Reaktywne formy tlenu

Transkrypt

1 Reaktywne formy tlenu Aneta Wójcik Jolanta Czerniak Zastosowanie nowych metod wykrywania wolnych rodników, przy użyciu spektroskopii mikrofalowej (ESR, EPR), poznanie ich znaczenia w stanach zdrowia i choroby organizmów żywych, zapoczątkowało w biologii i medycynie dziedzinę badań wolnorodnikowych. Uważa się, że w oparciu o zjawisko elektronowego rezonansu spinowego będzie możliwe obrazowanie wolnych rodników w narządach i tkankach ciała. Terminem wolne rodniki określa się atomy lub cząsteczki zdolne do samodzielnego istnienia, mające jeden lub więcej niesparowanych elektronów. W przypadku omawiania produktów jedno-, dwu- i trójelektronowej redukcji cząsteczki tlenu oraz tlenu singletowego używamy określenia reaktywne formy tlenu (RFT). Reaktywne formy tlenu są produktami kolejnych stopni redukcji tej cząsteczki. Redukcja może przebiegać w kilku etapach lub w jednym etapie czteroelektronowym. Reaktywne formy tlenu mogą powstać m.in. w wyniku: działania czynników fizycznych - promieniowania jonizującego, ultrafioletowego ultradźwięków, fotosensybilizacji, utleniania zredukowanych form niskocząsteczkowych składników komórek, ksenobiotyków, reakcji enzymatycznych, funkcjonowania łańcucha oddechowego w mitochondrium, działania peroksysomów. Mitochondria są głównym źródłem RFT w komórce eukariotycznej. Reaktywne formy tlenu powstają jako produkt uboczny metabolizmu tlenowego lub w warunkach stresu oksydacyjnego. Około 95% przyswajanego z atmosfery tlenu jest w warunkach fizjologicznych redukowane w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym, z udziałem oksydazy cytochromowej do cząsteczki wody. Metabolizm tylko 5% tego pierwiastka prowadzi do wytworzenia rodników tlenowych, których toksyczność jest niwelowana przez liczne mechanizmy obronne. Pełna redukcja molekularnego tlenu zachodzi pod wpływem kompleksu oksydazy cytochromowej przez przyłączenie 4ē do cząsteczki O 2. Przyłączenie 1ē powoduje generację rodnika ponadtlenkowego zgodnie z reakcją: - O 2 + ē O 2 W wyniku dwuelektronowej redukcji cząsteczki tlenu molekularnego wg reakcji: O 2 + 2ē + 2H + H 2 O 2

2 powstaje nadtlenek wodoru. Może on być również produktem spontanicznej lub enzymatycznej dysmutacji, katalizowanej przez dysmutazę ponadtlenkową. Trójelektronowa redukcja cząsteczki O 2 przebiega zgodnie z reakcją: O 2 + 3ē + 3H + H 2 O + OH Rodnik OH jest najbardziej reaktywnym i toksycznym wolnym rodnikiem, który powstaje również w tzw. reakcji Fentona i Habera-Weissa wymagającej in vivo obecności jonów metali przejściowych (żelaza lub miedzi): Fe +2 + H 2 O 2 Fe +3 + OH + OH - Cu + + H 2 O 2 Cu +2 + OH + OH - W reakcji Habera-Weissa: rodnik hydroksylowy tworzy się zgodnie z reakcją: Fe +3 O H 2 O 2 OH + OH - + O 2 Tlen singletowy ( 1 O 2 ), analogicznie jak H 2 O 2, nie jest wolnym rodnikiem, ale wykazuje podobną jak wolne rodniki dużą aktywność chemiczną. Reakcją prowadzącą do otrzymywania 1 O 2 jest: O HO 2 + H + H 2 O O 2 lub O OH 1 O 2 + OH - Tlen singletowy może powstać także w wyniku działania peroksydaz np. hydroksyperoksydazy prostaglandynowej. Chemicznie cechuje się szczególną reaktywnością w stosunku do wiązań podwójnych. Posiada zdolność uszkodzeń reszt aminokwasowych białek (His,Met,Tyr,Cys) Przejawia działanie bakteriobójcze i bakteriostatyczne. W warunkach fizjologicznych RFT uczestniczą m.in. w procesach: utleniania i redukcji w łańcuchu oddechowym, odtwarzania źródeł energii w postaci wysokoenergetycznych związków fosforanowych, indukują różnicowanie komórek, aktywują m.in. onkogen c-fos, indukują apoptozę, jako wtórne przekaźniki uczestniczą