Spis treści. Definicja

Transkrypt

1 Spis treści 1 Definicja 2 Podstawy fizyczne 3 Czynniki wpływające na przebieg elektroforezy 4 Etapy planowania i wykonania elektroforezy 5 Wybór nośnika elektroforetycznego 5.1 Główne rodzaje nośników elektroforetycznych 6 Rodzaje komór elektroforetycznych 6.1 Elektroforeza kapilarna HPCE (ang. high performance capillary electrophoresis) 6.2 Elektroforeza pionowa 6.3 Elektroforeza pozioma 7 Barwienie próbek 7.1 Barwienie fluoroforami 7.2 Znakowanie radioizotopowe 7.3 Immunobarwienie 7.4 Barwienie enzymatyczne 8 Dokumentacja rezultatów rozdziałów elektroforetycznych 9 Analiza ilościowa i jakościowa żeli elektroforetycznych 10 Ogólne reguły przygotowania próbek do elektroforezy 11 Rodzaje elektroforezy 11 Elektroforeza kapilarna 11 Korzyści 12 Elektroforeza natywna 11 Przygotowanie próbki do badań 13 Elektroforeza denaturująca 13.1 Ograniczenie SDS-PAGE 13.2 Elektroforeza w obecności SDS przygotowanie próbki do badań 13.3 Korzyści z wykorzystania SDS 14 Ogniskowanie izoelektryczne, IEF (isoelectric focusing) 14.1 Przygotowanie próbki 15 Dwuwymiarowa SDS-PAGE 16 Immunoelektroforeza 16.1 Immunodetekcja, blotting 16.1 Western blotting (białka) 16.2 Southern blotting (DNA) 16.3 Northern blotting (RNA) 17 Immunoelektroforeza dyfuzyjna Definicja Elektroforeza jest to ruch naładowanych elektrycznie cząstek rozpuszczonych bądź zawieszonych w roztworze elektrolitu w polu elektrycznym pod wpływem przyłożonego napięcia.

2 Podstawy fizyczne W polu elektrycznym E cząsteczka o ładunku q porusza się z prędkością v: gdzie: f współczynnik tarcia (zależny od właściwości cząsteczki, wielkości, masy, kształtu). Definiujemy ruchliwość niezależną od warunków eksperymentu jako: Ponieważ f zależy od masy to ruchliwość μ zależy od stosunku ładunek/masa. Jest to opis idealny, w rzeczywistości molekuła może oddziaływać z medium. W środowisku wodnym, w polu elektrycznym poruszają się jony posiadające otoczkę hydratacyjną. Mamy do czynienia z uporządkowanym układem dipoli wodnych. Uporządkowanie to wpływa na możliwość ruchu jonów, a właściwości otoczki hydratacyjnej zależą od rozmiaru jonu, zgromadzonego na nim ładunku elektrycznego, oraz od siły jonowej i ph elektrolitu. Czynniki wpływające na przebieg elektroforezy Siła jonowa jest zdefiniowana następująco: gdzie: stężenie molowe określonego typu jonów, wartościowość określonego typu jonów. Wraz ze wzrostem siły jonowej początkowo obserwuje się wzrost przewodności jonowej elektrolitu związany ze wzrostem liczby nośników ładunku elektrycznego. Następnie dochodzi do zagęszczenia jonów i decydującą rolę w ruchu w polu elektrycznym odgrywa tarcie występujące pomiędzy otoczkami. Ważny jest odpowiedni skład elektrolitów przeznaczonych do elektroforezy. Przy zbyt wysokim stężeniu jonów następuje ograniczenie ich ruchliwości, przy zbyt niskim można zaobserwować niedobór nośników ładunku elektrycznego i związany z tym wzrost oporności elektrycznej. Temperatura utrzymywanie stałej temperatury jest konieczne dla osiągnięcia powtarzalnych rezultatów separacji elektroforetycznej makromolekuł, ponieważ: a. Wydzielane podczas polimeryzacji akrylamidu ciepło może przyczynić się do powstawania prądów konwekcyjnych i powodować nieregularności w sieciowaniu i porowatości nośnika. b. Nadmiar ciepła uwalnianego podczas elektroforezy może powodować nierównomierne przemieszczanie się frontu elektroforezy. c. Gradient temperatury w nośniku może powodować, że niektóre prążki będą migrować jako dublety, lub będą poszerzone,

