CHARAKTERYSTYKI SPEKTRALNE UTLENIONEJ I ZREDUKOWANEJ FORMY CYTOCHROMU C

Transkrypt

1 Ćwiczenie 4 CHARAKTERYSTYKI SPEKTRALNE UTLENIONEJ I ZREDUKOWANEJ FORMY CYTOCHROMU C REAKTYWNE FORMY TLENU DEGRADACJA NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH TWORZENIE ANIONORODNIKA PONADTLENKOWEGO W REAKCJI KATALIZOWANEJ PRZEZ OKSYDAZĘ KSANTYNOWĄ ORAZ JEGO WYKRYWANIE I USUWANIE 1

2 ZMIANY WIDMOWE CYTOCHROMU c Kwas askorbinowy może redukować cyt c (Fe +3 ), czemu towarzyszą zmiany spektralne. W widmie zredukowanego cytochromu c pojawiają się dwa dodatkowe szczyty absorpcji przy 520 nm i 550 nm (ryc. 1). Nie obserwuje się natomiast w obecności tlenu ponownego, spontanicznego utleniania cytochromu c. Może to nastąpić tylko w obecności oksydazy cytochromowej lub w obecności sztucznego akceptora elektronów, takiego jak K 3 [Fe(CN) 6 ], pod wpływem którego zanika absorpcja przy 520 nm i 550 nm w widmie cytochromu c. Ryc. 1. Widma absorpcyjne cytochromu c REDUKCJA I UTLENIANIE CYTOCHROMU C Kwas askorbinowy może redukować cytochrom c (Fe 3+ ) do cytochromu c (Fe 2+ ) ze względu na wartość standardowego potencjału redoks. Natomiast heksacyjanożelazian (III) potasu posiada możliwość utlenienia cytochromu c. Wykonanie Do probówki. odmierzyć 1 ml 40 mg % roztworu cytochromu c i 1 ml 0,1 M buforu fosforanowego ph 7,0. Zmierzyć absorbancję w zakresie od 450 do 600 nm. Dodać 0,1 ml 10 mm roztworu kwasu askorbinowego i po 10 min ponownie zmierzyć absorbancję w powyższym zakresie długości fal. Następnie dodać 0,1 ml 50 mm roztworu K 3 [Fe(CN) 6 ] i po 5 minutach ponownie dokonać pomiaru widma absorpcyjnego w powyższym zakresie fal ( nm). OPRACOWANIE WYNIKÓW Na podstawie widm absorpcyjnych wyznacz maksimum absorbancji formy utlenionej i zredukowanej cytochromu c. Napisz reakcję cytochromu c z askorbinianem i jonami [Fe(CN) 6 ] 3-. 2

3 REAKTYWNE FORMY TLENU WPROWADZENIE W biologicznych reakcjach utleniania-redukcji, które przebiegają z udziałem flawoprotein, jako produkt uboczny jednoelektronowej redukcji tlenu cząsteczkowego, może powstać anionorodnik ponadtlenkowy (O 2ˉ ). Nukleotyd flawinowy może podczas tych reakcji, przyjmować jeden elektron (rodnik semichinonowy) lub dwa elektrony (forma zredukowana nukleotydu flawinowego): H Zredukowana flawina, w kolejnej reakcji utleniania-redukcji jest zdolna do przekazania, odpowiedniej cząsteczce akceptora, jednego bądź dwu elektronów. Jeżeli akceptorem tym jest tlen cząsteczkowy, to w wyniku jednoelektronowej reakcji powstaje anionorodnik ponadtlenkowy: O 2 e O2 Natomiast dwuelektronowa redukcja tlenu prowadzi do powstania nadtlenku wodoru: O 2 2e 2H H2O2 Zarówno anionorodnik ponadtlenkowy, jak i nadtlenek wodoru ulegają reakcjom dysproporcjonowania (dysmutacji): O 2 O2 2H H2O2 O2 H 2O2 H2O2 2H2O O2. Reakcja dysmutacji nadtlenku wodoru katalizowana jest przez katalazę. Ten zawierający układ hemowy enzym katalizuje reakcję usuwania nadtlenku wodoru powstającego podczas utleniania zredukowanych flawoprotein. Występuje on w niemal we wszystkich tkankach zwierzęcych przede wszystkim w wątrobie, erytrocytach i nerkach. 3

