ATAK WOLNYCH RODNIKÓW

Transkrypt

1 ATAK WOLNYCH RODNIKÓW Stres oksydacyjny procesy zapalne Peroksydacja lipidów Utlenienie białek proliferacja niedobór przeciwutleniaczy Przekazywanie sygnału przeciwutleniacze utrata przeciwutleniaczy uszkodzenie komórek, tkanek mobilizacja przeciwutleniaczy procesy naprawcze 1

2 Zmiany poziomu ROS Zmiany metabolizmu Proces chorobowy Zmiany metabolizmu Zmiany poziomu ROS Proces chorobowy Zmiany metabolizmu Proces chorobowy Zmiany poziomu ROS Stres oksydacyjny współuczestniczy w powstaniu wielu chorób: Zapalenie stawów Zapalenie naczyń Zapalenie kłębuszków nerkowych Niedokrwienie Grypa HIV/AIDS Rozedma płuc Stwardnienie rozsiane Choroba Parkinsona Choroba Alzheimera Alkoholizm Choroby spowodowane paleniem tytoniu Starzenie 2

3 Stres oksydacyjny Wytwarzanie OH w wyniku reakcji H 2 O 2 z jonami metali związanymi z DNA Uszkodzenie DNA Uwolnienie jonów Ŝelaza i miedzi w komórce Wiązanie jonów do DNA Efekty działania reaktywnych form tlenu Stymulacja fosforylacji receptorów czynników wzrostowych Wzrost aktywności niektórych enzymów: fosfolipazy A2, C i D Wzrost aktywności kinaz białkowych: kinazy C, kinazy tyrozynowej, MAPK Aktywacja czynników transkrypcyjnych: AP-1, NK-kB, STAT3 Inaktywacja enzymów Uszkodzenia DNA Uszkodzenia chromosomów Peroksydacja lipidów błon Hemoliza erytrocytów Zahamowanie fosforylacji oksydacyjnej w mitochondriach Zaburzenia homeostazy jonów wapniowych Zmiany w organizacji cytoszkieletu Zmiany morfologii komórek Transformacja nowotworowa 3

4 METAL PODPOWŁOKI 3d 4s Skand Tytan Wanad Chrom Mangan śelazo Kobalt Nikiel Miedź Cynk 4

5 Uszkodzony DNA (p53) Uszkodzony DNA lub niedokończona replikacja DNA G1 S G2 M Niesprzyjające otoczenie komórki Nieukończona replikacja DNA Chromosomy nieprawidłowo przyłączone do wrzeciona mitotycznego 5

6 Metale, czynniki uszkadzające DNA uszkodzenie DNA p21 P53 NF-κB ATM Chk1 Cyclin E cyclin D CDK2 CDK4/6 GADD45 CDC25C CDC2 Cyclin B G1 S G2 M Czy metale indukują apoptozę komórek? 6

7 7

8

9 TNFα FasL TRADD FADD INK METALE mitochondrium ROS Pig3, 6, 12 GPx Uszkodzenie DNA Noxa Bax p53 Casp8 Bid tbid Smac Cyto c AIF ciap/xiap Casp3 Apaf-1 Casp9 APOPTOZA METALE NAPRAWA DNA STANY ZAPALNE PRZEKAZYWANIE SYGNAŁU Reaktywne formy tlenu i azotu EKSPRESJA GENÓW USZKODZENIE DNA MUTACJE CHOROBY NOWOTWOROWE 9

10 MUTAGENEZA ŚMIERĆ KOMÓRKI PROMOCJA NOWOTWORU STRES OKSYDACYJNY ROS + Tat, Tax, LPS, cytokiny... TAK, PKCs, PKR... Akt NIK MAPKKK Metale ROS?? IKK PTP PP-taza α γ β IκBα p50 p65 IκBα p50 p65 NF-κB Ub IκBα p50 p65 jądro p50 p65 XXXXXXXXXXXXX 10