3 3. d. Nadmiar ciepła prowadzi do denaturacji białek. e. Przy zastosowaniu zbyt dużych mocy, można zaobserwować topnienie żeli agarozowych, pękanie szklanych płyt czy uszkodzenia aparatu poprzez termiczne odkształcenia jego plastikowych elementów. ph miara stężenia jonów wodorowych. a. Duże znaczenie w przypadku białek i peptydów obdarzonych ładunkiem elektrycznym zależnym od warunków środowiskowych (ph). b. W wyniku zachodzących modyfikacji posttranslacyjnych cząsteczki białka kodowane przez ten sam gen mogą mieć różną wartością punktu izoelektrycznego, pi. Odmienną wartość pi mogą posiadać też izoformy białka będące produktem polimorficznego genu. c. W środowisku o ph < pi białko obdarzone jest ładunkiem dodatnim i migruje w kierunku elektrody ujemnej. d. Aby elektroforetyczna separacja białek była skuteczna koniecznym jest utrzymywanie stałej wartości ph elektrolitu - elektrolit musi być buforowany. e. Kwasy nukleinowe posiadają trwały ładunek ujemny- ich separacja elektroforetyczna jest prostsza Etapy planowania i wykonania elektroforezy Dobrze zaplanowaną elektroforezę możemy podzielić na następujące etapy: Wybór obiektu badań. Wybór metody. Wybór nośnika elektroforetycznego i aparatury. Przygotowanie układu elektroforetycznego. Przygotowanie próbki (np. barwienie, denaturacja, w zależności od wybranej metody). Elektroforeza. Wybarwienie nośnika. Dokumentacja. Analiza ilościowa i/lub jakościowa. Interpretacja wyników. Wybór nośnika elektroforetycznego Elektroforezę można przeprowadzać w roztworach, ale charakteryzuje się ona niską rozdzielczością. Znacznie więcej zastosowań znajduje elektroforeza przeprowadzana w żelach, ze względu na stabilność, powtarzalność, większą rozdzielczość. Istotny jest wybór dobrego podłoża. Nie może ono reagować z białkiem (rozdział ze względu na właściwości fizyczne, a nie chemiczne) i poprzez manipulacje stężeniem powinno dawać możliwość regulacji wielkości porów, a co za tym idzie umożliwiać wybór zakresu separacji cząsteczek. Najczęściej stosuje się żele złożone z wielocukrów: agaroza (agarobioza = galaktoza + 3,6- anhydrogalaktoza poliakryloamid ( akryloamid + N,N -metylenobisakryloamid) Typowy żel poliakryloamidowy wygląda następująco (Rys. Figure 1):

4 Typowy żel poliakrylowy. Główne rodzaje nośników elektroforetycznych Żele agarozowe Rozmiary porowatości agarozy można regulować stosując jej różne stężenia. Im wyższe stężenie tym bogatsze usieciowanie i drobniejsze pory. Zwykle przygotowuje się żele o stężeniach agarozy 0,4-4,0% i stosuje się je w aparatach do elektroforezy poziomej. Zaleta: możliwość separacji dużych makrocząsteczek białkowych, oraz fragmentów kwasów nukleinowych ( bp). Wada: słaba wytrzymałość mechaniczna i trudność utrwalania po rozdziale. Żele poliakrylamidowe umożliwiają separację makrocząsteczek białkowych o masach rzędu 5 kda kda lub polinukleotydów o wielkości par zasad. Przygotowywane są z roztworu monomerów akrylamidu i substancji sieciujących. Jako substancję sieciującą stosuje się N,N.-metylenobisakrylamid (bis-akrylamid). Reakcję polimeryzacji, można zainicjować chemicznie poprzez zastosowanie nadsiarczanu amonu w obecności katalizatora N,N,N.,N.-tetrametyletylenodiaminy (TEMED). Gęstość sieciowania oraz rozmiary porów można regulować poprzez dobór stężenia akrylamidu i bisakrylamidu. Uwaga! Akrylamid w postaci monomerycznej jest bardzo silną neurotoksyną. Jeżeli przedmiotem separacji jest mieszanina białek o zróżnicowanych masach, wskazanym jest zastosowanie żelu gradientowego o narastającej, wraz z dystansem migracji, gęstości sieciowania. Na jego wejściu rozmiary porów są duże i pozwalają migrować zarówno dużym jak i znacznie mniejszym makrocząsteczkom. W tym obszarze pozostają duże makromolekuły. Ze wzrostem dystansu migracji usieciowanie wzrasta i następuje separacja średnich i małych cząsteczek. Rodzaje komór elektroforetycznych (podział ze względu na sposób umieszczenia nośnika elektroforetycznego) Elektroforeza kapilarna HPCE (ang. high performance capillary electrophoresis) Elektrolit wypełnia kapilarę o wewnętrznej średnicy μm i długości cm. Końce kapilary zanurzone są w zasobnikach z elektrolitami. Kapilara wypełniona jest swobodnym elektrolitem (elektroforeza swobodna) lub porowatym nośnikiem (elektroforeza na nośniku).

