This copy is for personal use only - distribution prohibited.

Transkrypt

1 Above all, the parents must understand that in undertaking prenatal diagnosis, they are under no implied obligation to terminate a pregnancy in the event that an abnormality is detected. Wstęp Inwazyjna diagnostyka przedurodzeniowa. Doświadczenia własne 15 lat realizacji programu Bogdan Kałużewski 1, Maria Constantinou 1, Zofia Helszer 1, Anna Eckersdorf-Masztalerz 1, Tamara Michalska 1, Małgorzata Perenc 2, Jerzy Korczyński 3, Waldemar Lech 4, Lech Dudarewicz 5, Marek Wieczorek 6 1 Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi 2 Pracownia Biologii Molekularnej, Klinika Chorób Dzieci Instytutu Pediatrii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi 3 Klinika Ginekologii Onkologicznej Katedry Onkologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi 4 I Klinika Ginekologii i Onkologii Ginekologicznej Instytutu Ginekologii i Położnictwa Uniwersytetu Medycznego w Łodzi 5 Zakład Genetyki Medycznej Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki, Łódź 6 IV Szpital Miejski im. dr. H. Jordana, Łódź Streszczenie: W okresie 15 lat przeprowadzono 2014 zabiegów amniopunkcji, których celem było pozyskanie materiału do genetycznej diagnostyki przedurodzeniowej. Zdiagnozowano 86 aberracji chromosomowych, 30 wariantów chromosomowych oraz 29 przypadków otwartych wad OUN (wady ośrodkowego układu nerwowego - OUN). Dzięki usprawnieniom laboratoryjnym, skrócono czas opracowywania wyniku badań biochemicznych do 24 godzin oraz badań cytogenetycznych do 7 8 dni. Wprowadzenie techniki FISH (interfazowa ocena najczęstszy aneuploidii chromosomowych) skróciło w wybranych przypadkach czas oczekiwania na wynik do godzin. Przyjęcie standardowych warunków, które towarzyszyły zabiegowi amniopunkcji ograniczyło do minimum ryzyko utraty ciąży, związane z zabiegiem amniopunkcji. Wprowadzenie na szeroką skalę nieinwazyjnych, przesiewowych badań przedurodzeniowych, zrewidowało klasyczne wskazania do inwazyjnej genetycznej diagnostyki przedurodzeniowej. Problem ten jest podjęty w dyskusji. Słowa kluczowe: diagnostyka przedurodzeniowa poradnictwo genetyczne metodyka badań Adres do korespondencji: Prof. dr hab. n. med. Bogdan Kałużewski, Zakład Genetyki Medycznej, Uniwersytetu Medycznego w Łodzi,, ul. S. Sterlinga 1/3, Łódź Thompson & Thompson Genetics in Medicine Sixth Edition, 2001 Od wieków kobiety ciężarne i ich lekarze dokonywali przedurodzeniowej oceny płodu, obserwując częstość i intensywność ruchów płodu, słuchając tonów serca, oceniając poprzez powłoki brzuszne wielkość płodu oraz ilość wód płodowych. Formalnie jednak genetyczna diagnostyka przedurodzeniowa zaczęła być postrzegana jako fragment rutynowej opieki nad ciężarną kobietą około 33 lat temu, a więc około roku 1970 [1]. Początek lat siedemdziesiątych to początek epoki badań prążkowych chromosomów, która ponownie ożywiła wysiłki laboratoryjne cytogenetyków, przynosząc w efekcie opisy kilku tysięcy nowych aberracji chromosomowych. Trzeba dodać do tego świadomość, którą uzyskało wielu lekarzy oraz znakomita większość genetyków klinicznych, że efekt nieobciążonej rodzinnie koncepcji w postaci ludzkiego embrionu narażony jest na istotne ryzyko niezrównoważenia kariotypu (ryzyko około 50%) za sprawą aneuploidii komórki jajowej (18 19%) oraz aneuplodii plemników (3 4%) [2]. 1

2 Tak więc pierwszym celem realizacji programu inwazyjnej diagnostyki przedurodzeniowej (program PIDP), stało się wykluczenie aberracji chromosomowej jako potencjalnego czynnika ryzyka choroby płodu. Celem drugim realizacji programu jest wykluczenie wad ośrodkowego układu nerwowego OUN, poprzez określenie stężenia alfa-fetoproteiny (AFP) w płynie owodniowym [3], oznaczenie ilościowe spektrofotometryczne aktywności acetylo-cholinesterazy (AChE, EC ) i cholinestrazy (ChE, EC ) [3] oraz ich oznaczenia jakościowe [4]. Celem trzecim realizacji programu PIDP, coraz częściej staje się konieczność pozyskania próbki DNA płodu, która w przypadkach wyselekcjonowanych na podstawie danych z wywiadu lekarskiego, drogą badania mutacji DNA, badań biochemicznych lub analizy sprzężeń pozwala określić ryzyko choroby płodu. Dwa pierwsze cele programu inwazyjnej diagnostyki przedurodzeniowej są celami obligatoryjnymi, muszą być zrealizowane łącznie w każdym przypadku amniopunkcji wykonywanej dla celów poradnictwa genetycznego, gdy zaistnieje cel trzeci, wszystkie trzy programy diagnostyczne powinny zostać zrealizowane równolegle. Wskazania lekarskie do przeprowadzenia diagnostyki przedurodzeniowej 1. Wiek ciężarnej powyżej 35 roku życia. Powyższa cezura wiekowa była i jest podyktowana znanym faktem, że właśnie w tym wieku ryzyko związane z urodzeniem dziecka obciążonego aberracją chromosomową jest równe lub większe od ryzyka poronienia, które niesie ze sobą zabieg amniopunkcji. Przez szereg lat stosowaliśmy kryterium 37 roku życia ciężarnej, co było raczej efektem braku środków finansowych, uniemożliwiających przeprowadzenie badań w liczniejszej grupie ciężarnych. 2. Wynik testu przesiewowego MSS (Maternal Serum Screening) surowicy krwi ciężarnej wskazujący na podwyższone ryzyko aneuploidii chromosomowych lub otwartych wad OUN i/lub nieprawidłowy wynik badania ultrasonograficznego. Powyższe wskazania zyskały na znaczeniu w ostatnich 10 latach w związku z postępem w zakresie rozwoju technik precyzyjnego określania stężeń markerów użytecznych w realizacji programu MSS oraz jakością obrazu uzyskiwanego w trakcie przesiewowych badań ultrasonograficznych. 