11 Mechanizm indukowania stresu oksydacyjnego (Grurer and Ercal, 2000) JAK SIĘ BRONIĆ PRZED RODNIKAMI? 11

12 EUKARYOTA Mitochondrium MnSOD (SOD-1) jądro EC-Cu, Zn SOD (pozakomórkowa) Cu, Zn SOD (SOD-2) PROKARYOTA Procaryota MnSOD FeSOD O 2 SOD Cykl pentozofosforanowy i inne reakcje regenerujące NADPH H 2 O 2 + O 2 H 2 O + O 2 Peroksydaza glutationowa H 2 O 12

13 Selen Naturalne źródła selenu: DroŜdŜe, ryby, owoce morza, kiełki pszenicy, ryŝ, ziarna innych zbóŝ, kukurydza, orzechy brazylijskie, wątroba cielęca i wołowa, nerki, czosnek Kraje zasobne w selen: USA, Kanada, Meksyk, Wenezuela Selen i jego związki: Wchłanianie: przewód pokarmowy i układ oddechowy wiązanie przez krwinki czerwone i albuminy osocza transport do tkanek odkładanie głównie w wątrobie i nerkach, włosach i paznokciach wydalanie z moczem (największa wydajność), kałem, potem i wydychanym powietrzem 13

14 Selenin SeO 3 2- Selenometionina CH 3 SeCH 2 CH 2 CHCOO - NH 3 + Selenocysteina - SeCH 2 CHCOO - NH 3 + 4RSH + H 2 SeO 3 (np. GSH) RS-Se-SR + RSSR + 3H 2 O Selenin 4GSH GSSG GSSeSG NADPH NADP + + GSSG Metabolizm selenu SeMet Dieta SeCys H 2 Se trna niespecyficzne białka np. albumina specyficzne selenoproteiny SeCys np. GPX, TR, SeP CH 3 O 2 SeO 2 H 2 O 2 O 2. CH 3 SeH CH 3 Wydychane powietrze (CH 3 ) 2 Se CH 3 (CH 3 ) 3 Se + mocz Combs,

15 Selen Bezpieczna dzienna dawka: 5 µg /kg wagi ciała (max. 50 µg/kg wagi ciała) Niedobór selenu - dolegliwości mięśniowe i stawowe - łamliwe paznokcie - zaburzenia widzenia - częste przeziębienia - kardiomiopatia - stwardnienie tętnic (arterioskleroza) - zaburzenia układu immunologicznego - martwica wątroby - choroby nowotworowe ZALEśNY OD STĘśENIA WPŁYW SELENINU NA METABOLIZM KOMÓRKI śmierć zapobieganie Zahamowanie wzrostu Ostra toksyczność niedobór przeciwutleniacz pro-utleniacz utleniacz 15

16 Selen Silny antyutleniacz Zapobiega zachorowaniom na raka, szczególnie prostaty, płuc i jelita grubego Pomaga w leczeniu obniŝonej płodności u męŝczyzn, poprawiając ruchliwość plemników Reguluje pracę układu odpornościowego Zapobiega chorobom naczyń krwionośnych i serca Reguluje działanie hormonów tarczycy Ogranicza aktywność wirusów (w tym wirusa HIV) Zapobiega komplikacjom ciąŝowym i poronieniom Dzienny pobór toksyczność Cykl komórkowy/ apotoza Se enzymy przeciwutleniacz Wzmocnienie odporności Metabolizm karcynogenów Se metabolizm toksyczność Selenin Combs,

17 Nadmiar selenu silnie toksyczny Duszność Obrzęk płuc Częstoskurcz Wymioty i biegunka Depresja Choroby nowotworowe Na 2 SeO 3 SELENODIGLUTATION (GSSeSG) DNA, RNA Synteza AP-1, NF-κB Indukcja apoptozy SeMet SeCys SELENOWODÓR (H 2 Se) GPx, TR ROS H 2 O 2, O 2.-, apoptoza, zatrzymanie w fazie S CH 3 SeO 2 H CH 3 SeCN CH 3 SeCys Metylowane związki selenu (CH 3 ) 2 Se (CH 3 ) 3 Se + Zatrzymanie w fazie G1, PKC, apoptoza VEGF Tapiero