5 Elektroforeza pionowa Nośnik elektroforetyczny wypełnia szklane rurki lub znajduje się pomiędzy dwoma płytkami rozdzielonymi przekładkami dystansowymi. Górna część nośnika jest przykryta warstwą elektrolitu. Elektroforeza pozioma Nośnik umieszczony jest w płaszczyźnie poziomej. Zaletą tego rozwiązania jest brak wycieków elektrolitu oraz możliwość łatwego odprowadzenia ciepła generowanego w trakcie przepływu prądu. Barwienie próbek Białka najczęściej wybarwia się stosując naturalne barwniki, takie jak błękit kumassi. Barwnik dodawany jest do roztworu utrwalającego położenie białka w żelu.można w ten sposób znaleźć 1 μg białka w prążku. Bardziej czułą metodą jest barwienie srebrem. Metoda ta pozwala oznaczyć 10 ng białka w prążku. Barwienie fluoroforami Barwniki fluorescencyjne (np. ANS lub bromek etydyny) pozwalają na uwidocznienie makrocząsteczek po zakończeniu elektroforezy lub wybarwienie przed separacją. Znaczniki uwidaczniają położenie prążków w świetle UV lub widzialnym. Czułość detekcji jest porównywalna z barwieniem srebrem lub jest nieco lepsza. Znakowanie radioizotopowe Bardzo wysoka czułość detekcji. Znakowanie makrocząsteczek (białek) radioizotopami odbywa się przed procesem separacji elektroforetycznej, często na etapie ich syntezy. Immunobarwienie Selektywne barwienie białek i peptydów na membranach przy zastosowaniu specyficznych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie, enzymatycznie lub radioizotopowo Barwienie enzymatyczne Wizualizacja enzymów, które w wyniku katalizy produkują barwny substrat. Dokumentacja rezultatów rozdziałów elektroforetycznych Znane są następujące metody dokumentacji rozdziałów elektroforetycznych: Suszenie żeli poliakrylamidowych pomiędzy warstwą bibuły i celofanu lub pomiędzy dwoma warstwami celofanu. Żele agarozowe nie poddają się tej formie dokumentowania. Sporządzenie fotografii żelu. a. technika autoradiografii lub autoluminescencji dla makrocząsteczek znakowanych radioizotopowo, lub immunoenzymatycznie z zastosowaniem substratów