3. Nosicielstwo przez jedno lub oboje rodziców aberracji strukturalnej chromosomów. Ryzyko konsekwencji takiego stanu rzeczy nie zawsze jest tak łatwe do określenia, jak to ma miejsce w przypadku nosicielstwa translokacji der(21;21)(q10;q10) (ryzyko 100%). W przypadkach nosicielstwa innych translokacji zrównoważonych wymagane jest precyzyjne określenie punków złamań chromosomów uczestniczących w rearanżacji chromosomowej oraz wskazanie pochodzenia matczynego lub ojcowskiego centromerów nieprawidłowych chromosomów. Ustalenie faktu czy jest to aberracja powstała de novo, czy występująca rodzinnie [5]. 4. Urodzenie dziecka ze zdiagnozowaną aberracją chromosomową. Przy założeniu, że w takim przypadku kariotyp rodziców jest prawidłowy, z przyczyn w obecnej chwili nieznanych ryzyko urodzenia kolejnego dziecka obarczonego aberracją chromosomową jest podwyższone [6] Wysokie ryzyko genetyczne wystąpienia chorób sprzężonych z płcią (np. hemofilia, dystrofia mięśniowa typu Duchenne a). W związku z 25% ryzykiem choroby u dziecka płci męskiej zwykle poprzestaje się na określeniu płci płodu metodami cytogenetycznymi lub molekularnymi. W naszym ośrodku, gdy tylko metoda jest osiągalną prowadzimy pełną diagnostykę molekularną płodu i rodziców. 6. Niektóre choroby, zależne od możliwych do zdiagnozowania mutacji pojedynczych genów. W chwili obecnej jest dostępnych około 400 testów diagnostycznych w tych przypadkach ( tyka, możliwości diagnostyczne krajowych laboratoriów referencyjnych i licencjonowanych; możliwości diagnostyczne międzynarodowej sieci GENDIA). O celowości przeprowadzenia w podobnych przypadkach analizy mutacji lub analizy sprzężeń, dowiadujemy się, oceniając obciążony wywiad lekarski lub na podstawie wyniku populacyjnych badań przesiewowych. 7. Obciążający wywiad rodzinny lub wynik testów przesiewowych MSS w kierunku wad ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Możliwość zaproponowania w tych przypadkach profilaktyki w kolejnych ciążach stanowi wdzięczny aspekt realizacji programu inwazyjnej diagnostyki przedurodzeniowej [7]. 8. Wskazanie natury psychologicznej. W grupie ciężarnych wykształconych, często korzystających z Internetu jako źródła informacji popularno-naukowych, oraz w grupie ciężarnych specjalnego ryzyka urazów psychicznych związanych z charakterem pracy (nauczycielki i rehabilitantki zatrudnione w Domach Małego Dziecka, Domach Pomocy Społecznej, Ośrodkach Szkolno-Wychowawczych) powstaje niekiedy subiektywna, nieuzasadniona w/w względami lekarskimi potrzeba przeprowadzenia diagnostyki przedurodzeniowej. Potrzeba ta jest niekiedy tak silna, że spełnienie jej staje się warunkiem kontynuowania ciąży. W takich przypadkach uważamy, że istnieją wskazania lekarskie do przeprowadzenia diagnostyki przedurodzeniowej. Niezależnie od konieczności przestrzegania powyższych wskazań lekarskich do przeprowadzenia inwazyjnej genetycznej diagnostyki przedurodzeniowej, należy zwracać uwagę na spełnienie warunków niezbędnych do przeprowadzenia badania [8]. Powyższe wskazania lekarskie oraz warunki do przeprowadzenia diagnostyki przedurodzeniowej dobrze współbrzmią z paragrafami 38 i 39 Kodeksu Etyki Lekarskiej, które to paragrafy innymi słowy wyrażają troskę o zdrowie płodu ludzkiego, ciężarnej kobiety oraz możliwość skorzystania z dobrodziejstw współczesnej medycyny. Materiał i metody W latach w Zakładzie Genetyki Medycznej w Łodzi przeprowadzono 2014 zabiegów amniopunkcji AFS (AFS, ang. amniotic fluid sampling, zabieg przeprowadzany pomiędzy tyg. ciąży) oraz zabiegów EAFS (ang. Early-AFS, przeprowadzany pomiędzy tyg. ciąży). W latach przeprowadzono również 86 zabiegów biopsji kosmówki CVS (CVS, ang. chorion villus sampling). Udział wiekowy ciężarnych poddanych genetycznej diagnostyce prenatalnej wyniósł: w wieku do 30 lat 19,4%, w wieku lat 11,4%, powyżej 35 roku życia 69,2%.

3 A B Rycina 1. (A) ultrasonograficzna głowica sektorowa z niewielką ilością jałowego żelu zostaje umieszczona w jałowym worku polietylenowym. Firmowa przystawka ograniczająca ruchy igły znakomicie zwiększa precyzję wkłucia. Porównaj Ryciny 2C i D. (B) optymalna lokalizacja miejsca i kąta wkłucia igły punkcyjnej. Szczegóły w tekście. Metodę wykonywania preparatów bezpośrednich oraz hodowli komórek trofoblastu opisano poprzednio [9]. Ze względu na relatywnie wysoki wskaźnik powikłań, który towarzyszył zabiegowi CVS oraz obserwowane zjawisko pseudomozaikowości [10], technikę CVS wykorzystujemy jedynie w tych przypadkach, gdy możliwie szybko chcemy ustalić płeć płodu lub gdy zabiegamy o możliwie wczesne i efektywne uzyskanie próbki DNA dla dalszej diagnostyki, przeprowadzanej metodami biologii molekularnej. Nowe efektywne metody izolacji DNA, oparte na zdolności wiązania DNA do złóż krzemionkowych, przy wysokich stężeniach soli chaotropowych, jeszcze bardziej ograniczyły przydatność techniki CVS, bowiem metody te pozwalają na izolację DNA bezpośrednio po amniopunkcji, z pominięciem etapu hodowli komórkowej, w ilościach wystarczających do przeprowadzenia termo-reakcji PCR. W omawianym okresie zabiegi amniopunkcji wykonywało sześciu lekarzy reprezentujących różny stopień doświadczenia klinicznego oraz różny styl przeprowadzenia zabiegów inwazyjnych. W sposób istotny zmieniały się również warunki techniczne towarzyszące hodowli komórkowej oraz realizacji procedur cytogenetycznych. Wpływ w/w czynników na sukces realizacji programu zostanie omówiony w dyskusji. Sposób i termin przeprowadzenia zabiegu AFS i EAFS ma istotne znaczenie