BADANIA PODSTAWOWE NA RZECZ POSTĘPU BIOLOGICZNEGO W PRODUKCJI ROŚLINNEJ.

Transkrypt

1 BADANIA PODSTAWOWE NA RZECZ POSTĘPU BIOLOGICZNEGO W PRODUKCJI ROŚLINNEJ. Wyniki badań uzyskane w 2014 roku w zadaniach szczegółowych wg Załącznika nr 9 Rozporządzenia Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 18 maja 2010r. (Dz.U. Nr 91 poz. 595 i Nr 259 poz. 1772; z 2011r. Nr 121 poz. 69; z 2012r. Nr 53 poz. 27; z 2013r. poz. 752 oraz z 2014r.poz. 796) Lp. w zał. do Rozporządzenia MRiRW: 4. Tytuł zadania: Mapowanie asocjacyjne genów odporności na rdzę brunatną (Puccinia triticina) i septoriozę paskowaną liści (Septoria tritici) w pszenicy. Kierownik zadania: dr hab. P. Czembor prof. IHAR-PIB Celem badań było postulowanie genów odporności na septoriozę paskowaną i rdzę brunatną w europejskich odmianach pszenicy w tym w odmianach znajdujących się na liście odmian wpisanych do krajowego rejestru w Polsce. Typowanie genów odporności zostało wsparte wykorzystaniem markerów molekularnych zarówno blisko sprzężonych ze znanymi genami jak i umożliwiających profilowanie całego genomu na potrzeby mapowania asocjacyjnego. Temat badawczy 1: Ocena porażenia odmian/linii pszenicy ozimej przez izolaty Puccinia triticina. Celem tego tematu było określenie reakcji fenotypowej (odporny/podatny) 200 odmian/linii pszenicy ozimej na zakażenie sześcioma izolatami P. triticina o zróżnicowanej patogeniczności. Materiały i metody: Materiał roślinny. Do badań w stadium siewki wykorzystano zestaw 200 odmian/linii: 38 linii bliskoizogenicznych odmiany Thatcher (ang. Thatcher Near Isogenic Lines, TcNILs) 83 odmiany pszenicy ozimej z krajowej listy opisowej odmian COBORU (2013) 79 odmian pszenicy ozimej zarejestrowanych w innych krajach europejskich Zestaw TcNILs zawiera znane geny odporności na P. triticina (pominięto linie z genami warunkującymi odporność w stadium rośliny dorosłej) i jest obecnie obowiązującym zestawem w badaniach międzynarodowych. Testy fitopatologiczne. Opisany wyżej zestaw odmian/linii (3-5 ziarniaków danego obiektu) został wysiany do dwóch palet ogrodniczych. W warunkach kontrolowanych komory klimatycznej, siewki w stadium drugiego liścia zakażano pojedynczym izolatem P. triticina (100mg uredinospor/100ml wody) i pozostawiono do następnego dnia w warunkach całkowitej ciemności, w temperaturze 22 C i wilgotności 95%. Następnie siewki utrzymywano w warunkach 16 godzin światła/22 C oraz 8 godzin ciemności/18 C. Po 12-dniowej inkubacji, porażone siewki oceniano wg skali 0 4, gdzie typ infekcji 0 2 wskazuje na odporność, a typ infekcji 3 4 wrażliwość. Do inokulacji wykorzystano sześć izolatów P. triticina z własnej kolekcji, charakteryzujących się zróżnicowanym spektrum wirulencji (dane niepublikowane): NIAB 06-23, NIAB 06-94, NIAB 06-98, Pt1002, Pt2902 i Pt1602. Wyniki: W wyniku inokulacji 83 odmian pszenicy ozimej pochodzącej z krajowej listy odmian COBORU sześcioma izolatami o zróżnicowanej wirulencji zidentyfikowano 6 odmian (Belenus, Elipsa, Kredo, KWS Magic, Pengar, Speedway) odpornych na co najmniej 5 izolatów oraz 9 odmian (Astoria, Bagou, Bystra, Forum, Markiza, Meteor, Mikula, Rapsodia, Satyna) wykazujących odporność na jeden z testowanych izolatów P. triticina. Pozostałe polskie odmiany były podatne na wszystkie testowane izolaty. Spośród 79 odmian pszenicy pochodzących z różnych krajów europejskich, 27 wykazało odporność na 4-6 testowanych izolatów P. triticina. Natomiast 23 odmiany były odporne na co najmniej jeden spośród sześciu badanych izolatów. Wszystkie badane izolaty były wirulentne w stosunku do genów Lr10, Lr11, Lr14a, Lr14b, Lr18, Lr27+Lr31, Lr33, Lr36, Lr44 oraz awirulentne w stosunku do Lr9, Lr19, Lr24 i Lr52. Dla pozostałych linii zestawu różnicującego przynajmniej jeden izolat dla danej linii wykazywał odmienną reakcję

2 fenotypową w porównaniu do pozostałych izolatów. Dla kilku kombinacji izolat/obiekt zaobserwowano mieszaną reakcję fenotypową: Pt2902/Eriwan, NIAB06-23/Smuga; Pt1602/Grapeli; NIAB06-94/Mikula, Smuga; Pt1002/Eriwan, Elipsa. Dyskusja: Liczba izolatów wykorzystana w niniejszej pracy nie pozwoliła jak dotąd na zróżnicowanie reakcji fenotypowej wszystkich linii zestawu TcNILs. Docelowo zostanie przetestowanych co najmniej 18 izolatów P. triticina, co z pewnością wyłoni szersze spektrum wirulencji pozwalające zróżnicować fenotypowo wszystkie, a przynajmniej większość linii bliskoizogenicznych odmiany Thatcher. Wnioski: 1. Stwierdzono małe zróżnicowanie genetyczne odmian z krajowego rejestru (większość posiada prawdopodobnie kilka mało efektywnych genów odporności). 2. Zaobserwowano większe zróżnicowanie genetyczne odmian zagranicznych i więcej efektywnych genów odporności. 3. Spektrum wirulencji testowanych izolatów pozwoliło na zróżnicowanie reakcji fenotypowej większości linii zestawu TcNILs. Temat badawczy 2: Testowanie specyficznych markerów PCR dla wybranych genów Lr. Celem tego tematu było określenie występowania markerów molekularnych blisko sprzężonych z wybranymi genami Lr w zestawie odmian/linii pszenicy ozimej badanych w temacie badawczym 1. Materiały i metody: Z grupy odmian/linii badanych w temacie 1 do analiz molekularnych w ramach tematu 2, wybrano zestaw 188 genotypów pszenicy (w tym linie różnicujące TcNILs). Liczba planowanych obiektów do badań wynikała z narzuconych warunków technicznych analiz: 2 płytki, każda po 96 próbek (w tym 2 próbki kontrolne). Siewki wybranych odmian/linii posłużyły do wyizolowania DNA jedną z dwóch metod: DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Niemcy) lub Nucleo Mag 96 (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren, Niemcy) wspomaganą zautomatyzowaną stacją roboczą Freedom Evo (Tecan Group Ltd., Seestrasse 103, CH-8708 Männedorf, Szwajcaria). Wyizolowane DNA zostało wykorzystane do określenia występowania markerów molekularnych blisko sprzężonych z sześcioma genami odporności: Lr1, Lr9, Lr10, Lr19, Lr20 i Lr21. Specyficzne markery molekularne amplifikowano w reakcji PCR zgodnie z warunkami podanymi w publikacjach źródłowych z niewielkimi modyfikacjami: całkowita objętość reakcji 10µl, 60ng DNA, 1U Taq polimerazy (Fermentas GmbH, Niemcy), 1 PCR bufor z domieszką (NH 4 ) 2 SO 4 (Fermentas), 2,5 mm MgCl 2 (Fermentas), 200μM każdego z deoksynukleotydów (Fermentas) oraz po 0,5 μm każdego z pary starterów. Produkty PCR rozdzielano na żelach agarozowych 1,5 2,0%/250V/4 godziny. Żele po wybarwieniu bromkiem etydyny dokumentowano w świetle UV przy użyciu systemu Gel Logic 200 (Eastman Kodak Company, USA). W przypadku produktów PCR znakowanych fluorescencyjnie do rozdziału i detekcji wykorzystano analizator DNA ABI377XL (Applied