RODZICIELSKIE PIĘTNOWANIE GENOMOWE. EPIGENETYKA W CHOROBACH NEUROLOGICZNYCH.

Transkrypt

1 RODZICIELSKIE PIĘTNOWANIE GENOMOWE. EPIGENETYKA W CHOROBACH NEUROLOGICZNYCH. Monika Gos Instytut Matki i Dziecka, Warszawa Kurs: Neurogenetyka i genetycznie uwarunkowane choroby narządów zmysłów

2 MECHANIZMY REGULACJI EPIGENETYCZNEJ metylacja: (wyspy CpG, zahamowanie ekspresji) modyfikacje białek histonowych: acetylacja, metylacja, fosforylacja, ubikwitynacja (efekt zależny od miejsca i charakteru modyfikacji) struktura chromatyny: gęstość upakowania chromatyny (eu- i heterochromathna nieaktywna transkrypcyjnie) struktury przestrzenne tworzone przez chromatynę (pętle) oddziaływanie z kompleksami białkowymi niekodujące cząsteczki RNA: małe (<200pz, mikrorna, snrna i snorna) i duże (>200pz, lncrna)

3 Modyfikacje a ekspresja genów Aktywacja ekspresji genu otwarta struktura chromatyny niemetylowane cytozyny acetylowane histony (HAT) Zahamowanie ekspresji genu zamknięta struktura chromatyny metylowane cytozyny (DNMT) deacetylacja histonów (HDAC)

4 Regulacja epigenetyczna mechanizm nie jest związany ze zmianą sekwencji DNA wzór piętna genomowego musi być utrzymany w tracie podziałów komórkowych i różnicowania się komórek wzór piętna musi zostać rozpoznany przez aparat transkrypcyjny, tak aby doszło do ekspresji genu z odpowiedniego allelu jest potencjalnie odwracalne (odwracalność jest warunkiem koniecznym do ustalenia wzoru piętna genomowego specyficznego dla płci) może mieć charakter losowy (inaktywacja chromosomu X), jak również zależeć od pochodzenia rodzicielskiego Zaburzenia lub zmiana regulacji epigenetycznej efekt fenotypowy

5 Niekodujące RNA (non-coding RNA, ncrna) microrna snrna małe ncrna (<200nt) trna snorna ncrna pirna długie ncrna (>200nt) rrna inne ncrna

6 Niekodujące cząsteczki RNA (ncrna) ekspresja 60% genów kodujących białka jest regulowana przy udziale mirna 70% mirna ekspresja w mózgu (specyficzna dla neuronów) Przykłady: mir-206 ALS mir-9 SMA mir-19, mir-101, mir-130 SCA typ I

7 Funkcje ncrna 1. Imprinting i regulacja dawki ekspresji genu lokalizacja w piętnowanych loci 2. Pluripotencja komórek macierzystych RoR lncrna reg. przez Oct4, Sox2 i Nanog 3. Rozwój embrionalny (segmentacja ciała) regulacja ekspresji genów Hox 4. Hematopoeza 5. Inaktywacja chromosomu X (Xist) 6. Różnicowanie komórek układu nerwowego TUG1 lncrna siatkówka; brak fotoreceptorów wpływ na ekspresję genów (cis i trans) Hipoteza 1: odgrywają rolę regulatorową względem kompleksów białkowych odpowiedzialnych za modyfikację struktury chromatyny (brak zdolności do wiązania się z DNA)

8 Epigenetyka mechanizm adaptacyjny? 1944 klęska głodu Holandia kobiety I trymestr ciąży kobiety III trymestr ciąży prawidłowa masa urodzeniowa; otyłość i choroby układu krążenia obniżona masa urodzeniowa; nadciśnienie i insulinooporność ekspresja genów odpowiedzialnych za metabolizm glukozy i kwasów tłuszczowych adaptacja do warunków środowiska warunki stresowe wzrost ryzyka rozwoju depresji i nerwicy ZMIANY EPIGENETYCZNE SĄ SZYBSZE NIŻ MUTACJE DNA