dla szansy sprawnego zrealizowania całego programu. Zabiegi amniopunkcji były przeprowadzane w pomieszczeniu odpowiadającym warunkom A C Rycina 2. (A) makrofotografia końcówek trzech igieł, testowanych w naszym ośrodku. Igły 1 i 3 są igłami specjalnie wykonanymi dla celów amnio- i kordocentezy. Uwagę zwraca specjalne wykończenie igieł ułatwiające powstanie echa ultrasonograficznego. Po zanurzeniu igieł do zlewki wypełnionej wodą, uwidoczniono bardzo podobny efekt ultrasonograficzny (B). Wkłucie igieł 1 i 3 jest bolesne i traumatogenne. W naszym ośrodku, od lat, stosujemy igłę 2, stosowaną powszechnie do nakłuć lędźwiowych. (C) obraz ultrasonograficzny miednicy małej w 16 tygodniu ciąży, strzałka długa wskazuje zarys główki płodu, strzałka krótka, lokalną kontrakcję mięśnia macicy. Gdyby podobne zjawisko wystąpiło na przedniej ścianie mięśnia macicy, należałoby rozważyć przełożenie terminu zabiegu o kilka godzin lub dni. (D) nieznaczna zmiana położenia głowicy ultrasonograficznej, uwidoczniła jednak przestrzeń do której wkłuto bezpiecznie igłę pobierając próbkę płynu. Uwagę zwraca lokalizacja łożyska na ścianie przedniej macicy. aseptycznego gabinetu zabiegowego przy stałym monitoringu warunków sanitarnych pracy przez właściwą Stację Sanitarno-Epidemiologiczną. W każdym przypadku zakładano standardową dokumentację lekarską, zwracając uwagę na wszystkie okoliczności, które mogłyby powikłać stan ciężarnej po zabiegu amniopunkcji. Po przygotowaniu, ciężarne były badane ginekologicznie palpacyjnie oraz z użyciem wziernika. Celem badania była ocena stanu szyjki macicy w obecnej ciąży. Operator ubrany był w jałowy fartuch chirurgiczny, maskę oraz gumowe rękawice, podobnie ubrana była asysta. Powłoki brzuszne ciężarnej były trzykrotnie myte roztworem 70% alkoholu etylowego, oraz trzykrotnie alkoholowym roztworem 1% jodyny. Pole operacyjne było obkładane jałowymi serwetami. Pierwszym zadaniem operatora był wybór miejsca wkłucia igły do najłatwiej dostępnej i największej kieszeni worka owodniowego, w sposób uwzględniający lokalizację łożyska, aktualne położenie płodu oraz przewidywalne zmiany położenia płodu. Należy B D 3

4 unikać obrzeży worka owodniowego zabiegając o zachowanie kąta prostego pomiędzy osią wkłucia igły i powierzchnią worka owodniowego (Rycina 1B). Czynności powyższe przeprowadzano przy użyciu wysokiej klasy ultrasonografu wyposażonego w głowicę sektorową typu convex 3.5 MHz/ R40. Głowicę, po zwilżeniu jałowym żelem, umieszczano w jałowym worku foliowym, uzbrajając w prowadnicę umożliwiającą monitorowanie procesu wkłucia igły (Rycina 1A). Tylko wyjątkowo wykonywano zabiegi z wolnej ręki np. wtedy, gdy u otyłej ciężarnej mamy obawę lub pewność, że zabraknie nam długości igły dla sprawnego pobrania próbki płynu. Sprawdzono użyteczność większości igieł oferowanych przez różnych producentów. W warunkach naszego ośrodka najlepsze wyniki uzyskujemy stosując igłę: Spinal Needle Quincke Type Point 22g7 recorder No. 5149, LUER-LOK Hub z firmy Becton Dickinson (Rycina 2A,B). Nie znieczulano powłok brzusznych przed wkłuciem, bowiem zastosowanie w/w igły pozwala na wykonanie zabiegu z bolesnością nie większą, niż ta, która towarzyszy zabiegowi iniekcji domięśniowej (Rycina 2C,D). Czas, który poświęcamy przygotowaniu powłok brzusznych ciężarnej oraz wyboru miejsca wkłucia, poświęcano rzeczowej i spokojnej rozmowie z ciężarną, która ma na celu wyjaśnienie wszystkich szczegółów zabiegu. Jest bardzo ważnym, aby ciężarna nie była zaskoczona momentem wkłucia igły. Uzyskanie tego celu można wspomóc zalecając ciężarnej obserwowanie zabiegu na dodatkowym monitorze ultrasonografu pozostającym do dyspozycji ciężarnej. Pierwszą porcję płynu (ok. 0,5 ml) pobieramy do strzykawki o pojemności 2 ml i nie poddajemy dalszej obróbce. Zasadniczą porcję płynu pobieramy do strzykawek o pojemności 5 ml, do ostatecznej objętości (X ml = X tyg.ciąży). Strzykawki powinny zostać natychmiast podpisane niezmywalnym pisakiem w sposób wykluczający pomyłkę, a prawidłowość zapisu nazwiska powinna sprawdzić również ciężarna. Jeżeli płyn owodniowy różni się barwą w kolejnych strzykawkach wskazane jest, aby w procesie łączenia próbek i wirowania, łączyć porcje płynu o zbliżonej barwie. Przetestowano użyteczność większości strzykawek jednorazowego użytku dostępnych na polskim rynku. W warunkach naszego ośrodka dobrze sprawdzają się strzykawki firmy Bacton Dickinson. Zasadą jest, aby unikać strzykawek, których producent uzyskuje szczelność tłoka zwilżając wnętrze strzykawki płynem, którego składu nie podaje. Próbki płynu owodniowego poddawano natychmiast dalszym etapom obróbki laboratoryjnej, jakkolwiek uzyskiwano dobre wyniki hodowlane z próbkami pobranymi 24 godziny wcześniej. Ciąża mnoga W omawianym okresie do Poradni skierowano 13 ciężarnych z ciążą dwojaczą, oraz 1 ciężarną z ciążą trojaczą. Warunki techniczne pobrania materiału do badań nie odbiegały od standardowych. Po dokładnej lokalizacji worków owodniowych oraz położenia płodu, wkłuwano się do tego worka owodniowego, który stwarzał dogodniejsze warunki do amniocentezy. Po pobraniu typowej ilości wód, do worka owodniowego podawano roztwór barwnika PatentblauV firmy BYK Gulden (0,5 ml 2,5% roztworu barwnika rozcieńczano w 1,5 ml 0,9% jałowego roztworu soli fizjologicznej). Z drugiego wkłucia pobierano próbkę płynu owodniowego worka owodniowego drugiego, której barwa powinna być żółto opalizująca, świadcząc o sukcesie procedury. Tylko wyjątkowo pozyskiwano obie próbki z jednego wkłucia (2 razy w trakcie realizacji programu). 