4 DEGRADACJA NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH Końcowym produktem degradacji nukleotydów purynowych w organizmach ssaków jest kwas moczowy. Jednym z enzymów prowadzących do jego powstania jest oksydaza ksantynowa [EC ]. Enzym ten katalizuje reakcję utleniania hipoksantyny do ksantyny, a następnie kwasu moczowego. Występuje w wątrobie i śluzówce jelita. W cząsteczce oksydazy ksantynowej, poza dwiema cząsteczkami FAD, znajdują się dwa jony molibdenu (VI) i osiem jonów żelaza tworzących centra żelazo-siarkowe. W trakcie reakcji katalizowanej przez ten enzym funkcjonuje łańcuch transportu elektronów z utlenianego substratu na tlen: Końcowym produktem redukcji tlenu jest przede wszystkim nadtlenek wodoru. Stąd zasadniczy przebieg reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową zapisuje się w formie: Jednak kilka procent tlenu ulega redukcji jednoelektronowej. Powstaje wtedy, jako produkt uboczny, anionorodnik ponadtlenkowy: EnzFADH O EnzFADH O2 H 2 2. Niedobór molibdenu w diecie może doprowadzić do obniżenia aktywności oksydazy ksantynowej w wątrobie. Częściej jednak opisywane są schorzenia wynikające z nadmiernej syntezy kwasu moczowego lub upośledzenia wydalania tego związku. Stężenie kwasu moczowego w osoczu krwi kobiet wynosi moli/l, w osoczu krwi mężczyzn moli/l. Nadmierne wytwarzanie kwasu moczowego w wątrobie może powodować chorobę atakującą stawy i nerki, zwaną skazą lub dną moczanową, albo podagrą. W tym schorzeniu stężenie moczanu w osoczu i moczu wzrasta. Kryształy soli moczanowych osadzają się w stawach i nerkach. W leczeniu dny moczanowej, dla zahamowania aktywności oksydazy ksantynowej, stosuje się analog hipoksantyny allopurynol. Jest on substratem reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową, lecz produkt jego utlenienia, alloksantyna, wiąże się bardzo silnie z centrum katalitycznym enzymu, hamując jego aktywność. Jest to przykład samobójczego" działania produktu katalizowanej przez hamowany enzym reakcji. 4

5 EKSPERYMENTALNE TWORZENIE, WYKRYWANIE I USUWANIE ANIONORODNIKA PONADTLENKOWEGO Tworzenie anionorodnika ponadtlenkowego W przedstawionym poniżej modelu doświadczalnym anionorodnik ponadtlenkowy powstaje w trakcie utlenienia ksantyny tlenem cząsteczkowym, w reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową. Reakcja ta hamowana jest przez allopurynol. Wykrywanie anionorodnika ponadtlenkowego Obecność i stężenie anionorodnika ponadtlenkowego w roztworze można określić na podstawie ilości zredukowanej formy cytochromu c (FeII), która powstaje w reakcji: O 2 cytochromc (FeIII) O 2 cytochrom c (FeII) Redukcji cytochromu c towarzyszą zmiany widma absorpcyjnego w zakresie nm. Postać zredukowana cytochromu c charakteryzuje się silną absorbancją przy długości fali 550 nm. Natomiast, stężenie formy zredukowanej cytochromu c zależy od stężenia anionorodnika ponadtlenkowego, który jest dawcą elektronów w przedstawionej powyżej reakcji. Dlatego, pośrednio, na podstawie pomiaru absorbancji w 550 nm, można określić stężenie anionorodnika ponadtlenkowego w roztworze. Jednym z produktów reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową jest nadtlenek wodoru. Powstaje on również jako produkt spontanicznie przebiegającej reakcji dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego. W naszym modelu doświadczalnym akceptorem elektronów przekazywanych przez anionorodnik ponadtlenkowy powinien być cytochrom c. Jednak, zredukowana forma cytochromu c utlenia się w następnej reakcji, redukując nadtlenek wodoru. W ten sposób, w miarę postępu reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową następuje reoksydacja cytochromu c i zmniejsza się absorbancja przy 550 nm. Aby zapobiec utlenianu cytochromu c, do układu wytwarzającego anionorodnik ponadtlenkowy wprowadzamy katalazę, która usuwa nadtlenek wodoru z mieszaniny reakcyjnej. Wówczas, cytochrom c jest końcowym akceptorem elektronów przekazywanych z anionorodnika ponadtlenkowego i na podstawie pomiaru stężenia zredukowanej formy cytochromu c można określić zawartość anionorodnika ponadtlenkowego w badanym roztworze. Usuwanie anionorodnika ponadtlenkowego Anionorodnik ponadtlenkowy w badanym układzie modelowym, usuwany jest w reakcji dysmutacji katalizowanej przez dysmutazę ponadtlenkową. 5