w procesie wzrostu i śmierci komórki, odtruwania organizmu z substancji toksycznych, syntezy prostaglandyn i leukotrienów, podziału i rozwoju organizmów przez aktywację białek kierujących tym procesem, metabolizmu ksenobiotyków, wpływają rozszerzająco lub kurcząco na ścianę naczyń krwionośnych. Reaktywne formy tlenu, jak również produkty ich przemian o wysokiej reaktywności posiadają znaczny wpływ na biochemię i fizjologię komórki. Wywołują: uszkodzenie struktury DNA, pękanie chromosomów, depolimeryzację kwasu hialuronowego, tworzenie nieprawidłowych wiązań krzyżowych w kolagenie i elastynie, uszkodzenie struktury i zaburzenie funkcji błon komórkowych, inaktywację enzymów. RFT odgrywają również istotną rolę w: toksycznym uszkodzeniu spowodowanym związkami chemicznymi takimi jak: parakwat, czterochlorek węgla, leki, alkohol, dym papierosowy, chemicznej i środowiskowej karcinogenezie spowodowanej np. przez

3 benzopiren, działaniu chemioterapeutyków np. doxorubicyny i bleomycyny, zespole niedokrwienia i reperfuzji. Endogenne wolne rodniki tworzone są w organizmie, najczęściej w układach związanych z systemem błon komórkowych, dlatego szczególnie narażone na ich działanie są lipidy błonowe, a głównie nienasycone kwasy tłuszczowe. Proces peroksydacji lipidów jest to wolnorodnikowy proces utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych lub innych lipidów, w których powstają nadtlenki tych związków. W procesie peroksydacji wyróżniamy 3 etapy: inicjacja - polega na oderwaniu atomu wodoru od cząsteczki wielonienasyconego kwasu tłuszczowego lub reszty takiego kwasu wchodzącej w skład fosfolipidu. Czynnikiem odrywającym wodór od cząsteczki wielonienasyconego kwasu tłuszczowego może być rodnik: OH (hydroksylowy), LOO (nadtlenkowy), LO (alkoksylowy), L (alkilowy). Również inne czynniki mogą inicjować proces peroksydacji np.ozon, tlenek i dwutlenek azotu, SO 2, oraz kationorodniki: ferrylowy i nadferylowy. Oderwaniu ulega jeden z atomów wodoru związanych z atomem węgla pomiędzy dwoma wiązaniami podwójnymi, gdyż podwójne wiązania osłabiają wiązanie C-H w przyległych atomach węgla. Reakcja inicjacji przekształca cząsteczkę kwasu tłuszczowego w wolny rodnik alkilowy L. prolongacja (propagacja) - wolne rodniki alkilowe L reagują z tlenem tworząc wolne rodniki nadtlenkowe LOO : L + O 2 LOO LOO + LH LOOH + L terminacja - etap ten może prowadzić do reakcji pomiędzy dwoma wolnymi rodnikami alkilowymi, nadtlenkowymi lub różnymi rodnikami jakie występują w układzie: L + L L L LOO + LOO L O + LOH + O 2 LOO + L L O + LOH. Produktami reakcji terminacji są dimery kwasów tłuszczowych oraz keto- lub hydroksykwasy tłuszczowe, czyli zmodyfikowane uszkodzone cząsteczki lipidów. W procesie peroksydacji lipidów występuje zjawisko reinicjacji. Polega ono na tym, że nadtlenki lipidów - czyli nierodnikowe produkty peroksydacji mogą ulegać rozkładowi prowadzącemu znów do powstania produktów wolnorodnikowych. Rozpad taki jest inicjowany przez jony metali przejściowych (szczególnie przez jony żelaza i miedzi). Natomiast produkty procesu peroksydacji podlegają dalszym przemianom. Są to m.in reakcje zachodzące drogą -eliminacji, które prowadzą do rozpadu reszt wielonienasyconych kwasów tłuszczowych i powstania kilku lub kilkunastowęglowych fragmentów. Powstające poprzez działanie wolnych rodników wodoronadtlenki lipidowe ulegają następnie reakcjom w wyniku których powstaje szereg niskocząsteczkowych produktów peroksydacji aldehydów, alkenali,, nienasyconych hydroksyalkenali, ketonów, ketokwasów, epoksydów, furanów, hydroksykwasów. Najczęściej powstaje dialdehyd malonowy oraz hydroksyaldehydy