18 Mechanizmy toksyczności selenu Podobieństwo do siarki- moŝliwość wbudowywania do białek i enzymów Wysoka reaktywność i niska stabilność- zmiana właściwości i reaktywności tych białek Wysoka reaktywność z grupami tiolowymi- utlenianie grup SH białekhamowanie ich aktywności Indukcja niedotlenienia i utraty NADPH Uszkodzenia DNA, zahamowanie syntezy DNA Indukcja apoptozy Stymulacja (w niskich stęŝeniach nm) lub zahamowanie wzrostu komórek ( w wyŝszych stęŝeniach) Wpływ seleninu sodu na Ŝywotność komórek HEK293 i ich aktywność ruchową 18

19 Komórki nowotworowe wykazują wyŝszą wraŝliwość na związki selenu niŝ komórki prawidłowe Selen - potencjalny inhibitor replikacji wirusa HIV Selenoproteiny - Peroksydazy glutationu (GPx1, GPx2, GPx3, GPx4) - Reduktazy tioredoksyny (Trx1, Trx2, TGr) - Syntetaza selenofosforanowa (SPS2) - Selenoproteina P - Selenoproteina W - Dejodynaza jodotyroninowa 19

20 SH S-S lub S S nieaktywne aktywne SH SH S SH S-OH lub S aktywne nieaktywne COOH O O H 2 N-C-CH 2 -C-N-CH-C-N-CH 2 -COOH H H CH2 H SH Glutation GSH + BIAŁKO-SH = BIAŁKO-S-S-G BIAŁKO-S-S-G + GSH = BIAŁKO-SH + GSSG BIAŁKO 1 -S-S-BIAŁKO 2 + GSH = BIAŁKO 1 -S-S-G + BIAŁKO 2 -SH BIAŁKO 1 -S-S-G + GSH = BIAŁKO 1 -SH + G-S-S-G 2GSSH + H 2 O 2 = GSSG + 2 H 2 O 20

21 O 2 SOD Cykl pentozofosforanowy i inne reakcje regenerujące NADPH H 2 O 2 + O 2 H 2 O + O 2 Peroksydaza glutationowa H 2 O Peroksydaza glutationowa -jest selenoproteiną -redukuje nadtlenki w tym H 2 O 2, wykorzystując glutation jako donor elektronów 2GSH + H 2 O 2 = GSSG + 2 H 2 O Rodzaje perkosydazy glutationowej: GPx1 i GPx4 zarówno cytozolowa jak i mitochondrialna, obecna w większości tkanek GPx2 GPx3- produkowana w nabłonku śluzowym, wyścielającym przewód pokarmowy produkowana w nerce 21

22 stęŝenie selenu w surowicy (µg/l) Poziom wymagany do optymalnej aktywacji GPx Polska Czechy Szwecja Niemcy Grecja Dania Austria Hiszpania Francja Szkocja System glutationu System tioredoksyny Glutaredoksyna (Grx) Reduktaza glutationowa (GR) glutation N A D P H Reduktaza tioredoksyny (TrxR) Tioredoksyna (Trx) Białka i metabolity 22

23 utleniona tioredoksyna S S NADPH reduktaza tioredoksyny SH SH zredukowane białko SH SH NADP zredukowana tioredoksyna S S utlenione białko Tioredoksyny specyficzne dla organelli: 1. MitochondrialnaTrx2 2. Erdj5 (retikulum endoplazmatyczne ER) 3. Transbłonowa tioredoksyna TMX ( w ER) 4. Jądrowa NRX Tioredoksyny specyficzne dla tkanek: 1. Sptrx1 ( obecna w spermie) 2. Sptrx1 (obecna w spermie) 3. Txl-2 (obecna w płucach i jądrach) 23

