METALE I ZWIĄZKI METALOORGANICZNE

Transkrypt

1 METALE I ZWIĄZKI METALOORGANICZNE Ubocznym skutkiem intensywnego rozwoju przemysłu i rolnictwa jest pojawienie się w środowisku naturalnym metali cięŝkich i ich organicznych pochodnych

2 Związki metaloorganiczne wykorzystywane są m. in. jako: stabilizatory wyrobów plastikowych składniki farb dodatki do paliw herbicydy oraz pestycydy Zdecydowana większość związków metaloorganicznych jest pochodzenia antropogenicznego, choć niektóre mogą powstawać w wyniku metylacji biologicznej, czyli całkowitej konwersji metalu pochodzenia nieorganicznego w związek metaloorganiczny lub konwersji częściowo zmetylowanej formy w związek w pełni zmetylowany. Związki metaloorganiczne: R n MeX m R - rodnik organiczny; Me - metal; X - grupa anionowa Metal toksyczny organiczne pochodne toksyczne Metal nietoksyczny organiczne pochodne toksyczne Związki organiczne metali bardziej toksyczne niŝ odpowiednie związki nieorganiczne Większe grupy organiczne i bardziej lipofilowe bardziej toksyczne odpowiednie związki metaloorganiczne

3 Intensywność oddziaływania związków metaloorganicznych z Ŝywymi organizmami zaleŝy w znacznym stopniu od: rodzaju i ilości przyłączonych do atomu metalu grup organicznych moŝliwości tworzenia róŝnych struktur przestrzennych w miejscu oddziaływania stopnia utlenienia metalu warunków środowiskowych: ph, temperatury, naświetlenia, obecności mikroorganizmów stęŝenia Metale oraz ich organiczne pochodne SĄ SILNIE NEUROTOKSYCZNE I IMMUNOTOKSYCZNE Wpływają na : wzrost komórkowy i Ŝywotność komórek błonę komórkową aktywność ruchową i odpowiedź chemotaktyczną komórek strukturę cytoszkieletu przekazywanie sygnału w komórkach

4 Organiczne pochodne cyny Główne źródła organicznych pochodnych cyny StęŜenia w środowisku: gleba (do 72 µg/g suchej masy) woda (do 96 ng/l) osady (do 160 ng/g) ryby morskie (>5 µg/g)

5 Organiczne pochodne cyny i ołowiu wykazują silne działanie: neurotoksyczne genotoksyczne immunotoksyczne hepatotoksyczne nefrotoksyczne Na poziomie komórkowym organiczne pochodne cyny i ołowiu wpływają na: strukturę i właściwości błon komórkowych organizację cytoszkieletu migrację i chemotaksję

6 Wchłanianie: Z przewodu pokarmowego (20%) Gromadzenie: Związki nieorganiczne-kości, płuca, mięśnie Związki organiczne-wątroba Wydalanie: Głównie z moczem Objawy zatrucia organicznymi pochodnymi cyny u ludzi: wymioty ból głowy podraŝnienie skóry i układu oddechowego zaburzenia nerwowe

7 Komórki Schwanna oligodendrocyty Organiczne pochodne cyny zanik nerwu wzrokowego Upośledzenie ostrości wzroku Zaburzenia percepcji barw Osłabienie reakcji źrenicznych

8 Skutki oddziaływania organicznych pochodnych cyny: Wpływ na błonę komórkową depolaryzacja i wzrost przewodności elektrycznej zmiany potencjału transmembranowego oddziaływania z białkami kanałowymi odpowiedzialnymi za transport jonów chlorkowych zakłócenie transportu jonów wapniowych, magnezowych, potasowych i sodowych przez błony mitochondrialne zmiany płynności Agregacja komórek Fuzja komórek

9 Wytwarzanie pęcherzykowatych wypustek na powierzchni błony Hemoliza erytrocytów Oddziaływania elektrostatyczne Erytrocyt R 3 Me + hemoliza R 3 Me + długość rodnika organicznego stopień hemolizy długość rodnika org. - potencjał elektryczny hydrofobowość kationów - lipofilność - penetracja błony