4 Zabieg amniocentezy u ciężarnych Rh( ) W Poradni odnotowano 339 (16,8%) takich przypadków. Kilka minut po zabiegu wszystkim ciężarnym podawano domięśniowo surowicę anty D w ilości 150 µg (Immunoglobulinum humanum anty RhD, Gamma anty- D150 BIOMED Lublin). Brak jest dowodów, że zabieg amniopunkcji, może sprzyjać immunizacji ciężarnej, ale w/w profilaktykę stosowano zwyczajowo [11]. Lokalizacja łożyska (trofoblastu) na ścianie przedniej mięśnia macicy W przypadkach, gdy ultrasonograficznie lokalizowano łożysko na ścianie przedniej macicy, zwracano uwagę na przyczep pępowiny, poszukując miejsca wkłucia możliwie odległego, ale przy zachowaniu wyżej opisanej zasady unikania wkłuć na obrzeżach ultrasonograficznych worka owodniowego pod dużym kątem do jego powierzchni (Rycina 2C,D). Badanie kariotypu płodu Metoda hodowli komórek owodniowych in situ 1. Płyn owodniowy pobrany do 2 4 strzykawek o pojemności 5 ml był przenoszony do jałowych probówek o pojemności 10 ml firmy TPP i odwirowywany (10 minut, 800 obrotów na minutę). Supernatant był przeznaczony do badań w kierunku wad OUN. Osad komórkowy zawieszano w 0,6 ml płynu hodowlanego, o temperaturze 37 C (podłoże BIO-AMF 2 Biological Industries Kibbutz Beit Haemek Israel cat B). 2. Szkiełka nakrywkowe (firmy Erie Scientific Company Esco borosilicate glass No cat C9802-1CS) zanurzano w metanolu, opalano nad palnikiem gazowym i umieszczano w jałowych plastikowych szalkach Petriego (35 mm, firmy TPP). 3. Na poszczególne szkiełka nanoszono po 0,3 ml zawiesiny komórkowej. 4. Po 24-godzinnej inkubacji dodawano po 2,0 ml płynu hodowlanego do każdej szalki. (Zwykle zakładamy 4 hodowle, zdarza się jednak, że w przypadku trudności technicznych podczas zabiegu amniopunkcji mamy do dyspozycji mniejszą ilość płynu owodniowego. W tych przypadkach musimy się zadowolić mniejszą liczbą hodowli). 5. Po 48-godzinnej hodowli podłoże hodowlane wymieniano. Procedurę przeprowadzano ostrożnie, aspirując pipetą podłoże hodowlane z brzegu szalki. Dodawano jest 2 ml świeżego podłoża do każdej z szalek. Procedurę wymiany podłoża powtarza się dwukrotnie w ciągu tygodnia. 6. Przy obserwowanym wzroście kolonii posiadających od 50 do 200 komórek, proces hodowli przerywano. Najlepsze wyniki zwykle uzyskuje się wymieniając podłoże 24 godziny przed utrwaleniem hodowli. Wykonanie preparatów cytogenetycznych 1. Do szalki hodowlanej dodawano 1 kroplę roztworu Colcemidu firmy Gibco BRL (5 µg/ml, inkubacja 1-godzinna w temperaturze 37 C). 2. Po usunięciu przez odpipetowanie podłoża hodowlanego dodawano roztwór hipotoniczny (1,5 2 ml 0.8% cytrynian sodu). Inkubacja hipotoniczna trwała 20 minut i przeprowadzana była w inkubatorze w temperaturze 37 C.

5 3. Preparaty utrwalano przez dwukrotne dodanie do szalki 2 ml utrwalacza (metanol: kwas octowy lodowaty 3:1- Utrwalacz I). 4. W kolejnej fazie utrwalania, dodawano mieszaninę kwasu octowego i metanolu (w stosunku 3:2 Utrwalacz II) na sekund. 5. Szkiełka nakrywkowe, po wyjęciu z szalek, umieszczano na płycie grzejnej o temperaturze 42 C. Prowadzony w ten sposób proces dojrzewania preparatów trwał 24 godziny. Jakość preparatów cytogenetycznych między innymi zależy od wilgotności i temperatury otoczenia. Oba parametry można do pewnego stopnia zmieniać, wykonując preparaty cytogenetyczne w sąsiedztwie np. zlewki, w której podtrzymywane jest wrzenie wody. Technika barwienia preparatów metodą GTG 1. Preparaty trawiono w 0,05% roztworze trypsyny (firmy Gibco BRL) w PBS o ph 7.0 na około 30 sekund. (Roztwór PBS zbuforowany, uzupełniony chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu Biomed Wytwórnia Surowic i Szczepionek Lublin). 2. Preparaty przeprowadzano przez roztwór PBS proces powtarzano trzykrotnie, a następnie barwiono 2% roztworem Giemsy firmy GURR o ph 6.8 przez 5 minut. Ocena cytogenetyczna preparatów Preparaty cytogenetyczne oceniano przy zastosowaniu obiektywów mikroskopowych o pow. 20 (Nikon Plan20/0,5) oraz o pow. 100 (Nikon PlanApo100/1,25 Oil). Oceniano minimum 15 płytek metafazowych. Po określeniu liczby modalnej chromosomów oraz po rozpoznaniu płci chromosomowej, przeprowadzano analizę prążek po prążku minimum 5 płytek metafazalnych. W przypadkach mozaikowych oraz w przypadkach aberracji strukturalnych, liczba badanych płytek metafazowych była zwiększana do 30. Ostateczna weryfikacja wyniku badania cytogenetycznego przeprowadzana była przy użyciu komputerowego analizatora kariotypu MultiscanScan-Karyotype [12]. W ramach prowadzonej wewnętrznej kontroli jakości, ocenę preparatu pod mikroskopem oraz analizę komputerową realizuje dwóch pracowników laboratorium. Niezależnie od sytemu wewnętrznej kontroli jakości, laboratorium uczestniczy w systemie kontroli zewnętrznej organizowanej przez Zakład Genetyki Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie oraz ostatnio dwukrotnie w systemie kontroli badań genetycznych w zakresie cytogenetyki klinicznej oraz cytogenetyki molekularnej Labquality Finlandia. Cytogenetyka interfazowa Przygotowanie preparatu 5 ml wód płodowych przenoszono do jałowej probówki wirowniczej, wirowano przy 800 obrotach na minutę przez 10 minut. Supernatant dekantowano, a pozostały osad zawieszono w ok. 0,3 0,5 ml ogrzanego do 37 C podłoża hodowlanego BIO-AMF-2. Całość nanoszono na docięte do rozmiarów szalki Petriego (18mm/18mm) fabrycznie odtłuszczone mikroskopowe szkiełko podstawowe. Komórki owodniowe poddawano sedymentacji przez noc, w temperaturze 37 C (w atmosferze 5% CO 2 ). Po około 