i węglowodory. Produkty końcowe procesu peroksydacji np. aldehydy są mniej reaktywne niż wolne rodniki. Aldehydy reagują z grupami tiolowymi i aminowymi białek, a także lipidów, aminokwasów i zasad azotowych wchodzących w skład kwasów nukleinowych. Połączenie aldehydów z grupami NH 2 powoduje powstanie zasad Schiffa, które mogą ulegać dalszym przekształceniom do bardziej trwałych produktów. Końcowe produkty peroksydacji lipidów: zmieniają właściwości antygenowe białek z którymi się łączą, hamują aktywność enzymów, co prowadzi do hamowania replikacji DNA i transkrypcji, powodują pęknięcia nici DNA, są cytotoksyczne, działają mutagennie, karcinogennie,

4 obniżają hydrofobowość lipidowego wnętrza błon komórkowych, co powoduje wzrost przepuszczalności błon dla jonów H + i innych substancji polarnych, wpływają na depolaryzację błony, zaburzają asymetrię lipidową błon powodując np. pojawienie się na zewnętrznej powierzchni błony plazmatycznej fosfatydyloseryny, prawidłowo obecnej tylko w wewnętrznej cytoplazmatycznej części dwuwarstwowej lipidowej błony, hamują aktywność enzymów błonowych i białek transportujących, powodują rozprzęganie fosforylacji oksydacyjnej w mitochondriach. Procesowi peroksydacji podlegają również białka, aminokwasy i kwasy nukleinowe, ale szybkość tego procesu jest znacznie niższa niż w przypadku peroksydacji lipidów. Peroksydacja białek i kwasów nukleinowych nie ma charakteru reakcji łańcuchowej. Powstałe nadtlenki białek, aminokwasów i innych związków mogą być traktowane jako wtórne przekaźniki uszkodzeń wywołanych przez RFT. Powstawanie wielu biologicznie aktywnych czynników zależne jest od peroksydacji wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Przykładem jest synteza prostanoidów - prostaglandyn, tromboksanów, leukotrienów z kwasu arachidonowego, inicjowana jest przez reakcje peroksydacji. Reakcje te katalizowane są przez cyklooksygenazę i lipooksygenazy. Wolne rodniki w stanach chorobowych Wolne rodniki stanowią czynnik obrony organizmu (zwalczają zakażenia bakteryjne, przez udział w procesach fagocytozy i niszczeniu bakterii). Są także czynnikiem uszkadzającym tkanki i mogą być przyczyną wielu chorób. Do jednostek chorobowych, w których etiopatogenezie postulowano udział wolnych rodników należą m.in : miażdżyca tętnic, choroby nowotworowe i stany przednowotworowe, cukrzyca, choroby układu oddechowego (np. dysplazja oskrzelowo-płucna), choroby autoimmunologiczne (kolagenozy, reumatoidalne zapalenie stawów), zespoły hemolityczne (talasemie, anemia sierpowata), choroby nerek (ostra niezapalna niewydolność nerek, martwica kory nerek, śródmiąższowe niebakteryjne zapalenie nerek), zaćma, choroba neuronów motorycznych, choroba wrzodowa żołądka i dwunastnicy, zespół przyśpieszonego starzenia się (progeria), choroba Parkinsona, zatrucie metalami. W celu oceny stresu oksydacyjnego w sytuacjach patologicznych, a także w monitorowaniu i ocenie terapii antyoksydacyjnej mają zastosowanie kliniczne markery stresu oksydacyjnego. Do klinicznych markerów stresu oksydacyjnego zaliczamy: całkowitą pojemność antyoksydacyjną osocza - oznaczanie TAS, enzymy antyoksydacyjne, antyoksydanty nieenzymatyczne, markery metabolizmu tlenku azotu, oksydowane białka - oznaczanie grup karbonylowych białek, marker uszkodzenia białek - oznaczanie 3-nitrotyrozyny oksydowany DNA - oznaczanie 8-hydroksy-2 - deoksyguanozyny(8-ohdg). oksydowane lipidy - oznaczanie MDA (dialdehyd malonowy) i przeciwciał przeciw utlenionej postaci LDL - (Ab oxldl), izoprostany- pokrewne prostaglandynom produkty nieenzymatycznego