6 chromogennych. b. wykorzystanie kamer cyfrowych, obraz przechowywany jest w formie elektronicznej. c. skanery optyczne, umożliwiające przetwarzanie na formę elektroniczną obrazu żeli i membran, detekcja z zastosowaniem znaczników fluorescencyjnych, substratów chromogennych i radioizotopów. Analiza ilościowa i jakościowa żeli elektroforetycznych Analiza jakościowa, mająca na celu pokazanie obecności danego białka i określenie jego względnej migracji w nośniku elektroforetycznym może być wykonana przez porównanie położenia poszczególnych prążków i opisanie zaobserwowanego obrazu. Analiza ilościowa wymaga zastosowania technik rachunkowych, uwzględniających zarówno informację o położeniu analizowanych prążków, jak i o intensywności wybarwienia tych prążków. Do tego celu stosuje się technikę densytometrowania analizowanego żelu, membrany lub ich elektronicznie przetworzonych obrazów. Uzyskane w ten sposób dane liczbowe pozwalają na: określenie masy cząsteczkowej (MW), wartości punktu izolektrycznego (pi) lub liczby par zasad analizowanej makrocząsteczki w porównaniu z zastosowanymi wzorcami; określenie ilości molekuł w prążku na podstawie porównania ze znaną ilością tych molekuł w prążkach na sąsiednich ścieżkach; określenie sekwencji nukleotydów. Ogólne reguły przygotowania próbek do elektroforezy Próbka nie może zawierać zbyt dużej ilości soli. Separacja makrojonów zależy od ich ilości w próbce. Zbyt mała ilość makrojonów, powoduje trudności w ich detekcji, a zbyt duża ich ilość pogarsza warunki separacji. 3. Ilość makrocząsteczek poddających się prawidłowej separacji zależy od grubości nośnika, szerokości ścieżki, objętości nanoszonej próbki oraz od liczby różnych makrocząsteczek w próbce. 4. Często obciąża się próbkę dobrze rozpuszczalną substancją pozbawioną ładunku elektrycznego. Dodatek taki pozwala na umieszczenie próbki bezpośrednio na powierzchni żelu bez zbędnego mieszania jej z elektrolitem. 5. Próbka powinna być zabarwiona tak, aby można było obserwować jej nanoszenie na nośnik. Eliminuje to możliwość pomyłkowego naniesienia dwóch lub więcej próbek na tę samą ścieżkę rozdziału. Rodzaje elektroforezy Elektroforeza kapilarna Umożliwia rozdział próbek o stężeniach attomoli, przy wysokich napięciach:

7 Przyłożenie napięcia powoduje wytwarzanie ciepła co niekorzystnie wpływa na rozdzielczość. Zwykle ograniczenie stosowanego napięcia V. W cienkiej kapilarze stosunek powierzchnia/objętość jest bardzo korzystny jeśli chodzi o dyssypację produkowanego ciepła. Można wtedy używać wyższych napięć. Typowa średnica wewnętrzna kapilary μm, zewnętrzna 300 μm, długość cm. Kapilara wypełniona jest buforem lub żelem. Możliwe napięcie 5-50 kv. Korzyści Rozdział w ciągu kilku minut substancji o stężeniu attomolowym. Niskie zużycie reagentów. Ze względu na możliwość stosowania różnych buforów możliwość rozdziału struktur o wielkości od atomów do całych komórek. Elektroforeza natywna Stosowana w przypadku białek aktywnych biologicznie o prawidłowej strukturze czwartorzędowej Separacja dzięki różnicy ładunków własnych białek Ruchliwość cząsteczek jest związana z ładunkiem netto białka, jego masą i kształtem. Metoda stosowana do wyznaczenia masy białka dzięki porównaniu ruchliwości białka o nieznanej masie z ruchliwością białek o znanej masie i podobnym kształcie. Przygotowanie próbki do badań Próbka powinna być: rozpuszczona w buforze nie powodującym denaturacji separowanych makrocząsteczek. Przygotowywana i przechowywana w niskiej temperaturze - zabezpieczenie przed degradacją proteolityczną. W tym samym celu można do próbki dodać inhibitorów proteaz serynowych (PMSF i EDTA). Pozbawiona nadmiaru soli poprzez dializę lub filtrację żelową. Zrównoważona elektrolitem, który wypełnia nośnik elektroforetyczny. Gęstość próbki można podwyższyć przez dodanie glicerolu (10%) i zabarwić przy pomocy 0,25% błękitu bromofenolu (ang. bromophenol blue). Nie denaturujemy próbki (chemicznie lub termicznie)! Zaletą metody jest możliwość odzyskania cząsteczek białkowych w stanie aktywności biologicznej. Wadą - stosunkowo słaba rozdzielczość. Elektroforeza denaturująca Często spotykana nazwa: SDS-PAGE od SDS polyacrylamide gel electrophoresis Zdenaturowane białko wędruje w polu elektrycznym jako rozwinięty monomer (brak aktywności biologicznej i struktury czwartorzędowej).