Biosystems, Foster City, USA) wspomagany oprogramowaniem GeneScan 3.1 (Applied Biosystems), stosując 4.5% denaturujący żel poliakrylamidowy (Long Ranger, Cambrex Bio Science, USA). Do nanoszenia mieszaniny poreakcyjnej na żel poliakrylamidowy zastosowano grzebienie membranowe (100 zębów) zgodnie z zaleceniem producenta (Web Scientific Ltd., W. Brytania). Wyniki: Na podstawie analiz molekularnych określono występowanie markerów blisko sprzężonych z wybranymi genami Lr w analizowanym zestawie odmian/linii. Linie bliskoizogeniczne TcNILs zawierające znane geny odporności Lr, posłużyły jako wzorce do porównań dla badanych odmian krajowych i zagranicznych. Gen Lr1 identyfikowano na podstawie obecności specyficznych produktów amplifikacji dwóch markerów molekularnych ptag621 i WR001. Spośród testowanych odmian pszenicy, 29 odmian polskich i 7 europejskich posiadało wspomniany gen. Również w linii bliskoizogenicznej LrB (PI) wykazano obecność tego genu. W przypadku genu Lr9 jego obecność została zidentyfikowana jedynie w liniach TcNILs Lr9 i Lr25. Przy pomocy markera STSLrk10-6 zidentyfikowano gen Lr10 w 19 odmianach pszenicy ozimej z krajowej listy odmian COBORU i u 26 odmian pszenicy ozimej zarejestrowanych w innych krajach europejskich. Wykazano również obecność tego genu w linii TcNIL Lr27+Lr31. W celu identyfikacji genu Lr19 wykorzystano marker SSR wmc221, który wykazał brak obecności tego genu u którejkolwiek z odmian oprócz TcNIL Lr19. Natomiast gen Lr20 zidentyfikowano u jednej europejskiej odmiany KWS Cashel. Marker LR21_SCAR generował w reakcji PCR cztery specyficzne haplotypy (G1-G4), każdy o innym 2

3 zestawie trzech produktów PCR. Tylko haplotyp G1 wskazywał na obecność genu Lr21 i poza linią TcNIL Lr21 został on zidentyfikowany w linii TcNIL Lr3ka. Dyskusja: Markery molekularne mogą pomóc w szybkiej detekcji genów odporności w odmianach roślin uprawnych. W pracy wykorzystano 7 markerów umożliwiających identyfikację sześciu genów odporności Lr na P. triticina. Otrzymane wyniki wskazują, że STS marker ptag621 jest niespecyficzny i nieodpowiedni do identyfikacji genu Lr1, ponieważ obecność jego produktu zaobserwowano nie tylko u linii Tc+Lr1, ale również u innych linii zestawu TcNILs, łącznie z podatną odmianą Thatcher. W związku z tym wykorzystano specyficzny marker SSR WR001, który został zaprojektowany z sekwencji RGAs (resistance gene analogs) zlokalizowanej w locus genu Lr1. Jednakże obecność produktu amplifikacji została zaobserwowana również w linii bliskoizogenicznej LrB (PI). Marker SCAR SCS5 550 specyficzny dla genu odporności na P. triticina Lr9 został amplifikowany w TcNIL Lr9. Żadna z polskich i europejskich odmian pszenicy nie posiadała genu Lr9. Uzyskane wyniki wskazują na obecność tego produktu dodatkowo u linii TcNIL Lr25. W celu detekcji genu Lr10 w odmianach pszenicy wykorzystano wysoce specyficzny marker STSLrk10-6, który został przetestowany na materiale roślinnym różnego pochodzenia. Dodatkowo zaobserwowano obecność produktu amplifikacji w linii TcNIL Lr27 + Lr31. Pomimo zastosowania wysoce specyficznego markera, u żadnej z polskich i europejskich odmian pszenicy nie zidentyfikowano genu Lr19. Gen Lr20 został zidentyfikowany u jednej europejskiej odmiany KWS Cashel. Zastosowany w tym przypadku marker był wysoce specyficzny w stosunku do linii posiadających tylko ten gen odporności. W 2010 został zaprojektowany nowy marker SCAR Lr21 w celu identyfikacji grup haplotypów związanych z genem Lr21 odporności na rdzę brunatną. Przeprowadzone analizy wykazały obecność specyficznego haplotypu u linii TcNIL Lr21 oraz TcNIL Lr3ka. W przypadku markerów opracowanych dla genów Lr1, Lr9, Lr10 i Lr21 uzyskane wyniki nie były w pełni zadowalające ze względu na ich obecność również w innych liniach zestawu TcNILs. W związku z tym należy się zastanowić nad ich dalszym wykorzystaniem w badaniach. Wnioski: 1. Potwierdzono przydatność markerów molekularnych w identyfikacji genów odporności Lr19 i Lr Wyniki identyfikacji genów odporności Lr1, Lr9, Lr10 i Lr21 są niejednoznaczne. Temat badawczy 3: Ocena porażenia odmian/linii pszenicy ozimej przez izolaty Septoria tritici Celem tego tematu było określenie reakcji fenotypowej (odporny/podatny) 200 odmian/linii pszenicy ozimej na zakażenie izolatem S. tritici. Cel został zrealizowany w zakresie przewidywanym do realizacji na obecny rok. Materiały i metody: Na potrzeby realizacji tematu, jesienią bieżącego roku założono doświadczenie w układzie dwóch losowanych bloków (dwa powtórzenia). Każda linia w danym powtórzeniu została wysiana w rządku 1m. Do badań wykorzystano zestaw 200 odmian/linii: 83 odmiany pszenicy ozimej z krajowej listy opisowej odmian COBORU (2013) 92 odmiany zarejestrowane w innych krajach europejskich 25 odmian/linii różnicujących reakcję odpornościową na zakażanie S. tritici Wyniki: Wyniki oceny reakcji fenotypowej zostaną uzyskane w przyszłym roku kalendarzowym. Lp. w zał. do Rozporządzenia MRiRW: 5. Tytuł zadania: Identyfikacja zmienności genetycznej pszenicy korelującej z potencjałem plonotwórczym i wybranymi cechami systemu korzeniowego. Kierownik zadania: prof. dr hab. A. Nadolska-Orczyk Celem zadania w roku 2014 było przygotowanie technik i materiału badawczego, które umożliwią w kolejnych latach weryfikację założonej na podstawie wcześniejszych badań hipotezy badawczej. 3

4 Zakłada ona, że ekspresja genów z rodziny TaCKX występująca w rozwijających się kłosach i/lub systemie korzeniowym wskazuje na potencjał plonotwórczy i/lub masę systemu korzeniowego. W ramach przygotowania technik opracowano i wybrano najlepsze techniki genotypowania poszczególnych genów TaCKX. Przygotowanie materiału badawczego polegało na wyborze i kolekcji różnych populacji blisko spokrewnionych genotypów pszenicy o zróżnicowanym plonowaniu. Materiały i metody: Analizie bioinformatycznej poddano 32 sekwencje genów TaCKX zidentyfikowanych w bazie sekwencji NCBI Nukleotide. Sekwencje zostały porównane wzajemnie przy pomocy algorytmu BLAST oraz ClustalW. W oparciu o sekwencje o numerach akcesyjnych JN i JN zidentyfikowanych jako TaCKX1 i TaCKX2, zaprojektowano specyficzne startery amplifikujące produkty o długości 188 i 182 nukleotydów. W oparciu o dane literaturowe wytypowano do badań 4 geny referencyjne. Materiałem badawczym były trzy polskie odmiany pszenicy zwyczajnej: Ostka Smolicka, Torka i Brawura. Rośliny rosły w kontrolowanych stabilnych warunkach w komorze fitotronowej. RNA izolowano z korzeni 5-dniowej siewki, młodego w pełni rozwiniętego liścia, niedojrzałych kwiatostanów w dwóch stadiach rozwojowych i rozwijających się kłosów: w dniu zapylenia, oraz