5 utleniania kwasu arachidonowego, Do parametrów antyoksydacyjnych enzymatycznych stanowiących tzw. pierwszą linię obrony należą: dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza, peroksydaza glutationowa, reduktaza glutationowa, S-transferaza glutationowa, ceruloplazmina. Natomiast do antyoksydantów nieenzymatycznych stanowiących drugą linię obrony i usuwających wolne rodniki przed zapoczątkowaniem reakcji łańcuchowych zaliczamy: witaminy: C, E, -karoten, zmiatacze wolnych rodników (glutation,adrenalina, bilirubina, biliwerdyna, kwas moczowy, tiomocznik, albuminy, glukoza), białka osoczowe i wewnątrzkomórkowe uczestniczące w chelatacji jonów żelaza i miedzi. Do trzeciej linii obrony przed RFT należą enzymy, które dokonują naprawy uszkodzeń już powstałych przez wolne rodniki. Zaliczamy do nich enzymy antyoksydacyjne o aktywności oksydoreduktaz : paraoksonaza (PON) - redukująca produkty peroksydacji lipidów tioredoksyna (TRX) - redukująca mostki disulfidowe powstałe w procesie peroksydacji DNA. Dysmutaza ponadtlenkowa (EC ; SOD) Enzym ten występuje m.in. w cytozolu, mitochondriach, peroksysomach oraz na zewnątrz komórek. Dysmutaza ponadtlenkowa posiada 3 izoenzymy: SOD-1(związana z atomami Cu i Zn), znajduje się w cytoplazmie komórki, SOD-2 (zawierająca Mn) - występuje w mitochondrach oraz EC-SOD, SOD-3 (pozakomórkowa występująca w osoczu krwi, limfie, płynie maziowym stawów i śródmiąższowym tkanek). Izoenzymy te katalizują reakcję dysmutacji - czyli dysproporcjonowania rodnika ponadtlenkowego do nadtlenku wodoru i tlenu zgodnie z reakcją: 2O H + H 2 O 2 + O 2 Katalaza (EC ; CAT) W peroksysomach, glioksysomach i cytozolu, występują izoformy CAT-1 i CAT-2. Natomiast w mitochondriach CAT-3. Enzym ten przeprowadza reakcję dysproporcjonowaniua H 2 O 2 do H 2 O i tlenu zgodnie z reakcją: 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2. Peroksydaza glutationowa (EC ; GPx) Występuje w cytozolu i mitochondriach. Tylko w erytrocytach nie istnieje rozgraniczenie katalazy i peroksydazy w oddzielnych kompartmentach komórek. Peroksydaza glutationowa posiada następujące izoformy: cgp-x (wewnątrzkomórkowa - rozkłada nadtlenek wodoru),gi-gp-x (znajdująca się w ścianie przewodu pokarmowego, wątrobie, niektórych liniach komórek nowotworowych - stanowi barierę przed nadtlenkami i ksenobiotykami), pgp-x (osoczowa w płynach pozakomórkowych i tkankowych - obrona przestrzeni pozakomórkowej),phgp-x (peroksydaza glutationowa wodoronadtlenków fosfolipidów - redukuje wodoronadtlenki fosfolipidów, nadtlenek wodoru, nadtlenki cholesterolu oraz nadtlenek tyminy. Enzym ten pełni istotną rolę w ochronie błon komórkowych przed peroksydacją lipidów). Peroksydaza glutationowa katalizuje następujące reakcje: H 2 O 2 + 2GSH 2H 2 O + GSSG ROOH + 2GSH ROH + GSSG + H 2 O Powstająca w tej reakcji utleniona forma glutationu, disulfid glutationu (GSSG), jest związkiem niebezpiecznym dla komórki, ponieważ może utleniać grupy tiolowe białek lub tworzyć mieszane

6 dwusiarczki z białkami, prowadząc do ich inaktywacji. Dlatego z GP-x współdziała enzym reduktaza glutationowa. Reduktaza glutationowa (E.C ; GSSG-RED) Enzym ten odtwarza zredukowaną formę glutationu kosztem utlenienia NADPH: GSSG + NADPH + H + 2 GSH + NADP + Utleniony fosforan dinukleotytu nikotynamidoadeninowego ulega regeneracji przez enzymy, katalizujące reakcje utleniania, których kosubstratem jest NADP +. W erytrocycie jedynym źródłem NADPH jest cykl pentozowy. Transferaza glutationowa (EC ;GST) Enzym ten chroni mitochondria przed różnymi toksycznymi związkami, w tym produktami peroksydacji lipidów przez zdolność grupy tiolowej glutationu, (która reaguje z różnymi