8 SDS silny detergent jonowy (ang. sodium dodecyl sulfate) o hydrofobowym łańcuchu węglowym i polarnej siarczanowej głowie. SDS denaturuje białko i nadaje mu ładunek ujemny niezależny od wewnętrznego ładunku białka i masy. Ruchliwość kompleksu białko-sds jest zależna do jego masy. Ograniczenie SDS-PAGE Założenie, ze białka są sferami z równomiernym rozkładem ładunku. Uzyskana ta metodą masę określa się jako masę pozorną, ponieważ odnosi się do porównania z innymi białkami (np. glikoproteiny poruszają się wolniej ze względu na to, że SDS nie wiąże się do części cukrowych). Elektroforeza w obecności SDS przygotowanie próbki do badań Białka zawarte w próbce powinny być zdenaturowane przez dodanie 1-2% SDS (w ph 7,0-9,0) i gotowane w ciągu 3-4 minut. W celu rozbicia wiązań dwusiarczkowych do próbki należy dodatkowo dodać czynnik redukujący: 1% merkaptoetanol lub DTT (ditiotreitol) oraz 10 mm EDTA. Próbka powinna być odsolona (dializa lub filtracja żelowa) i zrównoważona elektrolitem wypełniającym nośnik na który będzie naniesiona. Do próbki można dodać glicerol (10%) oraz błękit bromofenolu (0,25%), uzyskując w ten sposób wyższą gęstość próbki i jej intensywne zabarwienie. Bezpośrednio przed naniesieniem na żel próbkę należy odwirować aby usunąć wszystkie nierozpuszczone składniki. Korzyści z wykorzystania SDS Zdecydowana większość białek jest rozpuszczalna w elektrolitach zawierających SDS, szczególnie po redukcji mostków dwusiarczkowych. Separacja białek odbywa się zgodnie z ich masami cząsteczkowymi. Barwienia kompleksów białko-sds jest znacznie wydajniejsze niż samego białka. Obecność SDS eliminuje enzymatyczną degradację białek w trakcie separacji. Wada białko w formie zdenaturowanej. W wielu przypadkach mostki dwusiarczkowe stabilizują strukturę białek. Za pomocą związków redukujących (beta-merkaptoetanol, DTT) zrywa się utworzone mostki. Analiza elektroforetyczna z zastosowaniem związku redukującego i bez umożliwia ustalenie liczby mostków solnych w białku. Zamiast SDS można użyć mocznika, który wiąże się z białkiem w sposób odwracalny. Wtedy nie nadaje się białku ładunku, w związku z czym porusza się ono zgodnie z własnym wewnętrznym ładunkiem, pomimo stanu zdenaturowanego. Ogniskowanie izoelektryczne, IEF (isoelectric focusing) ph środowiska wpływa na ładunek netto białka (niskie ph dodatni, wysokie ph ujemny). Punkt izoelektryczny pi ph przy którym ładunek netto cząsteczki jest równy 0 (zależnie od składu aminokwasowego i modyfikacji potranslacyjnych). Jest to biofizyczny parametr charakteryzujący białko, który wyznaczamy poprzez ogniskowanie izoelektryczne. W warunkach standardowych (temperatura, skład buforu) pi jest stałe dla danego białka.