po 7 i 14 dniach od zapylenia (DAP). Każdą odmianę reprezentowały trzy powtórzenia biologiczne. Wstępny półilościowy PCR wykonano dla wszystkich zaprojektowanych par starterów. Jako matrycy używano cdna zsyntetyzowanego na matrycy RNA wyizolowanego z korzenia, liścia i kłosa 7 DAP. Analizę ilościowego RT-PCR (qrt-pcr) wszystkich badanych materiałów prowadzono w obecności barwnika EvaGreen. Względny poziom ekspresji genów TaCKX1 i TaCKX2 określano przy pomocy metody ΔΔCt w stosunku do wybranego genu referencyjnego. Wykonano sekwencjonowanie fragmentu genu TaCKX2 i otrzymane wyniki poddano analizie bioinformatycznej w celu sprawdzenia ich poprawności i stopnia podobieństwa z sekwencjami zdeponowanymi w bazie NCBI. Na podstawie danych literaturowych i konsultacji z hodowcami, do dalszych badań wytypowano i pozyskano linie z dwóch populacji mapujących oraz linie hodowlane z dwóch polskich hodowli (Hodowla Roślin Strzelce Sp. z o.o. Grupa IHAR i Hodowla Roślin Danko, Sp. z o.o.). Wyniki i dyskusja: W bazach sekwencji nukleotydowych NCBI Nukleotide zidentyfikowano łącznie 32 rekordy zawierające pełną lub częściową sekwencję genów CKX. Były to zarówno sekwencje genomowe jak i mrna. Siedem z nich opisano, jako TaCKX1 a 11 jako TaCKX2. Poszczególne sekwencje porównane zostały przy pomocy algorytmu megablast. Sekwencje dwóch analizowanych genów wyraźnie różnią się od siebie poza podobieństwem domeny wiążącej kofaktor FAD. Do ilościowej analizy ekspresji badanych genów konieczne było wytypowanie genu referencyjnego. Został on wybrany spośród czterech genów referencyjnych wytypowanych na podstawie literatury i przetestowanych na naszym materiale badawczym. Ilościową analizę ekspresji genów TaCKX poprzedziły testowe reakcje półilościowe, które miały za zadanie zweryfikować poprawność zaprojektowanych starterów i wytypować tkanki, w których zachodzi najwyższa ekspresja badanych genów. Ilościowa analiza ekspresji badanych genów w różnych organach i tkankach rosnących roślin pszenicy wykazała, że profile ekspresji tych genów są bardzo podobne. Wysoką ekspresję obserwowano w czasie rozwoju kłosa, niską w korzeniu i praktycznie brak ekspresji w pozostałych tkankach. Taki profil ekspresji, zgodnie z naszą hipotezą może sugerować, że obydwa geny odgrywają istotną rolę w produktywności pszenicy. Poziom ekspresji genu TaCKX2 był o 10 2 wyższy niż TaCKX1, co może wpływać na skalę oddziaływania na kontrolowaną cechę. W ramach realizacji zadania zgromadzono również kolekcję 116 genotypów pszenicy. W skład kolekcji wchodzą wybrane linie z dwóch populacji mapujących oraz materiały wytypowane przez polskich hodowców. Zgromadzone materiały są blisko spokrewnione ale różnią się produktywnością. Profile ekspresji wybranych do badań genów TaCKX wskazują, że mogą one być użyte do weryfikacji postawionej przez nas hipotezy. Następny etap badań będzie wymagał określenia czy istnieje korelacja pomiędzy poziomem transkrypcji genów ulegających wysokiej ekspresji w rozwijających się ziarniakach i produktywnością. Do realizacji tego zadania zgromadzono populacje genotypów o zbliżonym tle genetycznym ale różniące się produktywnością. 4

5 Wnioski: 1. Sekwencje genów TaCKX1 i TaCKX2 nie wykazują homologii poza regionem zawierającym domenę wiążącą kofaktor FAD. Analiza bioinformatyczna umożliwiła wybór specyficznych starterów do analiz ekspresji tych genów. 2. Spośród czterech testowanych genów referencyjnych tylko jeden ulegał ekspresji we wszystkich analizowanych tkankach i został wybrany do dalszych badań. 3. Reakcje półilościowe ekspresji genów TaCKX umożliwiły zweryfikowanie poprawności zaprojektowanych starterów i wytypowanie tkanek, w których zachodzi najwyższa ekspresja badanych genów. 4. Pomiar względnego poziomu ekspresji w określonych tkankach był możliwy jedynie za pomocą ilościowego RT-PCR (qrt-pcr). 5. Ekspresja genów TaCKX1 i TaCKX2 wzrastała w czasie rozwoju kłosa między 0 a 14 DAP, w związku z tym mogą one brać udział w regulacji stężenia cytokinin w rozwijających się ziarniakach. 6. Zgodnie z założoną hipotezą wyznaczony wzór ekspresji genów TaCKX1 i TaCKX2 w różnych organach i tkankach rozwijających się roślin pszenicy może wskazywać na ich rolę w produktywności. 7. Bardzo duże różnice w poziomie ekspresji genów TaCKX2 i TaCKX1 w rozwijających się ziarniakach mogą wpływać na istotność zmian związanych z produktywnością. 8. Zgromadzone populacje umożliwią wyznaczenie korelacji pomiędzy poziomem ekspresji genów TaCKX a produktywnością i masą korzenia. Lp. w zał. do Rozporządzenia MRiRW: 6. Tytuł zadania: Poszukiwanie oraz wykorzystanie markerów fenotypowych, metabolicznych i molekularnych do badania typów odporności na fuzariozę kłosów u form pszenicy o zróżnicowanej podatności. Kierownik zadania: dr T. Góral Temat badawczy 1: Fenotypowanie porażenia kłosów pszenicy fuzariozą kłosów (badanie odporności typu I i II) Cel Ocena stopnia porażenia kłosów przez Fusarium celem wyboru form odpornych pod względem odporności typu I i II. Tworzenie mieszańców z genotypami odpornymi. Cel tematu został w pełni zrealizowany. Materiały i metody Odporność na fuzariozę kłosów około 200 genotypów pszenicy testowana była w warunkach polowych w IHAR-PIB Radzików oraz w IGR PAN w Poznaniu (pole doświadczalne Cerekwica). Doświadczenia polowe zostały założone w układzie losowanych bloków. Pszenica wysiana została na poletkach o powierzchni 0,5-1m 2 w trzech powtórzeniach oraz w kombinacji kontrolnej. Do produkcji inokulum zastosowane były 3 izolaty Fusarium culmorum, wytwarzające deoksyniwalenol oraz zearalenon. Izolaty te zostały przetestowane pod względem agresywności wobec pszenicy i pszenżyta i były używane do oceny odporności w warunkach polowych. Izolaty były inkubowane na autoklawowanym ziarnie pszenicy w szklanych kolbach przez około 4 tygodni a następnie naświetlane ciągłym światłem UV przez 4 do 7 dni w temperaturze 18 o C. Ziarno skolonizowane przez F. culmorum było następnie suszone i przechowywane w lodówce w temperaturze 4 o C do momentu użycia. W dniu, kiedy wykonywana była inokulacja, ziarno z grzybnią i zarodnikami F. culmorum było namaczane w wodzie przez około 2 godziny i następnie filtrowane w celu uzyskania zawiesiny zarodników. Zawiesiny ze wszystkich izolatów były mieszane i stężenie zarodników ustalono na około 5 x 10 5 zar./ml za pomocą hematokrytu. Zastosowana została technika inokulacji przez opryskiwanie. Inokulacja przez opryskiwanie pozwoliła na określenie połączonych typów odporności I i II (odporność na infekcję oraz na rozprzestrzenianie się patogena w tkankach). Technika ta w pewnym stopniu symuluje naturalne warunki infekcji kłosa przez Fusarium. 5

