Wpływ katechin na metylację DNA w obrębie promotora genu sulfiredoksyny (SRXN1) komórek linii HT29

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Wpływ katechin na metylację DNA w obrębie promotora genu sulfiredoksyny (SRXN1) komórek linii HT29"

Marcin Włodzimierz Urbański
5 lat temu
Przeglądów:

Spotkanie konsorcjum projektu MAESTRO Gdańsk, 19.02.

1 Spotkanie konsorcjum projektu MAESTRO Gdańsk, Wpływ katechin na metylację DNA w obrębie promotora genu sulfiredoksyny (SRXN1) komórek linii HT29 Patrycja Jakubek Monika Baranowska, Jovana Rajić, Melita Vidaković, Agnieszka Bartoszek, Jacek Namieśnik

2 Wpływ różnych czynników na mechanizmy epigenetyczne Ksenobiotyki Styl życia Ż y w n o ś ć Niskie dawki promieniowania Źródło: Cyr A. R. i Domann F. E.: The Redox Basis of Epigenetic Modifications: From Mechanisms to Functional Consequences, 2011, Antioxidants & Redox Signaling, 15(2):

3 Stres oksydacyjny i epigenetyka Rozregulowanie mechanizmów epigenetycznych Metylotransferazy Sirtuiny PARP Tet1 JmjC HDAC Poziom SAM Synteza GSH Cykl Krebsa Rozpad klastrów żelazowosiarkowych GSH/ GSSG NAD + /NADH Pula labilnego żelaza Stres oksydacyjny Źródło: Cyr A. R. i Domann F. E.: The Redox Basis of Epigenetic Modifications: From Mechanisms to Functional Consequences, 2011, Antioxidants & Redox Signaling, 15(2):

4 Struktury i standardowe potencjały redoks badanych związków Tab.1. Standardowe potencjały redoks katechin oraz glutationu (vs. SHE w 37 ± 0.1 C). Przeciwutleniacz Standardowy potencjał redoks E [V] (-)-Galusan epigalokatechiny (EGCG) (-)-Galusan epikatechiny (ECG) GSH ± C ± EC ± EGC ± (-)-Epigalokatechina (EGC) (-)-Epikatechina (+)-Katechina ECG ± EGCG ± Im niższy standardowy potencjał redoks, tym silniejsza aktywność przeciwutleniająca: Glutation (GSH) ECG > EGCG > EC > C > EGC > GSH

5 Stężeniowo-zależne zmiany ekspresji genów odpowiedzi na stres oksydacyjny Katechiny w stężeniu fizjologicznym indukują ekspresję genów odpowiedzi na stres oksydacyjny głównie. Zahamowanie ekspresji wystąpiło jednakże w wyniku działania tylko jednej z katechin EGC - w stężeniu 10 µm. Baranowska et al., 2018, Redox Biol., 17:

6 Sulfiredoksyna 1 Peroksyredoksyny katalizują reakcję redukcji nadtlenku wodoru, w wyniku czego grupa tiolowa cysteiny znajdującej się w centrum aktywnym ulega utlenieniu enzym ulega dezaktywacji (odwracalnej) Sulfiredoksyna umożliwia przywrócenie aktywności peroksyredoksyn poprzez redukcję utlenionych grup tiolowych cysteiny (Cys-SO2H Cys-SH) Stres oksydacyjny Związki chemoprewencyjne TBS Aktywna forma enzymu Srx Prx -SH H 2 O 2 Srx Nieaktywne formy enzymu Prx Prx -SO 2 H -SSG Sulfiredoksyna wpływa na ścieżki sygnalizacyjne regulowane przez reakcje redoks poprzez: Regulację poziomu nadtlenku wodoru (aktywacja peroksyredoksyn, gdy nastąpi akumulacja H2O2) S-deglutationylację białek S-denitrozylację białek Źródło: Sies H.: Role of Metabolic H2O2 Generation: Redox Signalling and Oxidative Stress, 2014, Journal of Biological Chemistry, 289(13)

7 Sulfiredoksyna i kancerogeneza Komórki nowotworowe jelita grubego Ekspresja SRXN1 Zdrowe komórki nabłonkowe jelita grubego