10 Zaburzenia metabolizmu hemowego mitochondrium Glicyna + Bursztynylo-CoA α-amino-β-ketoadypinian CO 2 ALA dehydrataza, Syntaza porfobiligenowa δ-aminolewulinian + δ-aminolewulinian porfobilinogen cytoplazma ALA syntaza X Org.pochodne cyny koproporfirynogen III porfobilinogenaza uroporfirynogen III dekarboksylaza uroporfirygenowa koproporfirynogen III Oksydaza i dekarboksylaza koproporfirynogenu, ferrochelataza protoporfiryna III-Fe 2+ mitochondrium NADH + ½ O 2 + H + NAD + + H 2 O Procesy przekształcania energii w błonie fosforylacja oksydacyjna ADP + P i ATP

11 Zahamowanie fosforylacji oksydatywnej w mitochondriach NADH bursztynian O 2 4H + 2H 2 O dehydrogenaza NADH 2e - dehydrogenaza bursztynianowa ubichinon e - Cyt. b Białko FeS Cyt. c 1 Cyt. c Cyt. c 4e - Cyt. a 3 Wewn. błona mitochondrialna NADH NAD + O 2 O 2 Mitochondrialny łańcuch oddechowy Zahamowanie syntezy ATP mitochondrium H + H + H + Syntaza ATP H + H + H + e - O 2 2H 2 O Łańcuch transportu elektronów ADP + P i H + ATP

12 Inhibicja systemów aktywnego transportu Hamowanie aktywności ATP-azy błonowej Aberracje chromosomowe Zmniejszenie stęŝenia amin katecholowych w mózgu i nadnerczach Zanikanie noradrenaliny i dopaminy w mózgu oraz adrenaliny, noradrenaliny i dopaminy w nadnerczach Zahamowanie aktywności ruchowej komórek Zniesienie reakcji chemotaktycznej komórek Spadek ilości F-aktyny w komórkach i jej depolimeryzacja

13 Depolimeryzacja mikrotubul kontrola 5 µm TMT Migracja komórek - embriogeneza - reakcje obronne układu odpornościowego - regeneracja i gojenie się ran - tworzenie przerzutów przez komórki nowotworowe Międzykomórkowa komunikacja przez złącza szczelinowe - homeostaza - wzrost komórek - róŝnicowanie komórek - śmierć komórek

14 Dictyostelium discoideum - organizm modelowy w badaniach migracji i chemotaksji komórek zwierzęcych ( Komórki Dictyostelium discoideum stanowią organizm modelowy w badaniach mechanizmów ukierunkowanego ruchu w odpowiedzi na gradient substancji chemicznej, wykorzystują one bowiem chemotaksję do poszukiwaniu pokarmu oraz do wytworzenia formy przetrwalnikowej. Zaletami tych komórek jest ich prosta hodowla, moŝliwość pozyskiwania duŝej ilości materiału do badań, duŝa prędkość migracji, moŝliwość przeprowadzania doświadczeń w temperaturze pokojowej, a takŝe fakt, Ŝe komórki te są haploidalne, co ułatwia uzyskiwanie mutantów. Cykl Ŝyciowy Dictyostelium discoideum Ciało owocujące zarodniki ameby camp agregacja Chemoatraktantami dla Dictyostelium discoideum są: kwas foliowy i pteryny (w stadium wegetatywnym) pseudoplazmodium camp (w fazie głodzenia)

15 Chemotaksja komórek - embriogeneza - reakcje obronne układu odpornościowego - regeneracja i gojenie się ran - tworzenie przerzutów przez komórki nowotworowe KOMORA BOYDENA

16 MIKROPIPETA Profil rozwoju gradientu Dictyostelium discoideum migrujące w gradiencie stęŝenia camp Pujic et al., Journal of Neuroscience Methods (2008) CHEMOTAKSJA POD AGAROZĄ Dictyostelium discoideum camp Haessler et al., Biomed Microdevices (2009)

17 KOMORA W KSZTAŁCIE KIESZENI Profil rozwoju gradientu Dictyostelium discoideum kwas foliowy Sroka et al., Cell Motility and the Cytoskeleton 2002 CHEMOTAKSJA MAKROFAGÓW IN VIVO Redd et al., Cell Motility and the Cytoskeleton (2006)

18 Wpływ trimetylocyny (TMT) na aktywność ruchową komórek Dictyostelium discoideum kontrola TMT (5µM) Wpływ trimetylocyny na chemotaksję komórek Dictyostelium discoideum Kwas foliowy camp kontrola TMT

19 Wpływ trimetylocyny na organizację mikrotubul w komórkach Dictyostelium discoideum kontrola 5 µm TMT Wpływ tributylocyny na komórki Eol-1

20 Krocień przeczyszczający (Croton tiglium) Olej krotonowy: estry forbolu: aktywatory kinazy białkowej C stany zapalne przewodu pokarmowego krwawe biegunki podraŝnienia skóry zmiany nowotworowe