6 Kłosy pszenicy w fazie kwitnienia były opryskiwane zawiesiną zarodników w ilości około 100 ml zawiesiny na 1 m 2. Inokulacja przeprowadzona została oddzielnie na każdym poletku na początku kwitnienia i powtórzona została około 3 dni później w fazie pełni kwitnienia. W fazie tej pszenica jest najbardziej wrażliwa na infekcję kłosa przez Fusarium. Inokulacje prowadzone były w godzinach wieczornych, kiedy wzrastała względna wilgotność powietrza. Ocenę porażenia rozpoczęto około 10 dni po ostatniej inokulacji. Zostały przeprowadzone 2 oceny w odstępach 7-dniowych. Nasilenie fuzariozy kłosów zostało określone na podstawie proporcji porażonych kłosków w kłosie (tylko w kłosach z objawami choroby) oraz proporcji kłosów prażonych na poletku. Z tych wartości wyliczony został indeks fuzariozy kłosów. Przebadano odporność typu I (odporność na infekcję) i II (odporność na rozprzestrzenianie się Fusarium w kłosie) 74 genotypów pszenicy ozimej oraz 9 odmian/linii wzorcowych. Doświadczenie prowadzono w warunkach częściowo kontrolowanych w tunelu foliowym z instalacją zraszającą. Zastosowana została metoda inokulacji punktowej kłosów. Metoda ta jest używana do szacowania odporności typu II i pozwala na precyzyjne śledzenie rozprzestrzeniania się patogena w kłosie. Kłosy inkulowane były w fazie pełni kwitnienia poprzez umieszczanie kropli (ok. 50 µl) zawiesiny zarodników Fusarium w środkowym kwiatku wybranych kłosów za pomocą samo napełniającej się strzykawki. Stężenie zawiesiny wynosiło 50 x 10 3 zar./ml. Inokulowanych było po 10 kłosów danego genotypu. Po inokulacji w tunelu utrzymywana była wysoka wilgotność powietrza stymulująca rozwój choroby. Nasilenie fuzariozy kłosów oceniano poprzez określanie liczby kłosków z objawami choroby. Ocena przeprowadzona została 21 dni po inokulacji. W celu określenia odporności typu I kłosy pszenicy opryskiwane były zawiesiną zarodników Fusarium o stężeniu 10 5 zar./ml. Po 7-10 dniach od inokulacji oceniano liczbę punktów infekcji. Po 21 dniach po inokulacji przeprowadzono dodatkowo ocenę indeksu fuzariozy. W ramach usługi badawczej prowadzone były doświadczenia infekcyjne w 5 punktach doświadczalnych. Do inokulacji zastosowane zostały te same izolaty F. culmorum, co w IHAR-PIB Radzików i IGR PAN. Metodyka doświadczenia była podobna. Wyniki i dyskusja W doświadczeniach infekcyjnych w Radzikowie i Cerekwicy przebadano odporność na fuzariozę kłosów 224 genotypów oraz 10 odmian/linii wzorcowych pszenicy ozimej. Genotypy te pochodziły z krzyżowań prowadzonych w spółkach hodowli roślin (153 genotypy - DW 2014) oraz z kolekcji utworzonej w wyniku badań nad odpornością na fuzariozę kłosów w latach (72 genotypy odporne ). Wzorce stanowiły odmiany wysokoplonujące KWS Ozon, Patars, Tonacja; linie o wysokiej odporności na fuzariozę kłosów - A , UNG , Arina, 20828; genotypy pszenicy o wysokiej podatności na porażenie kłosa - SMH 8694, SMH 8816, NAD Średnie nasilenie fuzariozy kłosów wyniosło w Cerekwicy IFK = 23,9%, natomiast w Radzikowie IFK = 23,5%. Nie było istotnych statystycznie różnic pomiędzy indeksami fuzariozy kłosów w obu miejscowościach. Współczynnik korelacji pomiędzy IFK w Cerekwicy i IFK w Radzikowie był istotny. Zakres IFK mieścił się w granicach: Cerekwica 5,9% (STH 1144) -72,5% (KBP_09_38), Radzików 0,5% (UNG ) 54,7% (KBP 11 21). Dla genotypów z grupy DW2104 IFK wyniósł: 28,2% w Cerekwicy i 26,8% w Radzikowie, natomiast dla genotypów z grupy odporne było to: 15,1% w Cerekwicy i 16,4% w Radzikowie. Wysokość roślin pszenicy w Cerekwicy była znacznie mniejsza niż w Radzikowie i wynosiła odpowiednio 75,0 cm (52,0 102,0 cm) i 105,4 cm (81,7-136,3 cm). Jedynie 3 genotypy w Cerekwicy miały powyżej 100 cm, natomiast w Radzikowie było to 2/3 genotypów. Jeżeli chodzi o obie badane grupy to grupa odpornych genotypów miała większą średnią wysokość roślin (94,2 cm) w porównaniu do grupy genotypów DW2014 (88,5 cm). W obu lokalizacjach zależności między grupami były takie same. Wysokość roślin istotnie, lecz słabo korelowała z IFK w Cerekwicy, natomiast w Radzikowie współczynnik korelacji był wysoko istotny. Średnio wysokość roślin miała istotny negatywny wpływ na nasilenie fuzariozy kłosów. Współczynniki korelacji wysokości roślin z IFK były negatywne, co wskazuje na wolniejszy rozwój choroby na kłosach wyższych genotypów. Niższe porażenie wysokich genotypów jest głównie wynikiem morfologii i różnic w mikroklimacie na poziomie kłosa. Jednak większą podatność niskich odmian może wynikać z obecności genu karłowatości Rht-D1b (Rht2). 6

7 Genotypy w grupie odporne były istotnie słabiej porażane fuzariozą kłosów. W grupie DW2014 zidentyfikowano również genotypy wykazujące odporność np. STH 1144, POB 0513, STH 2041, NAD Większość tych genotypów charakteryzowała się jednakże wysokością powyżej 90 cm. Genotypy niskie (poniżej 80 cm) miały indeksy FK przeważnie powyżej 25%. Wyjątek stanowiły genotypy DD 137/10-4 NAD 10041, STH 1124, DL 414/10, DL 414/10/6/3 z grupy DW2014 oraz CHD 6651/06 z grupy odpornych. W badaniach typów odporności I i II uzyskano zróżnicowanie reakcji genotypów pszenicy w zakresie 1 4 punkty infekcji (PI) dla typu I oraz 1,1 3,8 kłosków porażonych dla typu II. Jeżeli chodzi o typ I odporności to 17 genotypów na 83 badane (20%) miało liczbę punktów infekcji równą 1, natomiast 8 (10%) powyżej 3. Najniższą odporność typu I zanotowano u genotypu KBP10 3,4-4,0 PI. W przypadku odporności typu II, najwyższą (1,1 kłosków porażonych) charakteryzowały się dwa wzorce odporności - A (R) i UNG (VR) oraz MOB ZB Najniższą odporność typu 2 posiadały genotypy STH 1129, NAD i DD 64/09 (3,7-3,8 kłoska porażonego). Najwyższą średnią odporność obu typów zanotowano u genotypów: A (R), KBP 10 58, DED 316/06, MOB WB , SZD 1604/06 oraz POB Najniższa była odporność genotypów: SMH 8816 (S), NAD (S) oraz STH Brak było zależności między odpornością obu typów. Odporności obu typów oddzielnie korelowały z indeksami fuzariozy kłosów uzyskanymi w tunelu oraz w doświadczeniach polowych w Cerekwicy i w Radzikowie. Wyższe jednakże były współczynniki korelacji średniej odporności typu I i II z indeksami fuzariozy kłosów. Analiza składowych głównych pozwoliła zidentyfikować genotypy łączące oba typy odporności oraz odporność polową. Były to: wzorce odporne - A (R), UNG (VR), Arina (MR) i (R) oraz genotypy KBP 10 58, POB 0111, SMH 8553, MOB 5578/06, AND 1055/02, POB 170/04, AND 400/05, POB W doświadczeniach w 6 lokalizacjach badano odporność 153 genotypów i 3 odmian wzorcowych na fuzariozę kłosów. Zidentyfikowano genotypy wykazujące odporność na porażenie kłosa we wszystkich środowiskach (włączając