24 Tioredoksyna Trx - białko o M cz około 12 kda redukuje substrat, wykorzystując parę cystein jako donor elektronów H 2 O 2, estry forbolu, tlen, infekcji wirusowych, UV, promieniowania RTG Wzrost ekspresji tioredoksyny, a następnie transport z cytoplazmy do jądra wydzielanie tioredoksyny na zewnątrz komórki Reduktaza tioredoksyny Enzym zawierający selenocysteinę Katalizuje redukcję tioredoksyny w obecności NADPH Rodzaje reduktazy tioredoksyny 1. Cytozolowa TrxR1 2. Mitochondrialna TrxR2 3. Jądrowa TGR ( posiada właściwości zarówno reduktazy tioredoksyny, jak i reduktazy glutationowej) 24

25 NADPH NADP + Reduktaza tioredoksyny Askorbinian (utl) Askorbinian(red) Trx (utl) Trx (red) Wzrost komórek Hamowanie apoptozy Peroksydaza tioredoksyny Reduktaza rybonukleotydowa Czynniki transkrypcyjne H 2 O 2 H 2 O przeciwutleniacz synteza DNA transkrypcja genów Kwas dehydroaskorbinowy Kwas askorbinowy NADPH + H + ROOH TrxR TrxS 2 ASK-1 ASK-1 Indukcja apoptozy hamowanie apoptozy ROH NADP + Trx(SH) 2 GSSG Aktywacja AP-1 2GSH represja NF-κB (w cytozolu) GPx utl PDI-S 2 PDI-(SH) 2 Prx utl Prx red GPx red H 2 O 2 H 2 O + O 2 Fizjologiczne funkcje systemu tioredoksyny 25

26 Reduktaza tioredoksyny seleninu sodu a Ŝywotność komórek HEK293 i ich aktywność ruchową Reduktaza tioredoksyny, a proliferacja i Ŝywotność komórek poddanych działaniu trietyloołowiu i nadtlenku wodoru 26

27 Wpływ trietyloołowiu na aktywność ruchową Dictyostelium discoideum kontrola 3 µm TriEL 5 µm TriEL Wpływ kwasu askorbinowego i Na 2 SeO 3 na aktywność ruchową Dictyostelium discoideum inkubowanych w obecności TriEL TriEL TriEL + kwas askorbinowy TriEL + Na 2 SeO 3 27

28 Selen, a toksyczność metali Znaczenie profilaktyczne Tworzenie nieaktywnych kompleksów metal - selen Wzrost aktywności dysmutazy ponadtlenkowej Wzrost aktywności reduktazy glutationowej Wzrost aktywności reduktazy tioredoksyny domena regulatorowa domena katalityczna pseudosubstrat NH 2 C1A C1B C2 C3 C4 S S S S S S Ca 2+ S ATP S S S COOH Zn Zn utleniacze aktywacja Kinaza białkowa C inaktywacja utlenione formy przeciwutleniaczy związki selenu (przyłączenie albo alkilacja) 28

29 PKC PKC Domena regulatorowa Domena katalityczna S S S X S S S S Zn 2+ H H H H + SeO 3 2- Domena regulatorowa Domena katalityczna System reduktazy tioredoksyny S S S X S S S S Zn 2+ Se Domena regulatorowa Domena katalityczna S S S X S S S S Zn 2+ 4RSH + H 2 SeO 3 RS-Se-SR + RSSR + 3H 2 O Inne związki wpływające na spadek toksyczności metali cięŝkich i związków metaloorganicznych Witamina B 6 Witamina E Witamina C Tauryna Cynk β-karoten 29

30 Witamina C (askorbinian) Istotna dla aktywności hydrolaz i oksygenaz redukcja jonów metali w centrach aktywnych enzymów Posiada silne właściwości antyoksydacyjne w stosunku do: rodników nadtlenkowych tlenu singletowego nadtlenku wodoru anionorodnika ponadtlenkowego rodnika hydroksylowego oksydant + Kwas askorbinowy utlenianie wolny rodnik askorbylowy dehydroksyaskorbinian redukcja Glutation tiolotranferaza, Reduktaza tioredoksyny Liza erytrocytów Inaktywacja białek Hamowanie transportu komórkowego 30