6 PODSUMOWANIE W przeprowadzanych doświadczeniach student obserwuje przebieg następujących reakcji: 2 I. Powstawanie anionorodnika ponadtlenkowego ( O ) jako produktu ubocznego reakcji katalizowanej przez oksydazę ksantynową: II. Hamowanie samobójcze" oksydazy ksantynowej przez allopurynol: III. Reakcja dysmutacji nadtlenku wodoru katalizowana przez katalazę: IV. Reakcja dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego katalizowana przez dysmutazę ponadtlenkową (SOD): V. Reakcja redukcji cytochromu c (FeIII) przez anionorodnik ponadtlenkowy: VI. Reakcja utlenienia cytochromu c (FeII) przez nadtlenek wodoru: 6

7 WYKONANIE Wytwarzanie i usuwanie anionorodnika ponadtlenkowego 1. W czterech probówkach przygotować, zgodnie z tabelą, roztwory badane. Numer roztworu badanego Roztwór D [ml] Roztwór A [ml] Roztwór F [ml] Roztwór I [ml] Roztwór H [ml] 1 1,8 0, ,8 0, ,1 3 1, ,1 0,1 4 1,8-0,1-0,1 A. 50 mm bufor fosforanowy ph 7,6, zawierający 0,1 mm EDTA (związek kompleksujący jony metali). D. Mieszanina ksantyny i utlenionej formy cytochromu c sporządzona przez zmieszanie roztworów B i C w proporcji 1:10. Roztwór B: 1 mg ksantyny rozpuszczony w 10 ml 1 mm NaOH. Roztwór C: 2,5 mg cytochromu c rozpuszczone w 10 ml roztworu A. E. Roztwór oksydazy ksantynowej. F. Allopurynol (1 mg/ml 1 mm NaOH). H. Roztwór katalazy. I. Roztwór dysmutazy ponadtlenkowej. 2. Wstawić kuwetę z odnośnikiem (próba ślepa 2 ml roztworu A) i wykonać pomiar absorbancji przy długości fali 550 nm. 3. Wstawić kuwetę 1 (zawierającą roztwór badany 1) do komory pomiarowej spektrofotometru, następnie dodać 0,1 ml (100 l) roztworu oksydazy ksantynowej (E) i mierzyć absorbancję co 30 s przez 7 min. 4. Wstawić kuwetę 2 (zawierającą roztwór badany 2) do komory pomiarowej spektrofotometru. Następnie do roztworu w kuwecie 2 dodać 0,1 ml (100 l) roztworu oksydazy ksantynowej (E) i mierzyć co 30 s przez 7 min absorbancję. 5. Wstawić kuwetę 3 (zawierającą roztwór badany 3) do komory pomiarowej spektrofotometru. Następnie, do roztworu w kuwecie 3 dodać 0,1 ml (100 l) roztworu oksydazy ksantynowej (E) i mierzyć co 30 s przez 7 min absorbancję. 6. Wstawić kuwetę 4 (zawierającą roztwór badany 4) do komory pomiarowej spektrofotometru. Następnie do roztworu w kuwecie 4 dodać 0,1 ml (100 l) roztworu oksydazy ksantynowej (E) i mierzyć co 30 s przez 7 min absorbancję. OPRACOWANIE WYNIKÓW 1. Przedstawić zasadę zastosowanej w doświadczeniu metody detekcji anionorodnika ponadtlenkowego. 2. Porównać przebieg krzywych obrazujących ilość anionorodnika ponadtlenkowego w każdym układzie badawczym. 3. Przedstawić wzorami reakcje, które zachodzą w każdym z analizowanych roztworów. 4. Podać przykłady reakcji metabolicznych, w których produktem ubocznym jest anionorodnik ponadtlenkowy. 7

8 ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA 1. Degradacja nukleozydów purynowych w organizmie człowieka (wzorami). Wzór i pełna nazwa FMN, FMNH 2, FAD i FADH 2 Rodzaje nukleotydów i nukleozydów purynowych (wzorami i nazwami). Dna moczanowa przyczyny i leczenie. 2. Reaktywne formy tlenu (RFT): tlen singletowy; anionorodnik ponadtlenkowy ( O ) i jego forma uprotonowana - rodnik wodoronadtlenkowy (HO 2 ); nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ); rodnik wodorotlenowy ( OH). Powstawanie RFT w organizmach żywych. Mechanizmy obrony biologicznej przed reaktywnymi formami tlenu. 2 Literatura 1. Bańkowski E. Biochemia: podręcznik dla studentów uczelni medycznych, Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2. Granner D.K., Mayes P.A., Biochemia Harpera, Wydawnictwo Lekarskie PZWL 3. Bartosz G. Druga twarz tlenu - wolne rodniki w przyrodzie, Wydawnictwo Naukowe PWN 8