9 Defekty epigenetyczne w ciągu życia a choroby cywilizacyjne Wraz z wiekiem poza kumulacją mutacji punktowych w organizmie zachodzą także zmiany epigenetyczne NOWOTWORY INNE CHOROBY CYWILIZACYJNE cukrzyca, choroby serca, nabyta NI Genetyczno-epigenetyczny model powstawania chorób kompleksowych 1. rozwój choroby zależy od podłoża genetycznego oraz działania czynników epigenetycznych 2. czynnik epigenetyczny (DNA, chromatyna) może być modyfikowany przez czynniki środowiskowe 3. również warianty sekwencji genów odpowiedzialnych za regulację ekpresji genów mogą wpływać na powyższe zmiany 4. Starzenie się proces utraty plastyczności fenotypowej w czasie

10 Uszkodzenia epigenotypu CHOROBY EPIGENETYCZNE nieprawidłowy wzór epigenetyczny mutacje w genach kodujących modyfikatory epigenetyczne

11 Zespół łamliwego chromosomu X (FXS) Częstość występowania: 1/4000 mężczyzn, 1/8000 kobiet Częstość nosicielstwa: 1/800 mężczyzn, 1/250 kobiet Cechy kliniczne (chłopcy z pełną mutacją): 1. opóźniony rozwój mowy i psychoruchowy 2. NI (IQ 30-50) 3. specyficzne cechy dysmorfii 4. zaburzenia psychologiczne (autyzm, ADHD, nadreaktywność) 5. makroorchidyzm

12 FMRP (FMR1) RNA interacting protein transport mrna do dendrytów i regulator syntezy białek w synapsach istotne dla procesów uczenia się i pamięci regulacja internalizacji receptora AMPA po pobudzeniu mglur brak FMRP nadmiar internalizacji AMPAR

13 Status CGG Liczba powtórzeń CGG Metylacja FMR1 mężczyzna Objawy kliniczne kobieta Premutacja ~ niemetylowany FXTAS FX-POI i FXTAS Mutacja >200 całkowita metylacja 100% ID ~50% - ID, ~50% - prawidłowy Mozaika w liczbie powtórzeń p+m; n+p+m zmienna, w zależności od liczby powtórzeń Mozaika metylacyjna >200 zmienna Do 100% ID fenotyp zmienny; od prawidłowego do ID Niemetylowana pełna mutacja >200 niemetylowany prawie wszyscy ID (nawet w dolnym zakresie normy)

14 XLMR a inaktywacja chromosomu X Inaktywacja chromosomu X stadium ok. 200 komórkowe (mozaicyzm) Regulacja przy udziale ncrna XIST akumulacja wzdłuż chr. X wymazanie zmian epigenetycznych aktywnej chromatyny (H3K4me3, H3ac) naniesienie zmian chromatyny nieaktywnej (ubh2a, H3K27me3) przyłączenie białek z rodziny Polycomb, trithorax (Ash2L), białka SAF-A, histonu macroh2a XLID jednostek chorobowych, głównie chłopcy zmiany dziedziczone od matek, u których obserwuje się nielosową inaktywację chromosomu X (zaburzenia proliferacji lub przeżycia komórek z mutacją) NI lekka 55-69, umiark , znaczna 20-34, głęboka - <20

15 Inaktywacja chromosomu X - analiza DNA M - NT HhaI _ m/- M - HhaI amplifikacja AR m elektroforeza P - NT P - HhaI

16 Piętnowanie genomowe (GI) 46,XX R! 46,XY ORGANIZM DIPLOIDALNY każdy gen w dwóch kopiach (zazwyczaj eksprymowany z obu) HAPLOINSUFICJENCJA (monosomie, 45,X, zespół Marfana) Piętnowanie genomowe, rodzicielskie piętno genomowe monoalleliczna ekspresja genu zależna od jego rodzicielskiego pochodzenia

17 Geny piętnowane (ok. 150) są odpowiedzialne za: -rozwój mowy - kształtowanie kontaktów międzyludzkich - inne fenotypy związane z zachowaniem 1. organizacja klastrowa 2. eskpresja z allela mat. lub ojc. 3. w obrębie klastra również geny dla ncrna 4. centra regulatorowe 5. piętno może być nałożone na chromosomie mat. lub ojc.