Cerekwicę i Radzików). Były to np.: KOH 275, C 3779/10, STH 1144, STH 2170, NAD 11017, STH 188, POB 1013, NAD Znaleziono również genotypy podatne we wszystkich środowiskach. Były to np.: C 3634/10, KBP_11_45, KBP_10_4, DM 3404/12, C 489/10, STH 0179, SMH 8644, NAD Uzyskane uszeregowanie genotypów pod względem indeksu fuzariozy kłosów w poszczególnych lokalizacjach podlegało silnym wpływom środowiska. Najbardziej odbiegały od pozostałych wyniki uzyskane w Nagradowicach, niskie były również współczynniki korelacji IFK w Dębinie i Polanowicach z pozostałymi. Największa była zgodność średnich wyników uzyskanych w Cerekwicy i Radzikowie z wynikami ze Smolic i Kobierzyc. Mimo tych rozbieżności współczynnik korelacji średniego IFK w Cerekwicy i Radzikowie ze średnim IFK z 6 lokalizacji był wysoki i wynosił r = 0,665. Rozbieżności rezultatów uzyskanych w różnych lokalizacjach mogły wynikać w dużym stopniu ze zróżnicowania warunków pogodowych. Szczególnie dotyczy to odpadów w okresie inokulacji kłosów pszenicy pierwsza dekada czerwca oraz w początkowym okresie rozwoju choroby (czerwiec). Istotny wpływ warunków pogodowych na rozwój fuzariozy kłosów wskazuje na konieczność przeprowadzania doświadczeń infekcyjnych, w co najmniej kilku środowiskach (lokalizacje, lata). Analiza składowych głównych, w której zmiennymi były indeksy FK z 7 lokalizacji (z wyłączeniem Nagradowic) pozwoliła na identyfikację genotypów o stabilnej reakcji w różnych środowiskach, zarówno podatnych jak i odpornych na fuzariozę kłosów. W doświadczeniu infekcyjnym w Cerekwicy analizowano odporność na fuzariozę kłosów linii pszenicy ozimej uzyskanych z krzyżowania pszenicy ozimej Turnia z odmianą jarą Sumai3 zawierającą gen odporności Fhb1. Odporność linii porównano z odpornością odmian wzorcowych oraz najodporniejszych linii pszenicy z populacji badanej w Linie TOF6-oz wykazały wysoką odporność na fuzariozę kłosów. Była ona wyższa niż odporność wzorca UNG zawierającego gen Fhb1. Dwie linie pszenicy ozimej - C 3779/10, LAD 463/05 wykazały wysoką odporność, zbliżoną do linii TOF6-oz. W ramach usług badawczych wykonano krzyżowania z przekazanymi z IHAR-PIB 6 liniami odpornymi. W 5 z tych linii w ramach prac w temacie badawczym 4 zidentyfikowano obecność lub 7

8 brak genu odporności Fhb1. Linia A nie zawiera genu Fhb1, ponieważ została uzyskana z krzyżowania z linią odporną SVP nie mającą w rodowodzie pozaeuropejskich źródeł odporności. Do krzyżowań wykorzystano również genotypy, które w doświadczeniach prowadzonych w roku 2013 wykazały odporność na fuzariozę kłosów i akumulację mikotoksyn w ziarnie (DC 185/09-2, DC 332/09, DC 21/09-4). Wnioski 1. Zidentyfikowano genotypy pszenicy wykazujące odporność na fuzariozę kłosów warunkach polowych (typ odporności I + II). 2. Potwierdzono odporność większości genotypów z kolekcji from odpornych. 3. Stwierdzono istotny wpływ wysokości roślin na wartość indeksu fuzariozy kłosów. 4. Genotypy odporne miały w większości (ok. 75%) wysokość powyżej średniej dla badanej populacji. 5. Nie było istotnej zależności pomiędzy odpornością typu I i typu II. 6. Odporności typu I i II korelowały z indeksami fuzariozy kłosów z doświadczeń polowych, jednakże wyższe były współczynniki korelacji IFK ze średnią odpornością obu typów. 7. Doświadczenia infekcyjne prowadzone w 6 lokalizacjach pokazały silny wpływ środowiska na nasilenie fuzariozy kłosów, jednakże zidentyfikowano genotypy o stabilnej reakcji (odporne, podatne) w różnych środowiskach. Temat badawczy 2: Analiza zebranego materiału pod kątem oceny odporności na zasiedlanie ziarniaków (typ III) i elementów struktury plonu (typ V odporności) w formach inokulowanych i kontrolnych Cel Ocena odporności na uszkodzenie ziarna przez Fusarium oraz tolerancji genotypów pszenicy na fuzariozę kłosów celem wyboru form odpornych. Materiały i metody W czasie żniw zebranych zostało ręcznie po kłosów z poletka w doświadczeniach polowych dla 120 wybranych, wykazujących odporność na fuzariozę kłosów, genotypów z 3 poletek inokulowanych i z poletka kontrolnego. Kłosy młócone były ręcznie lub laboratoryjną młocarnią o słabym nawiewie dla zapobieżenia utraty lekkich porażonych ziarniaków. Proporcja ziarniaków uszkodzonych przez Fusarium (typ odporności III) była określana wizualnie poprzez podział próby ziarniaków na ziarniaki zdrowe i ziarniaki z objawami porażenia przez Fusarium. Określona została redukcja komponentów plonu ziarna w odniesieniu do prób kontrolnych. Oznaczone zostały następujące komponenty: masa ziarna z kłosa, liczba ziarniaków w kłosie, masa tysiąca ziarniaków. Wyniki i dyskusja Średnie uszkodzenie ziarniaków 140 genotypów pszenicy w Cerekwicy wyniosło 57,8% wagowo oraz 67,2% liczbowo. Zakres reakcji wyniósł od 14,7% (C 3779/10) do 91,5% (SMH 8817) wagowo oraz od 19,1% (UNG , C 3779/10) do 97,0% (SMH 8644) liczbowo. Najniższe uszkodzenie ziarniaków zanotowano dla genotypów: UNG (VR), C 3779/10, LAD 463/05, STH 9059, A (R), (R), STH 1144, KOH 275 oraz KBP Najwyższe dla genotypów: KWS Ozon, SMH 8585, MOB WB , KBH 1131, SMH 8816 (S), NAD 10046, NAD (S), SMH 8851, SMH 8817 oraz SMH Redukcje masy ziarna z kłosa, liczby ziarniaków w kłosie oraz masy 1000 ziarniaków wyniosły odpowiednio 70,7%; 54,2% oraz 39,0%. Zakres reakcji: RMZK 8,0 95,8%; RLZK 0-93,7%; RMTZ 4,0 68,3% Najniższą redukcję MZK odnotowano dla genotypów Arina, NAD 11017, C 3779/10, LAD 463/05, AND 143/10 oraz NAD Najniższą redukcję LZK odnotowano dla genotypów: Arina, AND 143/10, NAD 11100, NAD 11017, DM 2566/11, C 3779/10 oraz AND 446/10. Najniższą redukcję MTZ odnotowano dla genotypów: LAD 463/05, KBP , POB 1013/10, (R), SMH 8819, UNG (VR) oraz A (R). Badane zmienne korelowały ze sobą istotnie statystycznie. Najwyższe współczynniki odnotowano dla korelacji IFK C oraz FDK C z redukcją MZK. Najniższe były współczynniki korelacji IFK C z redukcją masy 1000 ziarniaków oraz FDK z redukcją liczby ziarniaków w kłosie. Wysoki był współczynnik korelacji pomiędzy średnim indeksem fuzariozy z Cerekwicy i Radzikowa (odp. typu I + II) (przekształconym logarytmicznie) oraz uszkodzeniem ziarniaków FDK (odp. typu III) 8