9 Uzyskanie stabilnego gradientu ph (trudne ze względu na dyfuzję) odbywa się przy pomocy : a. amfolinów (komercyjnie dostępne, syntetyczne heteropolimery oligoamino- i oligokarboksylowych kwasów, które w polu elektrycznym ustawiają się w kolejności wartości pi tworząc gradient. b. pochodnych akryloamidu zawierających słabe, zasadowe lub kwaśne grupy. Mieszane są razem w obecności akryloamidu tworząc żel poliakryloamidowy. Odpowiednio dobierając pochodne uzyskuje się różne gradienty ph. Można stworzyć bardzo wąski zakres gradientu co umożliwia lepszą rozdzielczość pi białek niż w przypadku amfolitów. Przygotowanie próbki Próbka pozbawiona soli i substancji buforujących (dializa, filtracja żelowa). W przypadkach, gdy białka nie są rozpuszczalne w czystej wodzie, można próbować pozostawić próbkę w buforze sprzyjającym rozpuszczeniu białka. Jednak stężenie jonów i substancji buforujących powyżej 50 mm może być przyczyną kłopotów w uzyskaniu dobrej separacji makrocząsteczek. Białko umieszczone w gradiencie ph migruje do punktu o wartości pi(w obecności markerów o znanym pi). Wypadkowy ładunek makrocząsteczki równa się wtedy zeru i obojętna elektrycznie makrocząsteczka zatrzymuje się nie doznając działania sił pola elektrycznego. Uzyskuje się w ten sposób separację molekuł białkowych zgodnie z ich wartościami pi. Dwuwymiarowa SDS-PAGE Za pomocą elektroforezy jednowymiarowej można rozdzielać do 100 różnych białek. Jeśli w próbce jest ich więcej stosuje się elektroforezę dwukierunkową (2D). Jest ona połączeniem dwóch, a czasami trzech podstawowych rodzajów elektroforezy. Procedura rozpoczyna się od separacji białek techniką ogniskowania izoelektrycznego. Pierwszy kierunek (wymiar) elektroforezy 1D wykonuje się przy pomocy elektroforezy pionowej lub poziomej. Następnie nośnik zawierający rozdzielone białka przenoszony jest na elektroforezę płytową w celu wykonania separacji według mas cząsteczkowych. Na tym etapie może być stosowana elektroforeza denaturująca lub natywna. Po zakończeniu procedury 2D i wybarwieniu żelu uzyskuje się dwuwymiarową mapę rozkładu cząsteczek białek, w funkcji wartości pi oraz masy cząsteczkowej. Metoda umożliwia rozdzielenie kilku tysięcy białek, nawet z ekstraktu bakteryjnego (jest mało prawdopodobne by białka miały te samą masę i pi). Zastosowanie: separacja mutantów białkowych, test, które z białek pojawiają się na kolejnych etapach rozwoju komórki. Immunoelektroforeza Przeciwciała to białka zaprojektowane do rozpoznawania antygenów. Ze względu na ich specyficzność są one molekularnymi próbnikami użytecznymi w badaniach struktury białek,

10 makromolekularnych kompleksów i wirusów. Przeciwciała (uzyskiwane ze zwierząt laboratoryjnych królików i myszy) umożliwiają specyficzną detekcję białek w mieszaninie wiążąc się z antygenem białka, które chcemy zidentyfikować. Immunoelektroforeza jest to połączenie elektroforetycznej separacji cząsteczek z immunodetekcją. Stosowane żele mają duże pory stosownie do wielkości przeciwciał i antygenów. Immunodetekcja służy identyfikacji próbek makromolekuł, niemożliwej do wykonania inną metodą. Immunodetekcja, blotting Przeniesienie próbki na mechanicznie stabilną membranę jest nazywane blottingiem Białko z antygenem wiąże się z membraną nitrocelulozową. Wiązaniu niespecyficznemu zapobiega wysycenie miejsc wiążących niespecyficznie przez białko nie zawierające antygenu, np. BSA. Dodawany roztwór przeciwciała pozwala na specyficzne wiązanie przeciwciała z antygenem. Następnie kompleks jest wiązany z przeciwciałem drugorzędowym, specyficznie wiążącym się z przeciwciałem pierwszorzędowym i połączonym z enzymem, który przerabia dodany substrat w barwny produkt. W ten sposób identyfikuje się położenie antygenu a przez to poszukiwanego białka. Western blotting (białka) SDS-PAGE. Transfer na nitrocelulozę. Zablokowanie niespecyficznego wiązania antygenów. Wiązanie przeciwciał pierwszorzędowych. Wiązanie przeciwciał drugorzędowych. Wizualizacja. Southern blotting (DNA) Trawienie restrykcyjne DNA Elektroforeza na żelu agarozowym Denaturacja w warunkach alkalicznych Przeniesienie na nitrocelulozę Hybrydyzacja ze znacznikami (etykietowane, znane fragmenty DNA lub oligonukleotydy). Northern blotting (RNA) Denaturacja RNA formaldehydem Dalej postępowanie podobne jak w przypadku DNA, membrana nitrocelulozowa zastąpiona przez membranę nylonową. W przypadku polipeptydów membranę nitrocelulozową można zastąpić membraną PVDF.

11 Immunoelektroforeza dyfuzyjna Służy do jakościowego oznaczenia antygenów w serum, ekstraktach komórkowych i innych preparatach. Elektroforetyczny rozdział antygenów w żelu agarozowym. W żelu znajduje się rynna, do której po elektroforezie wlewany jest roztwór przeciwciał 3. Przeciwciała i antygen dyfundują i wiążą się ze sobą wytrącając i tworząc charakterystyczne łuki osadowe.