków i opisanie zaobserwowanego obrazu. Analiza ilościowa wymaga zastosowania technik rachunkowych, uwzględniających zarówno informację o położeniu analizowanych prążków, jak i o intensywności wybarwienia tych prążków. Do tego celu stosuje się technikę densytometrowania analizowanego żelu, membrany lub ich elektronicznie przetworzonych obrazów. W tym celu wykorzystamy dostępny zestaw Gel Doc System. Instrukcja do niego znajduje się przy komputerze. Uzyskane wyniki mogą być porównane z wynikami pomiarów innymi metodami np. metodą spektrofotometryczną. Bibliografia: [1] Biochemia, L. Stryer, s [2]

11 [3] Elektroforeza przykłady zastosowań, praca zbiorowa pod redakcją Bogdana Walkowiaka i Violetty Kochmańskiej, s / UWAGA! Pozycja [3] jest OBOWIĄZKOWA dla każdego przystępującego do ćwiczenia.