18 Piętno genomowe (GI) 46,XX R! R! 46,XY

19 DEFEKTY PIĘTNA GENOMOWEGO bardzo rzadkie, niemożliwe do naprawienia po zapłodnieniu (epimutacja pierwotna lub epimutacja wtórna cis, trans) problemy z usunięciem piętna R! 46,XX problemy z nałożeniem piętna R! 46,XX

20 EFEKT: aktywacja allelu, który powinien być wyciszony wyciszenie allelu, który powinien być aktywny NIEPRAWIDŁOWA DAWKA EKSPRESJI GENU ekspresja obu kopii albo brak ekspresji zaburzenia wzrostu i rozwoju organizmu 46,XX - matka gen eksprymowany z allela pochodzenia matczynego CHOROBA EPIGENETYCZNA gen eksprymowany z allela pochodzenia ojcowskiego brak efektu fenotypowego mężczyzna może przekazać defekt potomstwu 46,XY - ojciec brak efektu fenotypowego kobieta może przekazać defekt potomstwu CHOROBA EPIGENETYCZNA

21 Defekty GI mechanizmy powstawania R! R!

22 Rodzicielskie piętno genomowe TNDM SRS BWS/SRS UPD14 PWS/AS GNAS

23 Typowe choroby epigenetyczne Choroba Częstość występowania ID (%) Region chromosomowy Zespół Pradera-Williego 1/ / q11-q13 Zespół Angelmana 1/ / q11-q13 Zespół Beckwitha-Wiedemanna 1/ p15.5 Zespół Russell-Silver 1/3000-1/ Przemijająca cukrzyca noworodkowa typu I 11p15.5, 7p11.2-p13 1/ q24 Pseudohypoparatyroidyzm Ib? >90 20q13.11 UPD(14)mat (zespół Temple) UPD(14)pat (zespół Kagami-Ogata)?? 14q32?? 14q32

24 Choroby epigenetyczne Zespół Pradera-Williego objawy kliniczne: - hipotonia - trudności w karmieniu - nadmierne łaknienie - otyłość - zaburzenia funkcji poznawczych (NI) - specyficzny fenotyp behawioralny - hypogonadyzm - niskorosłość, małe dłonie i stopy - subtelna dysmorfia twarzoczaszki - zez - skolioza Zespół Angelmana Kryteria główne (4/4) - znaczne opóźnienie rozwoju - zaburzenia chodu / równowagi - opóźnienie rozwoju mowy - specyficzny fenotyp behawioralny Kryteria dodatkowe (3/6) - małogłowie pourodzeniowe - napady padaczkowe - nieprawidłowy wzór EEG - zaburzenia snu - zainteresowanie wodą / błyskaniem - ślinotok

25 A boy with a puppet Giovanni Francesco Caroto La Monstrua Juan Carreño de Miranda ( ); Milan, Prada Museum Eugenia Martinez Vallejo from Carol 2nd royal court AS PWS delecja mat 15q11-q13 delecja pat 15q11-q13 patupd matupd epimutacja IC (brak piętna) epimutacja IC (piętno ++) mutacja UBE3A delecja SNORD116

26 Disomia jednorodzicielska chr.14 matupd14 zespół Temple przed- i pourodzeniowe zahamowanie wzrostu wrodzona hypotonia wiotkość stawów opóźnienie rozwoju ruchowego NI w stopniu umiarkowanym patupd14 zespół Kagami-Ogata (KOS, zespół Wang) wielowodzie wady w obrębie brzucha i klatki piersiowej podwyższona waga urodzeniowa (hypertrofia mięśniowa) NI w stopniu głębokim