8 Cel badań Ocena zmian profilu metylacji w obrębie wyspy CpG znajdującej się w obszarze promotorowym genu SRXN1 pod wpływem działania różnych stężeń katechin. niemetylowane cytozyny metylowane cytozyny Wyspa CpG Ekspresja genu Gen Zahamowanie ekspresji genu Wyspa CpG Gen

9 Metodyka 1. Traktowanie komórek linii HT29 katechinami przez 24 godziny w temperaturze 37 C C EC EGC ECG EGCG GSH Zakres stężeń Fizjologiczny* 0,1 µm 1 µm Niefizjologiczny* 10 µm 100 µm *dotyczy katechin

10 Metodyka 2. Izolacja DNA z traktowanych komórek liza komórek wiązanie i oczyszczanie DNA elucja DNA

11 Metodyka 3. Bisulfidowa konwersja DNA Cytozyna Uracyl 5-metylocytozyna (5mC) Metylowane cytozyny nie ulegają bisulfidowej konwersji (pozostają niezmienione)

12 Metodyka 4. Analiza metylacji DNA Methylation-specific PCR (MSP) Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM)

13 Metody analizy metylacji DNA MSP Identyfikacja metylowanych cytozyn tylko w obrębie miejsc wiązania się starterów Całkowita metylacja Badany fragment wyspy CpG MSP MS-HRM MSP Krzywe topnienia po MS-HRM MS-HRM Określa stosunek metylowanych do niemetylowanych cytozyn w obrębie powielanej sekwencji z wykluczeniem miejsc wiązania się starterów Brak metylacji Heterogenna metylacja Miejsce wiązania primera Amplifikowany obszar DNA Miejsce wiązania primera Wzrost temperatury Wzrost temperatury Wzrost temperatury

14 Schematyczna ilustracja badanych fragmentów wyspy CpG Wyspa CpG (706 bp) w obszarze promotorowym genu SRXN1 z zaznaczeniem badanych fragmentów DNA i miejscami wiązania się primerów. M1/U1 oznaczenie primerów wykorzystanych do analizy pierwszego badanego obszaru M3/U3 oznaczenie primerów wykorzystanych do analizy drugiego badanego obszaru

15 Analiza MSP pierwszego fragmentu wyspy CpG (M1/U1) Wyniki analizy MSP M1/U1

16 Analiza MS-HRM pierwszego fragmentu wyspy CpG (M1/U1) Wyniki analizy MSP M1/U1

17 Analiza MS-HRM drugiego fragmentu wyspy CpG (M3/U3) Wyniki analizy MS-HRM M3/U3

18 Wnioski Metylacja cytozyn w obrębie promotora genu SRXN1 może być regulowana przez katechiny. Poziom metylacji obszaru promotorowego genu SRXN1 zdaje się być wrażliwy na zmiany komórkowego stanu redoks. Podniesienie poziomu metylacji w badanym obszarze promotorowym występuje jedynie w przypadku nieosiągalnych fizjologicznie stężeń ECG oraz EGC, co może być wynikiem zaburzenia homeostazy redoks. Zmiany poziomu metylacji DNA w obszarze promotorowym genu SRXN1 mogą nie być wystarczające do wywołania zmian ekspresji sulfiredoksyny.

19 Podziękowania Praca finansowana ze środków NCN w ramach projektu MAESTRO 6 nr 2014/14/A/ST4/00640: Szereg Mocy Przeciwutleniającej jako narzędzie pozwalające na racjonalne projektowanie i ocenę właściwości prozdrowotnych żywności funkcjonalnej zawierającej przeciwutleniające związki fitochemiczne oraz przez Europejski Program Współpracy w Dziedzinie Badań Naukowo- Technicznych COST w ramach Cost Action CA16112 NutRedOx: Personalized Nutrition in aging socjety: redox control of major age-related diseases.

Podobne dokumenty

Szereg mocy przeciwutleniającej; założenia. Friday, 3 November 17

Szereg mocy przeciwutleniającej; założenia Znaczenie homeostazy redoksowej i rola przeciwutleniaczy Zaburzone szlaki sygnalizacyjne zależne od ROS Źródła ROS Ochrona przed uszkodzeniami powodowanymi przez