21 pseudosubstrat Domeny PKC estry forbolu Domeny PS, PKC cynk Ca 2+ ATP substrat klasyczne C1 C2 C3 C4 V1 V2 V3 V4 V5 nowe C2 C1 C3 C4 nietypowe C1 C3 C4 regulatorowa katalityczna Kinaza białkowa C

22 Kinaza białkowa C domena regulatorowa domena katalityczna pseudosubstrat NH 2 C1A C1B C2 C3 C4 S S S S S S Ca 2+ S ATP S S S COOH Zn Zn utleniacze aktywacja Kinaza białkowa C inaktywacja utlenione formy przeciwutleniaczy związki selenu dodanie albo alkilacja

23 Wpływ PMA (estru forbolu) na migrację komórek HEK-293 kontrola PMA Sroka et al., Biology of the Cell (2007) Wpływ difenylocyny na morfologię i organizację F-aktyny w embrionalnych komórkach ludzkiej nerki HEK-293 kontrola TPA DPhT

24 Wpływ PMA i DPhT na morfologię komórek HEK-293 (liczba komórek tworzących lamellipodia była określana w trakcie rejestracji ruchu w trzech przedziałach czasowych h, h i h) HEK-IRES kontrola PMA DPhT lamellipodiaforming cells [%] ,5 hr 1,5-2 hr 3,5-4 hr lamellipodia-forming cells [%] ,5 hr 1,5-2 hr 3,5-4 hr lamellipodiaforming cells [%] ,5 hr 1,5-2 hr 3,5-4 hr Sroka et al., Biology of the Cell (2007) HEK-IRES Wpływ PMA i DPhT na morfologię i migrację komórek HEK-293 kontrola PMA DPhT lamellipodiaforming cells [%] ,5 hr 1,5-2 hr 3,5-4 hr lamellipodia-forming cells [%] ,5 hr 1,5-2 hr 3,5-4 hr lamellipodiaforming cells [%] ,5 hr 1,5-2 hr 3,5-4 hr przemieszczenie [µm] ± ± ± 6.6* 56.0 ± 4.5* HEK-IRES HEK-TrxR ± 2.5* 0 kontrola TPA PMA DPhT 9.1 ± 1.0* Średnie wartości przemieszczeń badanych komórek Sroka et al., Biology of the Cell (2007)

25 Wpływ DPhT na aktywację PKC Sroka et al., Biology of the Cell (2007) Rotleryna (specyficzny inhibitor PKC δ) oraz PKC δ sirna hamują zmiany morfologiczne i migrację indukowaną przez DPhT w komórkach kontrolnych Sroka et al., Biology of the Cell (2007)

26 Międzykomórkowa komunikacja przez złącza szczelinowe - homeostaza - wzrost komórek - róŝnicowanie komórek - śmierć komórek Drogi bezpośredniej międzykomórkowej wymiany metabolitów Plasmodesmy Złącza szczelinowe Nanotuby Komórka A Błony sąsiadujących komórek kanał o śr. ok. 1.5 nm Komórka B Koneksony formujące kanał między sąsiednimi komórkami Konekson Rośliny (Gallagher and Benfey, 2006) Zwierzęta ( Rustom et al., 2004

27 Budowa złącz szczelinowych NH3+ 1 E1 Bierny międzykomórkowy transfer jonów i metabolitów) - M. cz. < 1000 Da: 2 3 E2 4 _ - Jony (np. K+, Na+, Ca++) - Substancje regulatorowe (np. camp, cgmp, glutation) - Monosacharydy, aminokwasy, nukleotydy COO Konekson (Eckert &Huelser, zmienione) Kanały łączące przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek Tkankowo-specyficzne funkcje złącz szczelinowych SprzęŜenie elektryczne; np. w miokardium, układzie nerwowym i innych tkankach pobudliwych Serce Koneksyna Cx40 Cx43 Cx45 Funkcja - międzykomórkowy transfer jonów wapnia -synchronizacja aktywności skurczowej kardiomiocytów Układ nerwowy Cx32 Cx37 Cx43 - przewodnictwo nerwowe - wewnątrzcytoplazmatyczny transfer metabolitów w komórkach Schwanna SprzęŜenie metaboliczne; np. wątroba i inne tkanki niepobudliwe Np. wątroba i trzustka Cx32 Cx36 - synchronizacja wydzielania insuliny przez komórki β trzustki - synchronizacja sekrecji glukozy przez hepatocyty