27 MLMD (multilocus DNA methylation defects) Hypometylacja w obrębie kilku piętnowanych loci (ICR2+GNAS+IGF2R+PEG1 lub TNDM+ICR2+GRB10+PEG1) białka odpowiedzialne za nałożenie wzoru piętna genomowego??? ZFP57 białko jądrowe odpowiedzialne za utrzymanie wzoru piętna w trakcie rozwoju zarodkowego; TNDM i BWS; AR NLRP2 i NLRP7 białka cytoplazmatyczne o nieznanej funkcji NLRP2 BWS mutacja typu frameshift (ex.6) NLRP7 i C6orf221 AR dziedziczna forma zaśniadu groniastego (brak nałożonego piętna matczynego)

28 Analiza metylacji DNA Izolacja DNA PCR po trawieniu DNA enzymami restrykcyjnymi wrażliwymi na metylację MS-MLPA modyfikacja DNA kwaśnym dwusiarczynem sodowym MS-PCR sekwencjonowanie pyrosekwencjonowanie

29 analiza metylacji w SNRPN nieprawidłowy wzór metylacji analiza delecji (FISH, MLPA) prawidłowy wzór metylacji ponowna weryfikacja kliniczna delecja w locus 15q11-13 PWS/AS brak delecji wykluczenie PWS/ AS potwierdzenie AS analiza RFLP, mikrosatelity analiza UBE3A dziedziczenie oburodzicielskie patupd AS matupd PWS potwierdzenie obecności mutacji AS brak mutacji defekt piętna genomowego PWS/AS analiza UBE3A u rodziców???

30 Ryzyko genetyczne Mechanizm genetyczny Ryzyko Delecja <1% UPD <1% Defekt imprintingu i mutacja 50% Defekt imprintingu bez mutacji <1% Translokacja zrównoważona powstała de novo <1% Odziedziczona translokacja zrównoważona. 25%

31 Przykładowe wyniki

32 Przykładowe wyniki

33

34 Analiza metylacji (MS-PCR lub MS-MLPA) Analiza delecji (FISH lub MS-MLPA) Analiza UPD markery mikrosatelitarne dla 15q MAT PAT Analiza AS-SRO (sekw.) Tylko AS P1 P3

35 Uszkodzenia epigenotypu CHOROBY EPIGENETYCZNE nieprawidłowy wzór epigenetyczny mutacje w genach kodujących modyfikatory epigenetyczne

36 Choroby związane z defektem modyfikatorów epigenetycznych 1. choroby dziedziczące się w sposób mendlowski najczęściej autosomalny (80%) dominujący (wyjątek: 71% chorób związanych z usuwaniem znaczników epigenetycznych chromosom X); AR 14% vs. 80% dla IEM 2. białka składniki kompleksów wielobiałkowych zmiana poziomu/aktywności zaburzenie działania całego kompleksu 3. choroby wieloukładowe, o szerszym spektrum objawów klinicznych niż inne jednostki chorobowe; różna ekspresja fenotypowa trudny do identyfikacji defekt molekularny przed erą sekwencjonowania następnej generacji (NGS) 4. efekt fenotypowy zmienny, nie dotyczy wszystkich komórek organizmu, a jedynie określonej frakcji komórek, dla których prawidłowego funkcjonowania konieczna jest właściwa aktywność regulatora epigenetycznego konieczność identyfikacji target genes 5. efekt fenotypowy może zależeć także od poza epigenetycznych funkcji białka (np. HDAC8 zespół Cornelia de Lange koezynopatia NIPBL)