związkami elektrofilowymi), do powstania koniugatów glutationu, usuwanych następnie na zewnątrz mitochondriów, a dalej na zewnątrz komórek. Po usunięciu z mitochondrium koniugatu GSH z toksyną, zapas GSH w organelli musi być uzupełniony przez pobranie go z cytozolu. W mitochondriach ssaków stwierdzono obecność kilku lizoform S- transferazy glutationowej. Anionorodnik ponadtlenkowy + 4O 2 + 4H dysmutaza ponadtlenkowa 2O 2 Katalaza 2H O 2 2 4H O 2 2H O + O 2 2 Peroksydaza glutationowa 4GSH 2GSSG Reduktaza glutationowa NADPH+H NADP + + Cykl pentozowy i inne reakcje Rycina 1. Udział enzymów antyoksydacyjnych w inaktywacji wolnych rodników.

7 Do najważniejszych przeciwutleniaczy nieenzymatycznych zaliczamy glutation, witaminy: C, E i - karoten. Glutation w warunkach stresu oksydacyjnego dochodzi do bezpośredniego utlenienia przez reaktywne formy tlenu komórkowych grup SH. Produktem utlenienia tych grup są rodniki tiolowe -S ulegające dimeryzacji do disulfidów. Glutation chroni komórkę przed oksydacyjnym uszkodzeniem grup SH białek poprzez tiolację rodników tiolowych. W wyniku reakcji z wolnymi rodnikami organicznymi GSH przekazuje atom wodoru na ten rodnik i powstaje rodnik glutationylowy. Rodnik ten może tworzyć disiarczek glutationu w procesie dimeryzacji. Stres oksydacyjny powoduje wzrost stężenia utlenionego glutationu. Utleniony glutation może reagować z grupami SH białek, a produktami tych reakcji są mieszane disulfidy glutationowo-białkowe. Jeżeli regeneracja GSSG przekracza możliwości redukcyjne komórki, to związek ten jest aktywnie transportowany na zewnątrz przez białka transbłonowe. Dla utrzymania prawidłowego poziomu GSH konieczna jest jego regeneracja przy udziale reduktazy glutationowej przekazującej protony H bezpośrednio z NADPH. Witamina C silne redukujące właściwości kwasu askorbinowego decydują o jego właściwościach antyoksydacyjnych wobec reaktywnych form tlenu i wolnych rodników. Stanowi istotny antyoksydant płynów pozakomórkowych i wewnątrzkomórkowych. Prooksydacyjne działanie askorbinianu polega na redukcji jonów metali Fe 3+. Zredukowane jony metali mogą redukować tlen. Cykl ten może się powtarzać wytwarzając anionorodnik ponadtlenkowy, którego rozpad daje nadtlenek wodoru. W obecności jonów metali przejściowych może zachodzić reakcja Fentona, a askorbinian może dodatkowo, obok O 2 - pełnić rolę reduktora Fe 3+. Witamina C posiada wszystkie cechy potrzebne do spełnienia roli antyoksydanta, jest obecna w adekwatnym stężeniu, reaguje z różnymi wolnymi rodnikami, występuje w różnych kompartmentach, jest częściowo regenerowana i łatwo osiągalna przez organizm. Na granicy interfaz może dochodzić do kooperacji pomiędzy witaminą C i E. Witamina C więc pośrednio uczestniczy w zmiataniu wolnych rodników również w warstwie lipidowej - regenerując w tym mechanizmie witaminę E. Witamina E czyli -tokoferol, to główny hydrofobowy antyoksydant chroniący błony komórkowe przed działaniem RFT. Działanie tokoferolu polega na usuwaniu wolnych rodników organicznych, głównie produktów powstałych w wyniku peroksydacji lipidów. Podczas reakcji tokoferolu z rodnikami organicznymi powstaje mało reaktywny wolny rodnik tokoferylowy, który może ulec regeneracji z udziałem zredukowanej formy koenzymu Q w obrębie błony lub askorbinianu na granicy fazy wodnolipidowej, jak również wejść w reakcję z innym wolnym rodnikiem, co oznacza terminację dwóch ciągów reakcji wolnorodnikowych. Może też ulec redukcji przez inne antyoksydanty co prowadzi do odtworzenia wyjściowej struktury tokoferolu. Inne możliwości terminacji reakcji wolnorodnikowych przez wolny rodnik tokoferylowy