16 godzinach stosowano szok hypotoniczny przy użyciu 0,7% cytrynianu sodowego (37 C, 20 minut) oraz łagodne utrwalanie przy użyciu utrwalacza I przez 5 minut i utrwalacza II przez 5 minut. Wydajność procesu sedymentacji oceniano, wykorzystując mikroskop kontrastowo-fazowy. Preparaty dojrzewano na płycie grzejnej w temperaturze 95 C przez 1 godzinę, a następnie poddawano procesowi hybrydyzacji. Procedura hybrydyzacji in situ (FISH) Zastosowano komercyjnie dostępny test MultiVysion PGT (Vysis), obejmujący sondy specyficzne dla chromosomów 13 (13q14), 18 (D18Z), 21 (21q22.13), X (DXZ1) i Y (DYZ3). Każda z sond była wyznakowana bezpośrednio fluorochromem, kolejno SpectrumRed, SpectrumAqua, SpectrumGreen, SpectrumBlue oraz SpectrumGold. Zastosowano 5-minutową kodenaturację preparatów cytogenetycznych i sond molekularnych w 73 C, a następnie 4-godzinną hybrydyzację w 37 C przy użyciu płyty grzejnej z możliwością programowania temperatur i czasów wyżej wymienionych procesów (Hybrite, Vysis). Nadmiar niezhybrydyzowanej sondy i niespecyficznie związaną sondę molekularną usuwano poprzez dwuetapowe płukanie preparatów chromosomowych kolejno: 5 minut w 0,3% roztworze buforu NP-40 o temperaturze 73 C oraz 1 minutę w 0,1% roztworze buforu NP-40 w temperaturze pokojowej. Preparaty wizualizowano w rotworze Antifade II (Vysis) a następnie oceniano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Olympus BX-61, wyposażonego w jednopasmowe filtry optyczne - Aqua, Red, Green, Yellow, Blue (Vysis). Informacyjne jądra interfazowe rejestrowano przy pomocy monochromatycznej, chłodzonej kamery CCD firmy Photometrics (Photometrics Quantix, KAF 1400) oraz systemu komputerowej analizy obrazu ISIS (MetaSystems) (Rycina 3A,B). Kryteria oceny preparatów 1. Jeżeli w preparacie obserwuje się mniej niż 10% komórek wykazujących aneuploidie badanych chromosomów, to stwierdza się prawidłową liczbę chromosomów. Możliwe jest określenie płci chromosomowej. 2. Jeżeli w preparacie obserwuje się więcej niż 60% komórek wykazujących aneuploidie badanych chromosomów to stwierdza się aneuploidię chromosomową. Możliwe jest określenie płci chromosomowej. 3. Jeżeli w preparacie obserwuje się od 10 do 60% komórek wykazujących aneuploidie badanych chromosomów to stwierdza się mozaikowość chromosomową. Możliwe jest określenie płci chromosomowej. Biochemiczne badanie płynu owodniowego Metody badań biochemiczne płynu owodniowego (oznaczenia ilościowe stężenie AFP i aktywność AChE, EC , oraz oznaczenia jakościowe ChE, EC ) opisano szczegółowo wcześniej [4]. Wyniki i omówienie Wyniki badań uzyskane podczas piętnastu lat realizacji programu są trudne do jednoznacznej oceny, bowiem w omawianym okresie zmieniły się warunki techniczne prowadzenia badań (Tabela 1). Lata to okres, w którym hodowle amniocytów prowadzone były w naczyniach szklanych typu Leighton w systemie zamkniętym. Niezbędna dla 5

6 hodowli komórkowej atmosfera 5% CO 2 była wytwarzana na drodze reakcji chemicznej. Jakość płynów hodowlanych pozostawiała wiele do życzenia ze względu na centralną dystrybucję materiałów i odczynników oraz wadliwe przechowywanie (wielokrotne rozmrażanie i zamrażanie podłoży) przed dostarczeniem użytkownikowi. Lata to okres wprowadzenia do laboratorium inkubatorów z automatycznie regulowaną atmosferą CO 2 i wilgotnością, co umożliwiło hodowanie komórek w systemie otwartym. Do praktyki laboratoryjnej wprowadzono także naczynia polistyrenowe o specjalnej hydrofobowej strukturze [13]. Za przełomowy moment w poprawieniu sprawności laboratoryjnej realizowanej procedury należy przyjąć wprowadzenie hodowli in 6 A B Rycina 3. (A) cytogenetyka interfazowa, w badaniu nie stwierdzono aneuploidii chromosomów 13, 18, 21, X i Y, rozpoznano płeć chromosomową męską. Sygnały hybrydyzacyjne niebieski i żółty odpowiadaja gonosomom X i Y. Sygnały czerwone odpowiadają parze chromosomów 13, sygnały aqua parze 18. (B) trisomia chromosomu 21 wykryta w trakcie diagnostyki prenatalnej z wykorzystaniem cytogenetyki interfazowej. Sygnały zielone odpowiadające trzem kopiom chromosomu 21. situ. Przyniosło to efekt w postaci ponad trzykrotnego skrócenia czasu hodowli. Poprawiła się również znamiennie jakość preparatów cytogenetycznych. Kolejną ważną okolicznością, która umożliwiła udoskonalenie procedury było wprowadzenie komputerowej analizy obrazu. Początkowo był to system firmy Applied Imaging (aparat Cytoskan 3), zastąpiony następnie produktem krajowym firmy Computer Scanning Systems MultiScan-Karyotype. Wymiana inkubatorów na urządzenia nowej generacji z progiem dezynfekcyjnym pozwoliła dodatkowo na auto-sterylizację wnętrza cieplarki (filtry HEPA), tym samym przyczyniła się do istotnego zmniejszenia ryzyka kontaminacji mykologicznej, bakteryjnej i wirusowej hodowli komórkowych in vitro. Jak wynika z Tabela 1 ostateczne opracowanie wyniku w chwili obecnej trwa jedną dobę i jest to 8 lub 9 dzień realizacji procedury. Uzyskane wyniki czasu trwania hodowli komórkowej (7 8 dni), opracowania mikroskopowego oraz analizy obrazu (1 dzień) należy uznać za prawidłowe i odpowiadające standardom europejskim. Cytogenetyczne metody badania chromosomów metafazowych charakteryzują się relatywnie długim czasem oczekiwania na wynik (8 9 dni) ze względu na etap hodowli in vitro komórek owodniowych. Aplikacja wielokolorowej techniki FISH do niehodowanych amniocytów znacząco skraca ten czas przez możliwość analizowania jąder interfazowych bezpośrednio po uzyskaniu próbki płynu owodniowego (bez konieczności oceny