28 Efekt hamujący : Rola złącz szczelinowych w rozwoju nowotworów 1. Spadek ekspresji koneksyn obserwowany jest na wczesnych etapach rozwoju nowotworów. 2. Re-ekspresja koneksyn w komórkach transformowanych przynajmniej częściowo przywraca fenotyp charakterystyczny dla komórek prawidłowych. 3. Koneksyny wpływają na aktywność szlaków sygnałowych zaleŝnych od cyklin, w sposób niezaleŝny od komunikacji międzykomórkowej Efekt promujący: 1. Wiele linii komórek nowotworowych cechuje wysoki poziom ekspresji koneksyn i wysoka intensywność komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych (Trosko, 2002) Sugeruje to konieczność opracowania strategii analitycznych uwzględniających rolę złącz szczelinowych na równi z innymi parametrami decydującymi o rozwoju nowotworów Techniki analizy komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych 1. Analizy elektrofizjologiczne (np. patch-clump) 2. Analizy oparte na pomiarach intensywności międzykomórkowego transferu cząsteczek np.: - metabolitów znakowanych izotopami promieniotwórczymi (np. C 14 -glukoza) - barwników fluorescencyjnych: Techniki wprowadzania barwników fluorescencyjnych do komórki: - mikroinjekcja - elektroperforacja - dye-loading DiI Calcein Donor cell CzyŜ et al., Exp. Cell Res. (2000),255: h

29 Wpływ DPhT na międzykomórkową komunikację przez złącza szczelinowe w komórkach HEK µm Sroka et al., Toxicology Letters (2008) Wpływ trimetylocyny na Ŝywotność komórek prawidłowych (HEK293) i nowotworowych (mięsakorak Walkera WC256) 120,00% 120,00% 120,00% kom. nie preinkubowane w Se kom. nie preinkubowane w Se kom. kom. preinkubowane nie preinkubowane w Se w Se kom. preinkubowane w Se kom. preinkubowane w Se 120,00% 120,00% 120,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% Procent Ŝywych komórek [%] Procent Ŝywych komórek [%] Procent Ŝywych komórek [%] 80,00% 80,00% 80,00% 60,00% 60,00% 60,00% 40,00% 40,00% 40,00% Liczba Ŝywych komórek [%] Liczba Ŝywych komórek [%] Liczba Ŝywych komórek [%] 80,00% 80,00% 80,00% 60,00% 60,00% 60,00% 40,00% 40,00% 40,00% 20,00% 20,00% 20,00% liczba kom. po 24h inkubacji w Sn liczba kom. po 24h inkubacji w Sn liczba liczba kom. kom. po po 72h 24h inkubacji inkubacji w Sn w Sn liczba kom. po 72h inkubacji w Sn liczba kom. po 72h inkubacji w Sn 20,00% 20,00% 20,00% 0,00% 0,00% 0,00% ,00% 0,00% 0,00% -20,00% -20,00% -20,00% [um] HEK-293 WC

30 Kinaza białkowa C (PKC) NaleŜy do rodziny izoenzymów zaleŝnych od fosfolipidów Katalizuje fosforylację białek na serynie i treoninie Izoformy PKC: a) Konwencjonalne: α, βι, ΒΙΙ, γ aktywacja przez diacylglicerol, fosfatydyloserynę lub estry forbolu w sposób zaleŝny od Ca ++ b) Nowe: δ, ε, η, µ, θ aktywacja przez diacylglicerol, fosfatydyloserynę w sposób niezaleŝny od Ca ++ c) Nietypowe: λ, ζ, ι- aktywacja ω sposób niezaleŝny zarówno diacylglicerolu jak i od Ca ++ Wpływ DPhT na ekspresję, lokalizację i fosforylację Cx43 w komórkach HEK µm Sroka et al., Toxicology Letters (2008)

31 Wpływ tributylocyny na Ŝywotność komórek białaczki eozynofilowej EoL-1 Viability Cell viability [%] 100% 75% TBT TBT + selenite 50% 25% 0% TBT [nm] Cisplatyna, karboplatyna, paclitaxel, docetaxel- właściwości hamujące proliferację komórek nowotworowych Związki metalohalogenowe właściwości antynowotworowe w stosunku do: leukemii P388 and L1210, raka jelita 38 i płuc Lewisa, melanomy B16, raka wysiękowego Ehrlicha Organiczne związki cyny- właściwości antynowotworowe