37 Choroby związane z defektem modyfikatorów epigenetycznych 44 jednostki chorobowe objawy kliniczne: 1. niepełnosprawność intelektualna (prawidłowa regulacja epigentyczna niezbędna dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania układu nerwowego) 2. zaburzenia wzrastania niskorosłość lub gigantyzm 3. wady kończyn (nieprawidłowa budowa paznokcia brachydaktylia) 4. zaburzenia immunologiczne

38 Choroby związane z defektem modyfikatorów epigenetycznych PRZYCZYNA CHOROBY zaburzenia równowagi stanów transkrypcyjnych chromatyny (aktywny nieaktywny) zaburzenia regulacji genów docelowych

39 Zespół Kabuki (NGS) 1. niskorosłość 2. małogłowie 3. dysmorfia (uszy, ptoza, brwi) 4. wrodzona wada serca (ASD, VSD, koarktacja aorty) 5. niepełnosprawność intelektualna / opóźnienie rozwoju psychoruchowego 6. drgawki padaczkowe / hypotonia 7. problemy z karmieniem 8. skolioza, nieprawidłowości w budowie kręgów, nadruchliwość stawów 9. wnętrostwo / wady budowy nerek 10. opuszki płodowe palców 11. CAL, hirsutyzm KMT2D (MLL2) H3K4me3 aktywny KDM6A H3K27me3 nieaktywny ekspresji genów docelowych (1/3 homologi genów Polycomb i Trithorax odpowiedź na działanie czynników zewnętrznych, rytm dobowy, szlak mtor)

40 DNMT1 demencja, głuchota, neuropatia czuciowa; ataksja móżdżkowa, głuchota, narkolepsja DNMT3a nadmierny wzrost + ID, dysmorfia twarzy (Nat Genet Apr;46(4):385-8) DNMT3b (de novo) zespół ICF (OMIM #242860) niedobór odporności, niestabilności centromerów, anomalie twarzy, ID MECP2 zespół Retta; zespół dup. MECP2 MBD1-4 autyzm

41 Choroby MECP2-zależne X-linked, Xq28 MECP2 białko wiążące się do metylowanych sekwencji CpG poza domeną wiążącą metylowane DNA (MBD), białko posiada domenę TRD, odpowiedzialną za oddziaływanie z pozostałymi białkami kompleksu hamującego transkrypcję (białka HDAC, metylotransferazy histonowe, inne białka odpowiedzialne za tworzenie heterochromatyny) mutacje: delecje i m. nonsens w MBD i TRD związane są z objawami neurologicznymi gen regulowany przez MECP2 BDNF czynnik odpowiedzialny za rozwój układu nerwowego (zapobiega apoptozie), różnicowanie komórek progenitorowych oraz procesy pamięci i uczenia się MECP2 mir-30a/d, mir-381, mir BDNF Mecp2 brain knockout mir-29 i mir-146 (komórki nerwowe i glejowe) BDNF mir-212, mir-132 MECP2

42 Choroby związane z MECP2 Zespół Retta Zespół duplikacji MECP2 głównie dziewczynki (1/10-15 tys.) regres rozwoju po okresie prawidłowego rozwoju utrata nabytych umiejętności posługiwania się rękoma regres mowy zaburzenia chodu stereotypie pourodzeniowa mikrocefalia zaburzenia oddychania chłopcy: encefalopatia niemowlęca głównie chłopcy NI ciężka - głęboka wczesnodziecięca hypotonia opóźniony rozwój motoryczny narastająca spastyczność predyspozycja do infekcji (75%) Napady padaczkowe (50%) cechy dysmorfii - dyskretne kobiety: nielosowa inaktywacja chromosomu X (całkowita lub znaczna)