9 (wyrażonym liczbowo). Współczynnik wynosił r = 0,656. Istotność powyższych korelacji wskazuje, że w przypadku pszenicy podwyższona odporność na porażenie kłosa w dużym stopniu determinuje niskie uszkodzenie ziarniaków i niską redukcje plonu ziarna. Wnioski 1. Badane genotypy wykazały zróżnicowanie odporność typu III oraz typu V. 2. Zidentyfikowano genotypy pszenicy wykazujące niskie uszkodzenie ziarniaków przez Fusarium. 3. Zidentyfikowano genotypy pszenicy wykazujące niską redukcję komponentów plonu. 4. Korelacje pomiędzy indeksem fuzariozy kłosów, uszkodzeniem ziarniaków i redukcją plonu ziarna z kłosa były istotne. Temat badawczy 3: Analiza kumulacji/degradacji toksyn fuzaryjnych (typ IV odporności) Cel Celem planowanych badań jest określenie zawartości ergosterolu (wskaźnik zawartości grzybni) oraz toksyn fuzaryjnych deoksyniwalenolu i pochodnych, niwalenolu i zearalenonu w ziarnie wybranych genotypów pszenicy wykazujących podwyższoną odporność na porażenie kłosa i uszkodzenie ziarniaków przez Fusarium. Materiały i metody Ziarno z form o najwyższej odporności i niewielkiej obniżce parametrów plonotwórczych analizowane było pod względem zawartości ergosterolu oraz toksyn fuzaryjnych deoksyniwalenolu, niwalenolu, zearalenonu (typ IV odporności, poszukiwane markery metaboliczne). Na podstawie indeksu fuzariozy kłosów w Radzikowie i w Poznaniu wybrane zostały najlepsze genotypy (około 35), których ziarno było analizowane na zawartość mikotoksyn wytwarzanych przez F. culmorum. Próby ziarna pochodziły z doświadczeń polowych w Radzikowie i Cerekwicy (razem około 70 prób). Próby ziarna z 3 powtórzeń z każdej lokalizacji zostały zmieszane. Zawartość ergosterolu określona była metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Ergosterol został wyekstrahowany roztworem metanolu w środowisku alkalicznym przy jednoczesnym zmydlaniu z użyciem promieniowania mikrofalowego. Po neutralizacji roztworu, ergosterol został wyekstrahowany do fazy organicznej za pomocą pentanu. Po wysuszeniu w strumieniu azotu ergosterol był rozpuszczany w metanolu i rozdzielany chromatograficznie techniką HPLC na kolumnie krzemionkowej za pomocą metanolu. Detekcja prowadzona była na detektorze UV. Identyfikacja ergosterolu nastąpiła na podstawie czasu retencji. Ilość ergosterolu została określona na podstawie krzywej kalibracyjnej czystego wzorca (metoda wzorca zewnętrznego). Zawartość trichotecen z grupy B w ziarnie (deoksyniwalenol [DON], niwalenol [NIV]) była analizowana przy wykorzystaniu techniki chromatografii gazowej. Mikotoksyny były ekstrahowane z 5g zmielonego ziarna za pomocą 25 ml wodnego roztworu acetonitrylu (acetonitryl:woda 84:16) poprzez wytrząsanie na wytrząsarce przez noc. Próba została odwirowana (3000 obr*min -1, 5 min.), ekstrakt oczyszczony na kolumience Trich 227+ (RomerLabs). Do 4 ml oczyszczonego ekstraktu dodano 1 µg wzorca wewnętrznego (chloraloza) i odparowano do sucha w strumieniu powietrza. Mikotoksyny były przeprowadzone w pochodne trimetylosilylowe za pomocą mieszaniny silylującej Sylon BTZ (BSA+TMCS+TMSI, 3:2:3, Supelco). Po rozpuszczeniu upochodnionej próby w izooktanie nadmiar odczynnika silylującego został rozłożony i usunięty za pomocą wody. Warstwa organiczna była przeniesiona do wialki autosamplera i poddana analizie chromatograficznej na chromatografie SRI 8610C, wyposażonym w kolumnę BGB-5MS, o długości 30m. i średnicy wewnętrznej 0,25mm. Gazem nośnym był wodór. Elucję prowadzona była w gradiencie temperatury. Detekcję mikotoksyn przeprowadzono za pomocą detektora wychwytu elektronów (ECD). Identyfikacja poszczególnych związków została wykonana przez porównanie czasów retencji czystych wzorców mikotoksyn. Stężenie mikotoksyn było określone na podstawie krzywej kalibracji, z zastosowaniem chloralozy, jako wzorca wewnętrznego. Dla porównania przeprowadzone zostały analizy czystych związków (standardy), prób ziarna nieporażonego oraz próby wzorcowe ziarna ze znaną zawartością mikotoksyn. Zawartość zearalenonu (ZEA) oznaczana była za pomocą ilościowego testu immunoenzymatycznego (ELISA) AgraQuant ZON 40/1000 (LOD 10 ppb) (Romer Laboratories) zgodnie z procedurą podaną przez producenta. Wyniki i dyskusja Średnia zawartość DON w ziarnie pszenicy ozimej wynosiła 38,7 ppm (mg/kg). Zakres zwartości DON wynosił od 15,6 ppm (STH 9059) do 115,6 ppm (NAD 11100). Współczynnik zmienności 9

10 przyjmował wartość 42,4%. Najniższą zwartością DON charakteryzowały się genotypy: STH 9059, KBP 1040, LAD 463/05, NAD 11017, MOB 5578/06, POB Najwięcej DON stwierdzono w ziarnie genotypów POB 0211, AND 1055/02, POB 0911, NAD Genotyp AND 1055/02 charakteryzował się słabym porażeniem kłosa oraz średnim uszkodzeniem ziarniaków. W ziarnie pszenicy nie stwierdzono obecności pochodnej DON 3AcDON oraz niewielkie ilości 15AcDON oraz niwalenolu. Zawartość DON korelowała istotnie z indeksem fuzariozy kłosów w Cerekwicy oraz z uszkodzeniem ziarniaków. Ten drugi współczynnik przyjmował wyższą wartość. Wysoka była wartość współczynnika korelacji ze średnim indeksem fuzariozy kłosów w Cerekwicy i Radzikowie. Średnia zawartość zearalenonu w ziarnie pszenicy ozimej wynosiła 932 ppb (mcg/kg). Zakres zwartości ZEA mieścił się w granicach od 48 ppb (STH 1144) do 6450 ppb (NAD S). Współczynnik zmienności wynosił 129,2%. Najniższą zwartością ZEA charakteryzowały się genotypy: STH 1144, C 4573/10, NAD 11017, C 1/10, STH 008, KBP 1013, STH 9059 i C 3779/10. Najwięcej ZEA stwierdzono w ziarnie genotypów: POB 0112, NAD 11100, KBP Zawartość ZEA korelowała istotnie z indeksem fuzariozy kłosów w Cerekwicy oraz z uszkodzeniem ziarniaków. Ten drugi współczynnik przyjmował wyższą wartość. Wysoka była wartość współczynnika korelacji ze średnim indeksem fuzariozy kłosów w Cerekwicy i Radzikowie. Zawartości DON i ZEA korelowały istotnie. Wnioski 1. Badane genotypy wykazały zróżnicowaną odporność typu IV. 2. Zidentyfikowano genotypy pszenicy wykazujące odporność typu IV. 3. Zidentyfikowano genotypy pszenicy wykazujące niską odporność typu IV: niskie wartości IFK i FDK - wysoka zawartość DON, średnie wartości IFK i FDK, niska redukcja masy ziarna bardzo wysoka zawartość DON. 4. Stopień porażenia kłosów (IFK) oraz uszkodzenie ziarniaków (FDK) korelowały istotnie z zawartością DON i ZEA w ziarnie. 