obejmują rekombinację rodników tokoferylowych lub addycję rodnika tokoferylowego do rodnika nadtlenkowego, a to oznacza terminację ciągu reakcji. Uważa się, że efekt netto działania - tokoferolu zależy od równowagi pomiędzy jego wpływem prooksydacyjnym i antyoksydacyjnym, co z kolei jest uwarunkowane szybkością tworzenia wolnych rodników oraz stężeniem ko/antyoksydantów -tokoferolu. Beta karoten.jest to efektywny wygaszasz tlenu singletowego, reaguje również z organicznymi wolnymi rodnikami, powstającymi w procesie peroksydacji lipidów. W wyniku reakcji addycji rodnika nadtlenku lipidu do - karotenu powstaje wolny rodnik, który może reagować z następnym rodnikiem nadtlenku lipidu. Powstały addukt karotenowy dwóch rodników nadtlenkowych ma zdolność reakcji z następnymi rodnikami, tworząc wielokrotne addukty.

8 Metody badania aktywności enzymów antyoksydacyjnych Oznaczanie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej Do oznaczania aktywności SOD służy m.in. metoda McCord a i Fridovich a. W metodzie tej wykorzystywany jest układ ksantyny i oksydazy ksantynowej produkujący anionorodniki ponadtlenkowe O 2 -, które przeprowadzają między innymi redukcję formazanu: formazan + O 2 - barwnik formazanowy + O 2 Dodany enzym przez katalizowanie reakcji dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego hamuje redukcję cytochromu c. Pomiaru ekstynkcji dokonujemy przy długości fali 550 nm. Jedna jednostka SOD jest to ilość enzymu zdolna do 50% inhibicji redukcji utlenionego cytochromu c w warunkach metody. Aktywność SOD wyrażamy w U/g Hb lub białka. Oznaczenie aktywności SOD może zostać wykorzystane w diagnostyce chorób z nieprawidłowym ich poziomem, w celu określenia skuteczności terapeutycznej i potencjału przeciwutleniaczy w lekach, a także w badaniach pomagających w identyfikacji jednostek chorobowych z udziałem wolnych rodników. Oznaczanie aktywności katalazy Metoda Aebi - stwarza możliwość śledzenia rozkładu H 2 O 2 przez enzym, poprzez pomiar spadku ekstynkcji, przy =240 nm, paśmie charakterystycznym dla nadtlenku wodoru. Aktywność katalazy wyraża się w jednostkach k/g Hb lub białka. k - jest to stała szybkości reakcji I rzędu. Oznaczanie aktywności peroksydazy glutationowej Metoda Paglia i Valentin'a w modyfikacji Lawrenca i Burka, służy do oznaczenia aktywności tego enzymu. W metodzie tej wykorzystuje się współdziałanie peroksydazy glutationowej i reduktazy glutationowej: Se-GPx Reduktaza glutationowa 2GSH + H 2 O 2 2 H 2 O + GSSG 2GSH Utleniony glutation, jest redukowany w reakcji katalizowanej przez reduktazę glutationową, która stanowi jeden ze składników mieszaniny reakcyjnej. Przejściu temu towarzyszy utlenienie NADPH + + H + do NADP +, manifestujące się spadkiem absorbancji przy długości fali 340 nm. Aktywność enzymu wyrażona jest jako mol utlenionego NADPH/min/g Hb lub białka. Pomiar statusu GP-x ma zastosowanie u pacjentów z obniżoną aktywnością GP-x i stężeniem selenu. Oznaczenie to wykonuje się również u osób z podniesionym ryzykiem wystąpienia niedoboru selenu- związanym np.: z starszym wiekiem, paleniem tytoniu, alkoholizmem, oraz u których stwierdzono uszkodzenie nerek, chorobę Crohna, choroby autoalergiczne lub prowadzi się chemioterapię. Oznaczanie aktywności reduktazy glutationowej Enzym ten odtwarza zredukowaną formę glutationu kosztem utlenienia NADPH: zgodnie z reakcją: GSSG + NADPH + H + 2GSH + NADP + charakteryzującą się zmniejszoną absorbancją przy długości fali 340 nm. Oznaczenie reduktazy glutationowej ma zastosowanie przy wykrywaniu chorób wątroby i złośliwych zmian nowotworowych, oceny sposobu żywienia (stanu ryboflawiny).