31 Posiada właściwości prooksydacyjne Stymuluje reakcje wolnorodnikowe w obecności jonów metali przejściowych-reakcja Fentona Kwas askorbinowy + jony metali przejściowych (Fe, Ni, Co) = zredukowane jony metali (np. Fe 2+ ) redukcja O 2 anionorodnik ponadtlenkowy nadtlenek wodoru Witamina E (α-tokoferol) Rozpuszczalna w lipidach Chroni błony komórkowe przed peroksydacją -zmiatanie wolnych rodników organicznych: VitE + LOOH = VitE + LO + H 2 O -terminacja peroksydacji lipidów: VitE + LOO = VitE + LOOH -wygaszanie tlenu singletowego Niedobór: neutralizacja przez witaminę C Hemoliza krwinek, schorzenia neurologiczne, zaburzenia funkcjonowania mięśni i układu odpornościowego, zahamowanie chemotaksji i fagocytozy, wzrost prawdopodobieńtwa występowania nowotworów 31

32 Ubichinon (koenzym Q) O H 3 CO H 3 CO CH 3 CH 3 (CH 2 -CH=C-CH 2 ) 10 -H UTLENIONA FORMA KOENZYMU Q (UBICHINON) O OH H 3 CO H 3 CO CH 3 CH 3 (CH 2 -CH=C-CH 2 ) 10 -H ZREDUKOWANA FORMA KOENZYMU Q (UBICHINOL) OH Ubichinon (koenzym Q) NADH bursztynian O 2 4H + 2H 2 O dehydrogenaza NADH e - dehydrogenaza bursztynianowa ubichinon e - Cyt. b Białko FeS Cyt. c 1 Cyt. c Cyt. c 4e - Cyt. a 3 Wewn. błona mitochondrialna O 2 O 2 O 2 O 2 Wchodzi w skład mitochondrialnego łańcucha oddechowego: Przenosi elektrony z reduktazy NADH-Q do II kompleksu łańcucha-reduktazy cytochromowej 32

33 Jony metali jako antyoksydanty 1. Kataliza dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego 2. Reakcje z rodnikiem OH 3. Jony Zn 2+ : a) konkurują z jonami Cu 2+ i Fe 3+ jednak nie wchodzą w reakcję Fentona b) wypierają Cu 2+ i Fe 3+ z centrów wiąŝących w błonach komórkowych i DNA Związek chelatujący Dimerkaptol As Cd Cr Cu Fe Hg Mn Pb V Zn EDTA Kwas dietylenotriamino- -pentaoctowy (+) Penicylamina Deferoksamina Dimerkaptopropanosulfon Kwas dimerkapto- -bursztynowy

34 Metalotioneiny białka (~ 60 aminokwasów, 6000 kda) wysoce konserwatywne, bogate w cysteinę Typy ssaczych metalotionein: MT-1 we wszystkich narządach MT-2 we wszystkich narządach MT-3 głównie w mózgu MT-4 skóra, jelito ( w nabłonkach wielowarstwowych) Rola: -Wiązanie jonów metali cięŝkich (np. kadm, rtęć, ołów) - magazynowanie metali niezbędnych (np. miedź, cynk) Fitochelatyny Peptydy o składzie podobnym do glutationu, występujące w roślinach i droŝdŝach WiąŜą jony metali cięŝkich Kompleksy fitochelatyn z metalami transportowane do wakuol i tam magazynowane Siderofory Wysoce specyficzne związki wiąŝące metale, wydzielane przez wiele mikroorganizmów 34

35 śelazo funkcjonalne Hemoglobina Mioglobina Enzymy hemowe Enzymy niehemowe śelazo transportowe transferyna śelazo zapasowe Ferrytyna hemosyderyna Białka regulujące pulę Ŝelaza: IRP1 i IRP2 Jony miedzi osocze Ceruloplazmina Albumina Transkupreina aminokwasy??cu 2+ Biosynteza białek miedziowych : Oksydaza cytochromowa SOD-1 Ceruloplazmina Endocytoza?? 35