5. Współczynniki korelacji dla ZEA były niższe ze względu na znacznie większą zmienność zwartości tej toksyny w porównaniu do DON. Temat badawczy 4: Analiza polimorfizmu DNA w loci markerów selekcyjnych dla potencjalnych rodziców wypierających i linii Muszelka+Fhb1 Cel Celem zamierzonych badań było określenie polimorfizmu DNA form rodzicielskich, który pozwoli na wybór zestawu markerów molekularnych wspomagajacych selekcję osobników pod względem występowania wprowadzanego genu odporności Fhb1. Materiały i metody Do analiz molekularnych wykorzystano zestaw odmian/linii dawców i biorców oraz pierwotne źródło genu Fhb1 odmianę Sumai3. Dawcami było 10 genotypów pszenicy ozimej pochodzących z Austrii, Węgier oraz badań prowadzonych w ramach programu Postęp Biologiczny w Produkcji Roślinnej (MRiRW lata ) w tym otrzymanych linii Muszelka+Fhb1 (AIII62 i AIII75). Natomiast zestaw biorców stanowiło 35 odmian/linii przysłanych przez 5 spółek hodowli roślin. Analizy molekularne podzielono na dwa etapy: pierwszy, dotyczył analizy homogenności i występowania w badanych materiałach allelu markera molekularnego UMN10 blisko sprzężonego z genem Fhb1; drugi, dotyczył analizy polimorfizmu DNA dla 10 markerów flankujacych gen Fhb1: gwm389, barc238, barc12, gpw7080, gwm493, barc131, wmc754, gpw3248, barc92, cfp1274. Rozdział i analizę znakowanych produktów PCR prowadzono przy użyciu analizatora DNA ABI377XL (Applied Biosystems, Foster City, USA). Wyniki W wyniku przeprowadzonej analizy locus markera molekularnego UMN10 dla 45 obiektów, stwierdzono poza jednym wyjątkiem homogenność obiektów (austryjacka linia dawcy Fhb1). Spośród badanych pozostałych 9 dawców odporności, dwie linie wykazywały allel podatności w locus markera UMN10. Natomiast u pozostałych siedmiu linii dawców wykryto allel odporności. W przypadku 35 linii biorców, stwierdzono występowanie u jednej linii (STH 124) allelu odporności i w pozostałych allelu podatności. W drugim etapie analiz molekularnych poszukiwano polimorfizmu DNA różnicującego 7 linii dawców (tylko z allelem odporności) i 34 linii biorców (tylko z allelem podatności) w loci markerów 10

11 flankujących gen Fhb1. Analizowano układ (kolejność na mapie genetycznej) i wielkość produktów PCR dla poszczególnych loci markerów molekularnych w poszukiwaniu zestawu markerów dla kombinacji dawca-biorca, który umożliwiałby efektywną selekcję pożądanych alleli w popualcjach mieszańcowych (potomnych). W związku z tym wybrano zestaw linii do krzyżowań w pięciu kombinacjach: dawca linia AIII62 oraz pięciu biorców, tj. SMH8527, DL414/10, STH1178, MIB11262 i NAD Dyskusja W regionie występowania genu Fhb1 na krótkim ramieniu chromosomu 3B zostało zidentyfikowanych wiele markerów molekularnych (np. UMN10, gwm389, barc131, wmc493 i wmc754), które były wykorzystywane w MAS. Zastosowany w badaniach marker UMN10 potwierdził swoją wartość i jednoznacznie wyróżnił obecność genu Fhb1 w testowanych liniach dawców, które w większosci przypadków są liniami wyprowadzonymi po krzyżowaniach z azjatyckimi źródłami odporności na FHB. Natomiast na 35 badanych potencjalnych linii biorców tylko jedna linia STH124 wykazywała obecność genu Fhb1, co jest zgodne z wynikami analiz prowadzonych przez innych badaczy, w których wykazano powszechny brak tego genu odporności w puli genetycznej europejskich pszenic. Wnioski 1. Marker molekularny UNM10 pozwolił na efektywne genotypowanie odmian/linii posiadających gen Fhb1. 2. Analiza zestawu markerów flankujacych gen Fhb1 umożliwiła wybranie kombinacji form rodzicielskich, dla których będzie można przeprowadzić efektywną selekcję pożądanych alleli w popualcjach mieszańcowych (potomnych). Temat badawczy 5: Wprowadzanie genu odporności Fhb1 do genotypów pszenicy z linii Muszelka+Fhb1 Cel Celem tematu jest wprowadzenie genu odporności Fhb1 do genotypów pszenicy, który warunkuje zwiększoną odporność kłosów na porażenie przez grzyby z rodzaju Fusarium. Zakres prac zakładany do realizacji celu w roku sprawozdawczym został w pełni wykonany. Materiały i metody Na podstawie wyników otrzymanych w zadaniu poprzednim, do krzyżowań wybrano dawcę odporności linię AIII62 (pochodząca od Muszelki+Fhb1) oraz pięciu biorców: SMH8527, DL414/10, STH1178, MIB11262 i NAD Siewki wybranych obiektów jarowizowano (8 tygodni w temp. 4 C), a następnie prowadzono w kontrolowanych warunkach komory klimatycznej: 16 godzin światła/22 C oraz 8 godzin ciemności/18 C. W odpowiedniej fazie rozwojowej kłosa (przed kwitnieniem) formy mateczne (5 linii biorców) kastrowano i po upływie 4-6 dni zapylano pyłkiem formy ojcowskiej AIII62. Po dojrzeniu klosów zebrano nasiona pokolenia F 1 z poszczególnych kombinacji krzyżówkowych. Wyniki W poszczególnych kombinacjach krzyżówkowych zebrano od 126 do 262 nasion pokolenia F 1. Dyskusja W hodowli roślin krzyżowania wsteczne (wypierające) są szeroko stosowaną metodą wprowadzania jednej lub kilku cech jednocześnie do genotypów o wysokiej wartości użytkowej (biorca), które tych cech są pozbawione. Wykorzystanie markerów molekularnych w krzyżowaniach wstecznych (ang. Marker Assisted Backcrosing, MABC) zdecydowanie zwiększyło efektywność selekcji pożądanych genotypów. W roszczerzonej wersji MABC, poza selekcją roślin w populacji mieszańcowej, które zawierają marker molekularny sprzężony z wprowadzanym (docelowym) genem (ang. Foreground Selection, FS), dodatkowo poszukuje się obiektów dla których doszło do rekombinacji pomiędzy markerem flankującym i wprowadzanym genem, tzw. selekcja rekombinantów (ang. Recombinant Selection, RS), co ma zapobiec wprowadzeniu do genomu biorcy wielu niepożądanych genów, które mogą być z nim sprzężone. W przypadku badań prowadzonych w ramach niniejszego tematu, gen Fhb1 będzie wprowadzany na drodze dwóch krzyżowań wstecznych. Teoretycznie, aby otrzymać po dwóch krzyżowaniach wstecznych przynajmniej jednego osobnika heterozygotycznego dla markera centralnego i homozygotycznego dla flankujących markerów w typie alleli rodziców wypierających (gwm389 i cfp1274) należy w każdym pokoleniu (tj. F 1 BC 1 i F 1 BC 2 ) przebadać przynajmniej po 62 osobniki 11

12 przy poziomie prawdopodobieństwa P = 0,99. Uzyskane w bieżącym roku liczebności nasion pokolenia F 1 ( ) w pełni zabezpieczają liczbę form matecznych, które będą wykorzystane do krzyżowań wstecznych w kolejnym roku realizacji tematu. Lp. w zał. do Rozporządzenia MRiRW: 8. Tytuł zadania: Tolerancja na stresy abiotyczne - genotypowanie pszenicy w oparciu o strategię genów kandydujących. Kierownik zadania: prof. dr hab. W. Orczyk Cel zadania Celem zadania realizowanego w roku 2014 było zbadanie korelacji wybranych etapów mikrosporogenezy z fazami rozwojowymi rośliny w warunkach kontrolnych, ustalenie eksperymentalnych warunków suszy wpływających na mikrosporogenezę, wykonanie oceny żywotności pyłku i stopnia zawiązywania nasion w roślinach, które rosły w warunkach kontrolnych lub były poddane stresowi suszy. Kolejnym celem była identyfikacja genów kandydujących przy wykorzystaniu danych literaturowych i baz sekwencji nukleotydowych oraz zapoczątkowanie weryfikacji molekularnej genów. Założone cele zostały zrealizowane w całości. Materiały i metody Materiałem biologicznym było 36 odmian pszenic pochodzących z różnych regionów klimatycznych świata. Rośliny uprawiano w kontrolowanych warunkach w szklarni. Wilgotność gleby mierzono sondą wilgotności (SM150, Geomor Technik), uzupełniając wodą do 30% wg wilgotnościomierza, co odpowiada 60-70% PPW. Oznaczono pędy główne, które były używane do badania