9 Metoda badania całkowitego poziomu przeciwutleniaczy Oznaczanie całkowitego statusu antyoksydacyjnego osocza - TAS Inkubacja ABTS z peroksydazą (metamioglobina) i wodą utlenioną wytwarza rodnikowy kation ABTS.+ o kolorze niebiesko-zielonym, której pomiaru dokonujemy przy długości fali 600nm. Przeciwutleniacze obecne w osoczu lub surowicy pacjenta powstrzymują tę reakcję i powstawanie niebiesko-zielonego zabarwienia. Stopień tego hamowania jest proporcjonalny do stężenia przeciwutleniaczy w próbce pacjenta. Zestaw TAS może być wykorzystany do badań klinicznych celem ustalenia zależności pomiędzy poziomem przeciwutleniaczy i ryzykiem zachorowania. Może służyć do określenia stanu odżywiania pacjentów. W badaniach farmaceutycznych powyższy zestaw może być wykorzystany do określenia przeciwutleniającego potencjału leków, a także w monitorowaniu wprowadzonego leczenia lub ewentualnej jego szkodliwości. Metody badania peroksydacji lipidów Reakcja z kwasem tiobarbiturowym W badaniach peroksydacji lipidów stosuje się metodę opartą na reakcji dialdehydu malonowego (MDA) z kwasem tiobarbiturowym. Powstaje barwny produkt pomiędzy kwasem tiobarbiturowym i niektórymi produktami peroksydacji lipidów w środowisku kwaśnym, w podwyższonej temperaturze. Tworzący się produkt ma różowe zabarwienie i jego stężenie oznaczane jest na podstawie pochłaniania światła przy długości fali 535 nm. Stężenie produktów peroksydacji lipidów reagujących z kwasem tiobarbiturowym w osoczu krwi osób zdrowych wynosi: mężczyźni: 3,1 0,6 mol x l -1 kobiety: 3,0 0,5 mol x l -1 Jodometryczny pomiar stężenia nadtlenków Metoda polega na utlenieniu jodku przez wodoronadtlenki. Uwolniony jod jest oznaczony absorpcjometrycznie. Badanie przeprowadza się w warunkach beztlenowych, w atmosferze azotu lub argonu. Spektrofotometryczna detekcja skoniugowanych dienów Oderwanie atomu wodoru od reszty wielonienasyconego kwasu tłuszczowego powoduje przegrupowanie wiązań podwójnych, w wyniku którego powstają sprzężone dieny. Możemy zaobserwować charakterystyczny pik absorpcji światła przy długości fali 234 nm. Pomiar zależności absorpcji światła o tej długości fali, od czasu peroksydacji lipoprotein osocza krwi, wykazuje istnienie dwóch maksimów pochłaniania. Za powstanie pierwszego maksimum absorpcji odpowiedzialne są nadtlenki, natomiast za drugie produkty ich rozpadu. Chemiluminescencja Emisja światła podczas procesu peroksydacji lipidów może nastąpić, kiedy w wyniku reakcji zachodzącej pomiędzy dwoma rodnikami nadtlenkowymi tworzy się tlen singletowy, lub w reakcji między dwoma rodnikami alkoksylowymi prowadzącej do powstawania ketonów w stanie wzbudzonym. Większość RFT wykazuje dużą reaktywność, stąd występują trudności w ich wykrywaniu. Do detekcji i identyfikacji wolnych rodników stosuje się różnorodne metody. Tylko metoda ESR (elektronowy rezonans spinowy) umożliwia bezpośrednie wykrywanie i określenie typu wolnego rodnika. Stosując ESR bezpośrednią otrzymujemy informacje strukturalne. Wadą tej metody jest jednak utrudniona detekcja rodników krótkotrwałych. W przypadku metody pośredniej, która ma szerokie zastosowanie, informacje strukturalne o badanych wolnych rodnikach mogą być utracone.