chromosomów) [14]. Przykładem jest wdrożony do praktyki w naszym laboratorium test MultiVysion PGT, który umożliwia jednoczesną detekcję aneuploidii chromosomów 13, 18, 21, X i Y na poziomie jądra ionterfazowego. Jednoczasowa hybrydyzacja z pięcioma sondami stwarza dodatkowo możliwość określenie płci chromosomowej (Rycina 3A,B). Wydanie wyniku jest możliwe po godzinach od pobrania próbki wód płodowych. Dzięki tej technice rozpoznano 3 aneuploidie chromosomowe (trisomia chromosomu 21, monosomia chromosomu X i poliploidia chromosomowa) na 40 zakwalifikowanych do badań przypadków. Opisywana metoda jest stosowana z wyboru jako uzupełnienie klasycznych badań cytogenetycznych płodu. Przeprowadzono retrospektywną analizę dokumentacji lekarskiej 2014 przypadków, w których wykonywano zabieg amniopunkcji w latach W omawianym okresie 14 lat zdiagnozowano w 116 przypadkach nieprawidłowe kariotypy (Tabela 2), natomiast w 29 przypadkach otwarte wady OUN [4]. W 13 przypadkach (0,64%) odnotowano powikłania wczesne pod postacią sączenia wód płodowych w okresie do dwóch tygodni po zabiegu amniopunkcji. W 2 przypadkach doszło do poronienia (0,099%). Wszystkie ciężarne, u których wystąpiły powyższe powikłania były hospitalizowane przez okres 1 2 tygodni. 11 ciężarnych po przeprowadzeniu rutynowych badań laboratoryjnych i badań USG potwierdzających prawidłową ilość wód płodowych w stanie dobrym wypisano do domu. We wszystkich w/w przypadkach poród odbył się o czasie. Stan noworodków po porodzie był dobry. Z kolei w 9 przypadkach (0,44%) odnotowano powikłania późne po zabiegu amniopunkcji (ponad dwa tygodnie od daty zabiegu, ale przed upływem 22 tygodnia ciąży). W 4 przypadkach (0,19%) odnotowano przedwczesne martwe urodzenie płodu po 22 tygodniu ciąży, którego przyczyną było przedwczesne odklejenie się łożyska oraz krwawienie. Przyjęliśmy war-

7 Tabela 1. W tabeli uwzględniono jedynie1990 przypadków dostatecznie dobrze udokumentowanych. W rzeczywistości wykonano 24 zabiegów amniopunkcji więcej. Tabela 2. Rok Ilość hodowli Ilość hodowli nieudanych Czas hodowli do uzyskania preparatu Wynik stand by dni 8 dni dni 9 dni dni 10 dni dni 10 dni dni 12 dni dni 14 dni dni 14 dni dni 14 dni (2%) 13 dni 15 dni (0,6%) 13 dni 15 dni (2%) 13 dni 15 dni (14%) dni 30 dni (7,5%) dni 45 dni (23%) dni 60 dni (18%) dni 60 dni Typ aberracji Liczba Udział % Aberracje liczbowe autosomów 45 38,8 Trisomia ,3 Trisomia ,2 Trisomia ,3 Markery chromosomowe 7 6 Aberracje strukturalne autosomów 52 44,8 Translokacje, delecje, addycje 22 18,9 Inwersje ,3 Inwersje ,6 Aberracje gonosomów 4 3,4 Liczbowe 3 2,6 Strukturalne 1 0,8 Poliploidie 2 1,7 Kariotypy mozaikowe 13 11,2 Mozaiki gonosomów 9 7,8 Mozaiki z translokacją 4 3,4 Razem 116 tość 1,27% jako odsetek powikłań związanych z zabiegiem amniopunkcji w tym odsetek 0,72% powikłań jako odsetek powikłań nie poddających się leczeniu. W 57 (2,83%) przypadkach wdrożono program PIDP kierując się względami natury psychologicznej. W 29 przypadkach (1,39%) pobrana próbka płynu owodniowego miała kolor inny niż słomkowo-opalizujący, krwisty 13 przypadków, brunatny 15 przypadków, zielonkawy 1 przypadek. W większości przypadków, w których uzyskano próbkę o barwie brunatnej zabieg amniopunkcji wykonywano po raz drugi lub trzeci. Poprzednie zabiegi wykonywano w innych ośrodkach odnosząc niepowodzenie w przeprowadzeniu badań cytogenetycznych. W żadnym przypadku o zmienionej barwie płynu owodniowego nie stwierdzono aberracji chromosomowej. Odnotowano 1 przypadek urodzenia o czasie martwego noworodka oraz 2 przypadki śmierci noworodków po porodzie o czasie, wśród ciężarnych objętych programem PIDP. Przypadki te nie pozostawały w związku przyczynowym z zabiegiem amniopunkcji. Nie wszystkie pacjentki objęte programem PIDP zgłosiły się po porodzie do poradni. Z tego powodu uzyskanie informacji dotyczących zakończenia ciąży i przebiegu porodu było możliwe jedynie w 437 przypadkach. Biorąc pod uwagę powyższe zdecydowano o przeprowadzeniu badań ankietowych. Badania ankietowe Ankiety z pytaniami dotyczącymi dalszego przebiegu ciąży, porodu i stanu dziecka po urodzeniu wysłano do losowo wy- 7

8 branych 1000 pacjentek. Odpowiedzi uzyskano od 461 respondentek. O powikłaniach wczesnych poinformowało nas 10 ankietowanych (2,2%), po odwołaniu się jednak do dokumentacji pozostającej w naszej dyspozycji, powikłania potwierdzono jedynie u 4 ciężarnych, co stanowi 0,8% przypadków. W 2 przypadkach (0,4%) doszło do utraty ciąży. Ponowne wykonanie amniopunkcji, w kolejnej ciąży akceptuje 92% ankietowanych. 8% badanych (34 przypadki) nie zaakceptowałaby ponownego badania. W tej grupie 65% respondentek nie akceptuje programu PIDP, bowiem weszły w wiek w którym zajście w ciąże jest niemożliwe lub mało prawdopodobne! 