faz rozwojowych kłosa, żywotności pyłku i liczby zawiązanych ziarniaków. Do określenia fazy rozwojowej kłosa, w której zachodziły procesy mejozy (proces powstawania młodych mikrospor), użyto parametru AD (Auricle Distance), wyrażany jest on w cm i odpowiada odległości pomiędzy uszkami liścia flagowego a przedostatniego liścia. Stres suszy ustalono na poziomie 10% wilgotności gleby mierzonej wilgotnościomierzem. U roślin poddanych stresowi AD wynosiło 5cm. Suszę utrzymywano przez 5 dni. Następnie rośliny podlewano do 20% wilgotności gleby wg odczytów wilgotnościomierza przez 2 tygodnie, a później przywrócono warunki normalne. Z pędu głównego roślin kontrolnych w fazach rozwojowych 5 liści, początku krzewienia, AD 5cm i AD 8cm izolowano rozwijający się kłos i określano jego fazę rozwojową. Z pylników robiono gniecione preparaty, barwione w 3% roztworze acetokarminu. W mikroskopie świetlnym obserwowano stadia rozwojowe mikrosporogenezy oraz w oceniano żywotność pyłku. Żywotność pyłku w roślinach kontrolnych oraz poddanych stresowi suszy określano na podstawie koloru zabarwienia cytoplazmy i obecności komórek plemnikowych. Liczono nasiona wypełniające kłos oraz liczbę kłosków i kwiatków, które określały możliwą liczbę nasion w danym kłosie badanej odmiany u roślin kontrolnych i traktowanych stresem suszy. Na podstawie tych dwóch parametrów obliczano stopień wypełnienia kłosa i wyznaczano współczynnik WKs /WKk. Wykorzystując wyniki literaturowe oraz bazy danych, wytypowano grupy procesów metabolicznych, uczestniczące w nich enzymy oraz kodujące je geny, które mogą odgrywać istotną rolę w makrosporogenezie oraz zaburzeniach mikrosporogenezy indukowanych stresem. Wyniki i dyskusja Obserwacje kolejnych faz rozwojowych rośliny i kłosa pozwoliły na skorelowanie kolejnych etapów tych dwóch procesów. Wykazano, że w roślinach pszenicy w stadium 5 liści kłos jest w stadium od rozwoju wzgórków kłoskowych do inicjacji zawiązków plew. W początkowych stadiach krzewienia kłos jest w stadium inicjacji wzgórków kwiatowych. W dalszym stadium krzewienia roślin, kłos jest w stadium od inicjacji pręcików do dalszych bardziej dojrzałych etapów rozwoju. Rośliny, w których wartość AD wynosi 5cm zawierają kłos z pylnikami kwiatów bazalnych w stadium mejozy oraz kłosy w stadium młodych mikrospor. Młode mikrospory są uwalnianie z tetrad w roślinach, gdy wartość AD wynosi od 5 do 8cm, zależnie od genotypu. Badano stadia mikrosporogenezy w kwiatkach I, II i IIIrzędowych wypreparowanych z kłoska V roślin AD 5cm. W pylnikach kwiatów I rzędu obserwowano młode mikrospory, w pylnikach kwiatu II rzędu występowały tetrady mikrospor, natomiast 12

13 w pylnikach kwiatu III rzędu obecna była jeszcze młoda tkanka sporogenna. Stadium uwalniania z tetrad młodych mikrospor było obserwowane w roślinach AD od 5 do 8cm w środkowej części kłosa. Na tej podstawie ustalono, że stres suszy będzie aplikowany w stadium AD 5cm. Wyniki badania etapów rozwoju wegetatywnego rośliny oraz faz rozwoju kłosa umożliwiają skorelowanie tych procesów. Pozwala to wystarczająco dokładnie określić fazy rozwojowe kłosa w tym mikrosporogenezy w oparciu o łatwą do określenia fazę rozwoju wegetatywnego. Do celów projektu najważniejsze było określenie wczesnych etapów mikrosporogenezy. Zgodnie z tymi wynikami, w badanych odmianach wczesne fazy mejozy i fazy mikrosporogenezy zachodzą w roślinach gdy AD wynosi 5-8 cm. Wyniki te dobrze odpowiadają wynikom literaturowym. W trakcie realizacji zadania zebrano kolekcję 112 genotypów pszenicy pochodzących z różnych regionów klimatycznych. Do doświadczeń wybrano 36 genotypów, które reprezentują potencjalnie szeroki zakres reakcji badanej cechy tj. zaburzeń mikrosporogenezy i niepłodności pyłku na stres suszy. W roślinach testowanych genotypów obserwowano duże zróżnicowanie wypełnienia kłosa w roślinach, które były poddane stresowi suszy (WKs). Najniższe wartości WKs 8% miała odmiana Triple Dirk S, a najwyższe ponad 75% odmiany CSDH 143, CSDH 98, Upi-301. Współczynnik WKs/WKk pozwolił uwzględnić rzeczywiste i potencjalne wypełnienie kłosów, w warunkach kontrolnych i stresowych. Wartości tego parametru były zróżnicowane i wahały się od 0.37 (Mina), do ponad 0,9 (Bajka, CSDH 28, CSDH 53 Mironovska 808 i Kite, SQ1, Pinka, CSDH143, Ns-55-25, Rusalka). Żywotność pyłku z roślin kontrolnych wynosiła 100% u wszystkich genotypów. Żywotność pyłku pobranego z roślin poddanych stresowi suszy była zróżnicowana i wahała się od 0% do 100%. Najniższe wartości (0%) obserwowano u odmian: Ching Chang 6, Linia #20277, Triple Dirk S i Linia #21134 wartości najwyższe u odmian: Peking 11, Sava, CS, SQ1, Albena, U-1, CSDH 143, CSDH 53, Vireo S i Linii # Wyniki wskazują na znaczną zgodność współczynnika WKs/WKk z żywotnością pyłku w stresie suszy. Na podstawie danych literaturowych oraz zdeponowanych w bazach sekwencji nukleotydowych wybrano 26 klonów (głównie cdna), w tym jeden klon genomowy i jedną sekwencję przypuszczalnego pseudogenu. Wybrane transkrypty reprezentują geny kodujące białka enzymatyczne / regulatorowe procesów ważnych w czasie mikrosporogenezy i jednocześnie tych, których zaburzenie stresem powoduje niepłodność pyłku. Profil ekspresji wytypowanych genów będzie analizowany w trakcie dalszych etapów realizacji zadania. Pierwszy etap projektowania i weryfikacji starterów do tej analizy wskazał, że część z nich spełniała kryteria przydatności do qpcr. Wnioski 1. Stadium rozwoju rośliny AD 5-8cm, odpowiadające fazie rozwojowej kłosów w stadium mejozy jest odpowiednim etapem rozwoju do aplikowania stresu suszy i badania wpływu tego stresu na przebieg mikrosporogenezy. 2. Obserwowano duże zróżnicowanie zawiązywania nasion i wypełnienia kłosa w roślinach wybranych genotypów pszenicy w warunkach normalnych oraz po stresie suszy. 3. Niezaburzona mikrosporogenza w warunkach normalnych warunkowała wysoką żywotność pyłku we wszystkich badanych genotypach pszenic. 4. Duże zróżnicowanie żywotności pyłku w roślinach tych samych genotypów poddanych stresowi suszy wskazywało na: i) negatywny efekt stresu na przebieg mikrosporogenezy oraz ii) duże zróżnicowanie reakcji na ten stres zależne od genotypu. 5. Korelacja współczynnika wypełnienia kłosa (WKs/WKk) oraz żywotności pyłku pozytywnie weryfikuje jedno z głównych założeń projektu. 6. Wytypowano 26 genów pszenicy, ważnych w procesie mikrosporogenezy i jednocześnie potencjalnie ulegających zróżnicowanej ekspresji w czasie stresu suszy. 7. Pierwsza część badań molekularnych potwierdziła, że pięć wybranych genów metabolizmu węglowodanów oraz syntezy i katabolizmu ABA ulega ekspresji w komórkach rozwijającego się kłosa. 13