10 Zastosowanie techniki elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) umożliwia bezpośrednie wykrywanie i określenie typu wolnego rodnika. Podstawą jest zjawisko rezonansowej absorpcji fali elektromagnetycznej przez próbkę umieszczoną w stałym polu magnetycznym. Możliwe jest badanie sygnałów EPR : rodników istniejących w układach biologicznych, kompleksów metali przejściowych, materiałów napromienionych, rodników uzyskiwanych metodą znakowania związkami N- tlenkowymi. Zastosowanie techniki EPR pozwala badać zjawiska w czasach rzędu s.

11 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA ĆWICZENIE 1. Oznaczanie stężenia ceruloplazminy w surowicy krwi. Zasada metody Ceruloplazmina wykazuje aktywność oksydazy polifenolowej. Najlepszym niefizjologicznym jej substratem jest p-fenylenodiamina (PPD) oraz jej metylowe pochodne. Wykorzystano to do oznaczenia enzymatycznego utleniania PPD przez ceruloplazminę. Ceruloplazmina przekształca substrat w wolny rodnik, który reaguje z nadmiarem utlenionej PPD, tworząc niebieskofioletowy produkt. Jony miedzi w ceruloplazminie ulegają redukcji do jonów miedziawych. W próbce kontrolnej aktywność enzymu hamowana jest za pomocą azydku sodu. Materiał badany surowica Odczynniki bufor octanowy o ph = 5,6 roztwór substratu PPD 7,95 mmol/l roztwór azydku sodu 460 mmol/l Wykonanie Do probówek chemicznych odmierzyć według schematu: Składnik próby (ml) Próba badana (B) Próba kontrolna (K) roztwór substratu PPD 2,00 2,00 roztwór azydku sodu - 0,40 Surowica 0,04 0,04 inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 C roztwór azydku sodu 0,4 - Odczytać absorbancję próby badanej i kontrolnej przy długości fali 546 nm wobec wody destylowanej. Obliczanie wyniku Stężenie ceruloplazminy (Cp) Cp( mg / dl ) 237 ( A B AK ) gdzie: A B - absorbancja próby badanej A K - absorbancja próby kontrolnej współczynnik oznaczony empirycznie przy użyciu oczyszczonej ceruloplazminy.

12 ĆWICZENIE 2. Oznaczanie stężenia produktów peroksydacji lipidów - reakcja z kwasem tiobarbiturowym Zasada metody W badaniach peroksydacji lipidów stosuje się metodę opartą na reakcji dialdehydu malonowego MDA z kwasem tiobarbiturowym (TBA). Powstaje barwny addukt pomiędzy kwasem tiobarbiturowym i niektórymi produktami peroksydacji lipidów w środowisku kwaśnym, w podwyższonej temperaturze. Tworzący się produkt ma różowe zabarwienie i jego stężenie oznaczane jest na podstawie pochłaniania światła przy długości fali 535 nm. Materiał badany osocze Odczynniki mieszanina reakcyjna - 0,25 N roztwór HCl; 15% TCA (kwas trójchlorooctowy); 0,375% TBA (kwas tiobarbiturowy) Wykonanie Do szklanych probówek chemicznych z korkami odmierzyć według schematu: Składnik próby (ml) Próba badana (B) Próba odczynnikowa (O) Osocze 0,5 - woda destylowana - 0,5 mieszanina reakcyjna 1,5 1,5 Zawartość probówek wymieszać. Wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Następnie próby ochłodzić, odwirować przez 10 minut przy 3000 obr./min. Ekstynkcję próby badanej zmierzyć względem próby odczynnikowej przy długości fali 535nm. Obliczanie wyniku Stężenie substancji reagujących z TBA 4 TBA ( nmol/ ml) E B 0,156 gdzie: E B - ekstynkcja próby badanej 0,156 - molowy współczynnik absorpcji 4 - krotność rozcieńczenia