15% (5 ankietowanych) nie akceptuje diagnostyki przedurodzeniowej, bowiem realizacja procedury laboratoryjnej trwała zbyt długo, 15% (5 ankietownych) nie akceptuje diagnostyki bowiem wynik niepomyślny pozostawia je (zdaniem ankietowanych) w świetle obecnego prawa bez możliwości reakcji, 15% (5 kobiet) choć nie ma własnych złych doświadczeń, ale nie akceptuje badań ze względu na możliwość powikłań u dziecka. Jak wynika z badań ankietowych celowość przeprowadzenia badań przedurodzeniowych w 75% dostrzegły same zainteresowane, prosząc lekarzy położników lub lekarzy POZ o informacje o możliwościach diagnostycznych w tym zakresie, jedynie w 10% inicjatywa należała do lekarzy. W około 15% spotkały się z odmową uzyskania skierowania, w około 5% lekarz swą odmowę uzasadniał obawą o obciążenie kosztami diagnostyki rodzimej placówki, w 10% lekarz odmówił skierowania uzasadniając swe stanowisko wysokim ryzykiem zabiegu amniopunkcji dla ciężarnej i płodu, ale również własnymi przekonaniami etyczno-religijnymi. Dyskusja Od szeregu lat, program genetycznej diagnostyki przedurodzeniowej PIDP jest w wielu krajach Europy Zachodniej oraz w Czechach finansowany przez państwo. W Stanach Zjednoczonych program PIDP znalazł się w ofertach wielu firm ubezpieczeniowych, a nie skorzystanie przez lekarza z programu PIDP uważane jest za błąd lekarski i często fakt ten znajduje potwierdzenie w orzeczeniach sądu. W Polsce od początku powstania Kas Chorych, program PIDP został doceniony i uwzględniony w budżecie. Fakt ten tylko nieznacznie poprawił dostępność diagnostyki przedurodzeniowej w naszym kraju. Przyczyną tego stanu rzeczy jest przede wszystkim niezwykłe opóźnienie w powołaniu do życia specjalizacji z genetyki klinicznej, oraz trudnościami, na jakie natrafia prawidłowa realizacja programów nauczania genetyki klinicznej wśród studentów medycyny i medycyny laboratoryjnej. Osobnym problemem jest fakt, że diagnostyka PIDP w sposób nieuprawniony stała się przedmiotem zainteresowania prawicowych partii politycznych, które postanowiły do programu ściśle lekarskiego włączyć elementy ideologicznej indoktrynacji. W efekcie, w ostatnich latach odnotowaliśmy malejąca liczbę skierowań na diagnostykę PIDP, co przyniosło w efekcie zmniejszenie nakładów finansowych ze strony Kas Chorych. 8 Najnowszy francuski narodowy raport o realizacji programu diagnostyki przedurodzeniowej za lata [15], przynosi istotne zmiany w akademickim podejściu do wskazań lekarskich do diagnostyki PIDP. Podniesiono wiek ciężarnej do 38 lat w dniu pobrania próbki krwi, jako wiek uzasadniający wdrożenie programu. Na drugim i trzecim miejscu znalazły się odpowiednio: wyniki MSS (40% skierowań) świadczące o podwyższonym ryzyku (ryzyko 1/250), oraz ciężarne z nieprawidłowym obrazem ultrasonograficznym płodu (35% skierowań). Te doświadczenia lekarzy francuskich pokrywają się z naszymi obserwacjami. W okresie 15 lat realizacji programu PIDP wskaźnik WSWNK (wskazanie skutkujące wykryciem nieprawidłowego kariotypu) wyniósł 5,82%. Poddaliśmy analizie powyższy wskaźnik w latach , uwzględniając osobno: cezurę wieku ciężarnej (5,41%), wyników testów MSS (6,5%), wyników specjalistycznych badań USG (25%!). Uwzględniając rozkład wysokości wskaźnika WSWNK wśród ciężarnych, które nie ukończyły 35 roku życia w momencie badań, w przedziale wieku lat, oraz powyżej 38 roku życia, obserwuje się niemal trzykrotny wzrost wskaźnika wśród ciężarnych, które ukończyły 38 rok życia, w tych samych przedziałach wiekowych wysokość wskaźnika WSWNK uwzględniających wynik testów MSS, niemal trzykrotnie obniżył się. Niewielka liczba ciężarnych skierowanych po 38 roku życia ze względu na nieprawidłowy wynik USG uniemożliwiła wiarygodną analizę zjawiska. W naszym ośrodku w 40 przypadkach przeprowadzono diagnostykę interfazową FISH amniocytów na podstawie specjalnie sformułowanych wskazań [16]. Nieprawidłowości chromosomowe wykryto w 3 przypadkach, co stanowi o wysokim wskaźniku WSWNK (7,5%). Fakt wykrycia poliploidii w niehodowanych amniocytach [17], był pierwszym sygnałem o zagrożeniu zdrowia płodu. Program PIDP jest procedurą medyczną specjalnego typu. Najczęściej nie można jej powtórzyć w przypadku niepowodzenia laboratoryjnego. Niepowodzenie tego typu przynosi natychmiastowe negatywne skutki emocjonalno-psychologiczny dla ciężarnej i rodziny oraz odbija się na reputacji laboratorium. Stąd przywiązujemy tak dużą wagę do techniki pobrania materiału, warunków hodowli amniocytów, doświadczeniu w aplikacji technik prążkowych, technik cytogenetyki molekularnej oraz technik molekularnych [17,18]. Dane zawarte w Tab. 1, jednoznacznie przekonują, że warunki techniczne stworzone w laboratorium nie tolerują kompromisu z jakością. Temu celowi służy również wdrażany w naszym laboratorium system zarządzania przez jakość. W latach na ogólną liczbę 1187 amniopunkcji wykonanych dla celów programu PIDP tylko w jednym przypadku odnieśliśmy niepowodzenie <0,001% co jest wynikiem lepszym niż wyniki akceptowane we Francji 0,4 0,5% [15]. Z drugiej strony należy pamiętać, że liczba wykonywanych rocznie badań przez przeciętne francuskie laboratorium jest około 2 3 razy większa niż w przeciętnym polskim laboratorium, przy 2 3 razy mniejszym zatrudnieniu. Wbrew oczekiwaniom badania retrospektywne dokumentacji lekarskiej oraz badania ankietowe nie przyniosły istotnych rozbieżności, potwierdzając, że realizacja programu PIDP obarczona jest ryzykiem utraty ciąży mniejszym niż 1% [19,21]. Porównawcza analiza danych epidemiologicznych dotyczących województwa łódzkiego paradoksalnie wskazuje na kilkakrotnie mniejsze ryzyko utraty ciąży wśród ciężarnych włączonych do programu PIDP, w odniesieniu do ogólnej populacji ciężarnych. Dzieje się tak być może również dlatego, że kontakt ciężarnej z Poradnią Genetyczną jest bardzo często pierwszą okazją uzyskania informacji o szkodliwości palenia tytoniu, nadużywania alkoholu, używania narkotyków, uczestniczenia w sportach ekstremalnych (sportowe skoki ze spadochronem 1 przypadek). W Poradni Genetycznej, ciężarna dowiaduje się o konieczności zmiany stanowiska