43 Zespół ATR-X Zespół Rubinstein- Taybiego Zespół Coffina-Lowry ego ATRX (Xq13.3) CREBBP (16p13.3) RSK2 (Xq22.3) członek rodziny SWI/SNF; represja transkrypcji; zmiany w konformacji chromatyny NI głęboka, opóźnienie rozwoju mowy, drgawki, hypotonia, dysmorfia; zaburzenia rozwoju kory mózgowej CREB binding protein, HAT, acetylacja H3, oddziaływuje z regulatorami cyklu komórkowego c-fos, c-jun NI (umiarkowana do głębokiej), zaburzenia rozwoju mowy i poznawczego, impulsywność, zaburzenia koncentracji, otyłość, dysmorfia twarzy, spowolnienie wzrostu, niskorosłość, wady szkieletu aktywacja białek CREB na drodze fosforylacji; fosforylacja histonów (H3S10) NI (głęboka u chłopców), opóźnienie rozwoju mowy, małogłowie, wady serca, dysmorfia twarzy, zaburzenia budowy szkieletu

44 Zespół płciowo-rzepkowy Zespół Say-Barber-Biesecker-Young- Simpson Zespół Rubinstein-Taybi Zespół brachydaktylia niepełnosprawność intelektualna (zespół microdelecyjny) Zespół podobny do z. Wilsona-Turnera, sprzężony z chromosomem X (XLID, hypogonadyzm, ginekomastia, otyłość, niskorosłość, dysmorfia) Zespół podobny do z. Cornelia de Lange (dysmorfia, zaburzenia wzrastania, niepełnosprawność intelektualna, zaburzenia budowy kończyn górnych, zaburzenia neurologiczne i pokarmowe ) 10q p13 22q13 MYST4 (KAT6B) CREBBP (KAT3A), EP300 (KAT3B) 2q37.3 HDAC4 Xq13.1 HDAC8 acetylotransferaza histonowa acetylotransferaza histonowa deacetylaza histonowa deacetylaza histonowa

45 Zespół Kleefstra 9q34 EHMT1 MLL3 Zespół Weavera (wysoki wzrost, specyficzny 7q36.1 EZH2 wygląd twarzy, NI) Zespół Wiedemann-Steiner (niskorosłość, NI, dysmorfia) 11q23.3 MLL Zespół Kabuki (NI, wada serca, wady układu moczowego, niedosłuch, hypotonia, 12q13.12 MLL2 pourodzeniowy niedobór wzrostu) Zespół Sotosa Zespół Weavera 5q35 NSD1 Autyzm 1q21.3 SETDB1 XLID (NI sprzężona z chr. X) Xp11.22 PHF8 NI (NGS-trio analysis) 1q32.1 KDM5B XLID (NI sprzężona z chr. X + KDM5C niskorosłość, ataksja, wzmożone Xp11 (JARID1C) napięcie mięśniowe, hyperrefleksja) metylotransferaza histonowa demetylaza histonowa

46 Zespół Coffina-Lowry ego (NI sprzężona z chr. X) Xp22 RPS6KA3 kinaza białek histonowych i czynników transkrypcyjnych XLID (NI sprzężona z chr. X, brak rozwoju mowy, drgawki, wady układu moczowopłciowego, problemy ze skórą, niska linia włosów na karku, szeroko rozstawione sutki, nadmiar włosów na tułowiu, dysmorfia) XLID (NI sprzężona z chr. X; zespół podobny do zespołu Turnera) Xq24 Xp11.22 UBE2A HUWE1 transferaza ubikwitynowa

47 Zespół CHARGE 8q12 CHD7 autyzm i zaburzenia ASD 14q11.2 CHD8 zespół α-thalasemia-ni (ATR-X) Xq13 ATRX helikaza DNA Zespół Nicolaidesa-Baraitsera 9p24.3 SMARCA2 podjednostki 11p13.2 SMARCA4 kompleksów Zespół Coffina-Sirisa remodelujących 1p36.11 ARID1A chromatynę * niskorosłość * opóźnienie rozwoju psychoruchowego * NI * dysmorfia * zaburzenia kostno-szkieletowe * wrodzona wada serca * brak płytki paznokciowej piątego palca