9 pracy na mniej uciążliwe (co wsparte jest wydaniem odpowiedniej dokumentacji). W Poradni Genetycznej ciężarna zostaje niekiedy przekonana o celowości skorzystania z uzasadnionego zwolnienia lekarskiego. Omówione powyżej przewartościowanie częstości wskazań lekarskich do wdrożenia programu PIDP na korzyść badań przesiewowych (program MSS, badania ultrasonograficzne) będzie w najbliższych latach zyskiwało na popularności [22], będzie się również cieszyło poparciem decydentów finansujących diagnostykę przedurodzeniową. Liczba wskazań do wdrożenia programu PIDP będzie w najbliższych latach ulegać ograniczeniu, osiągając poziom liczby wskazań dobrze udokumentowanych. Istotnym będzie również postęp w realizacji programu zarządzania przez jakość, a w konsekwencji akredytacji laboratoriów wykonujących przesiewowe badania biochemiczne oraz pracowni ultrasonograficznych. Wydaje się, że w perspektywie 2 3 lat będzie możliwe przesunięcie cezury wieku ciężarnej stanowiącego wskazanie do kwalifikacji do programu PIDP na wiek 38 roku życia. Z punktu widzenia dalszych usprawnień technologicznych możliwych do zastosowania w realizacji programu PIDP Piśmiennictwo: 1. Milunsky A: Genetic Counseling: Preconception and as a Prelude to Prenatal Diagnosis. w: Genetic Disorders and The Fetus. The Johns Hopkins University Press, 1992: Martin RH, Ko E, Rademaker A: Distribution of aneuploidy in human gametes: comparison between human sperm and oocytes. Am J Med Genet, 1991; 39: Helszer Z, Jeziorowska A, Kałużewski B: Diagnostyka biochemiczna otwartych wad centralnego uk ladu nerwowego w płynie owodniowym. Diag Lab, 1977: Helszer Z, Lach J, Kałużewski B: Markery biochemiczne otwartych wad ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w płynie owodniowym. Medical Science Review, Midro AT, Stasiewicz-Jarocka B: Określenie prawdopodobieństwa urodzenia dziecka z niezrównoważonym kariotypem w rodzinach nosicieli translokacji chromosomowych wzajemnych. Część II. Analiza rodowodowa, grupy indywidualnego ryzyka genetycznego nosicieli translokacji chromosomowych wzajemnych. Diag Lab, 2001(Supl.1): Nussbaum RL et al: Prenatal Genetics w: Thompson&Thompson Genetics in Medicine. W. B. Saunders Company, 2001; Brzeziński ZJ: Choroby uwarunkowane genetycznie-spojrzenie epidemiologa. Medical Science Review, Mazurczak T: Poradnictwo genetyczne-czym jest i jakim być powinno. Medical Science Review, Kałużewski B, Perenc M: Prenatalna diagnostyka cytogenetyczna aberracji chromosomowych. Diag Lab, 1997; Supl.1: Kalousek D, Dill F, Patzar T i wsp: Confined chorionic mosaicism in prenatal diagnosis. Hum Genet, 1987; 77: Kałużewski B, Truszczak B, Zarzycki B: Analiza cytogenetyczna wspomagana komputerem. Diag Lab, 1997; Supl.1: Rooney DE: The cytogenetics of pregnancy. w: Human Cytogenetics: constitutional analysis. A Practical Approach. Oxford University Press. 2001; na uwagę zasługuje możliwość wykorzystania urządzeń automatycznie wykonujących porównawczą analizę DNA. Komercyjnie osiągalne urządzenia pozwalające na porównanie genetycznego zrównoważenia w 300 subregionach chromosomowych ludzkiego genomu, umożliwiają cytogenetyczną a właściwie molekularną diagnostykę przedurodzeniową w ciągu zaledwie 70 godzin. Jedyną barierą dla szerszego zastosowania tych urządzeń jest koszt aparatu oraz koszt testu. Wydaje się, że ta nowa sytuacja wygeneruje, przynajmniej w pierwszym okresie aplikacji, problemy interpretacyjne. Lekarz specjalista będąc pod presją ograniczonego czasu, jaki mu pozostanie do wydania odpowiedzialnego orzeczenia lekarskiego, będzie zmuszony do analizy kilku a być może kilkunastu informacji, trudnych do powtórnej weryfikacji. Powszechnie dostępny program diagnostyki przedurodzeniowej, stosowany przez odpowiednio długi okres czasu może w efekcie przynieść niezamierzony efekt w postaci zwiększenia liczby nosicieli chorób uwarunkowanych genetycznie. Interpretacja tego potencjalnego zagrożenia zmusza do stwierdzenia, że program diagnostyki przedurodzeniowej dedykowany jest zdrowiu i szczęściu indywidualnej rodziny, w mniejszym stopniu populacji jako takiej [6]. 13. Elias S, Simpson JL: Techniques for prenatal diagnosis. w: Emery and Rimoin s Principles and Practice of Medical Genetics. Churchill Livingstone, 2002; Constantinou M, Zając E, Kałużewski B: Chromosomal mosaicism on amniotic interphase nuclei detected by multiprobe FISH. J Appl Genet, 2003; 44(4): Dupont JM, Calres E: Three year national survey of prenatal cytogenetic activity In France E.C.A.- European Cytogenetics Association Newsletter, 2004; 13: Constantinou M, Kałużewski B: Kliniczne aplikacje technik cytogenetyki molekularnej w procesie diagnostyki prenatalnej wybranych przypadków aberracji chromosomowych. Medical Science Review, Constantinou M, Kałużewski B: Wykorzystanie techniki FISH w diagnostyce aberracji chromosomowych trudnych do zidentyfikowania z pomocą klasycznych technik cytogenetycznych. Diag Lab, 2001; Supl.1: Helszer Z, Kałużewski B, Constantinou M: Małe dodatkowe chromosomy markerowe (ESAC). Problemy diagnostyczne i znaczenie kliniczne. Diag Lab, 2001; Supl.1: Bocian E, Mazurczak T, Sosnowska K et al: Charakterystyka aberracji chromosomalnych rozpoznanych prenatalnie w rodzinach ryzyka genetycznego. Pol Tyg Lek, 1990; 45: Zaremba J, Pawłowska B, Ilnicka A i wsp: Badania prenatalne-próba oceny efektywności i ryzyka na podstawie materiału jednego ośrodka. Neurol Neurochir Pol, 1999; 33: Wysocka B, Iliszko M i wsp: Badania prenatalne w Akademii Medycznej w Gdańsku podsumowanie wyników pierwszych trzech lat badań ( ). Ann Acad Med Gedan, 2000; 30: Perenc M, Kałużewski B: Test potrójny jako badanie przesiewowe drugim trymestrze ciąży. Monitor Science Review,