Oznaczenie aktywności aminotransferazy alaninowej.

Transkrypt

1 Oznaczenie aktywności aminotransferazy alaninowej. Zajęcia 3 godzinne w parach, zajęcia 4 godzinne indywidualnie. Cel ćwiczenia Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z metodą oznaczenia aktywności aminotransferazy alaninowej, enzymu należącego do klasy transferaz, mającego istotne znaczenie w metabolizmie aminokwasów. Wprowadzenie Aminokwasy powstałe w wyniku degradacji białek u roślin np. w kiełkujących nasionach i u zwierząt (w wątrobie, w mięśniach) są poddawane reakcjom usunięcia grup α- aminowych. Grupy te są przenoszone na 2-oksoglutaran przez aminotransferazy, a powstający glutaminian jest dawcą grup aminowych do syntez i do cyklu mocznikowego zachodzącego w organizmach kręgowców. U roślin aminotransferazy są ważne dla przebiegu fotosyntezy u roślin typu C 4 i fotooddychania. Reakcje transaminacji polegają na przeniesieniu grupy aminowej wraz z protonem i parą elektronów z aminokwasu na węgiel karbonylowy najczęściej 2-oksokwasu. W wyniku reakcji substrat aminokwasowy staje się oksokwasem, a wchodzący w reakcję oksokwas - aminokwasem. Reakcje te są odwracalne, a ich kierunek zależy od względnego stężenia pary aminokwas 2-oksokwas. Aminotransferazy zazwyczaj katalizują reakcje transaminacji z udziałem kilku różnych par substratów (aminokwas + 2-oksokwas), a ta sama para substratów może uczestniczyć w reakcjach katalizowanych przez rożne aminotransferazy. Jednakże większość z tych enzymów wykazuje wyższą specyficzność w stosunku do 2-oksokwasu jako akceptora grupy aminowej, niż w stosunku do jej dawcy, jakim jest aminokwas. Aminotransferazy zwykle są białkami zbudowanymi z dwu, rzadziej z jednej podjednostki. Optimum ph dla większości poznanych aminotransferaz zawiera się w przedziale 7,0-9,0. Temperatura optymalna dla działania enzymu zależy od źródła pochodzenia enzymu i mieści się w zakresie ºC. Grupą czynną biorącą udział w reakcji transaminacji jest często silnie związany z białkiem kofaktor: 5`-fosforan pirydoksalu (pochodna pirydoksyny czyli witaminy B 6 ) (rys.1.). Aminotransferaza asparaginianowa i aminotransferaza alaninowa są ważnymi transaminazami w metabolizmie i roślin i zwierząt. Rys. 1. 5`-fosforan pirydoksalu 1

2 Aminotransferaza asparaginianowa (AspAT), nazwa systematyczna: aminotransferaza L- asparaginian: 2-oksoglutaran, EC ) katalizuje odwracalną reakcję transaminacji przedstawioną poniżej: Rys. 2. Reakcja transaminacji katalizowana przez aminotransferazę asparaginianową Aminotransferaza asparaginianowa uczestniczy w degradacji i syntezie aminokwasów. U roślin AspAT bierze udział w wewnątrzkomórkowym systemie wahadłowym przenoszącym wodory ze zredukowanych koenzymów oksydoreduktaz (NADH) między cytosolem a chloroplastami oraz w międzykomórkowym transporcie metabolitów podczas fotosyntezy u roślin typu C 4. Stężenie aminotransferaz w surowicy krwi ma znaczenie diagnostyczne. Prawidłowe stężenie aminotransferaz w surowicy jest małe, jednak enzymy te przechodzą do krwi na skutek uszkodzenia tkanek. Podwyższona aktywność AspAT świadczy o zawale mięśnia sercowego. Aminotransferaza alaninowa (AlaAT, nazwa systematyczna: aminotransferaza L- alanina: 2-oksoglutaran, EC ) katalizuje odwracalną reakcję przeniesienia grupy aminowej z L-alaniny na 2-oksoglutaran. Reakcja ta przebiega następująco: Rys. 3. Reakcja transaminacji katalizowana przez aminotransferazę alaninową AlaAT, podobnie, jak AspAT, bierze udział w wielu procesach metabolicznych (synteza i rozkład). U roślin aktywność enzymu wzrasta pod wpływem niekorzystnych czynników środowiska np. niedotlenienia. U ludzi podwyższony poziom aktywności AlaAT w surowicy jest bardziej swoistym wskaźnikiem uszkodzenia wątroby niż uszkodzenia mięśnia sercowego. 2

3 Metoda oznaczania aktywności aminotransferazy alaninowej z zastosowaniem sprzężonej reakcji enzymatycznej katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanową i NADH. Do oznaczania aktywności aminotransferazy alaninowej najczęściej wykorzystuje się metodę opisaną przez Wróblewskiego i Ladue a (1956) z jej późniejszą modyfikacją (Bergmeyer i Horder, 1980). W tej metodzie wykorzystuje się sprzężoną reakcję enzymatyczną przebiegającą z udziałem dehydrogenazy L-mleczanowej (EC ) oraz NADH do pomiaru ilości produktu 2-oksokwasu (pirogronianu) po zatrzymaniu reakcji transaminacji. Miarą aktywności aminotransferazy alaninowej jest ilość utworzonego pirogronianu oznaczonego za pośrednictwem dehydrogenazy mleczanowej przebiegającej zgodnie z przedstawioną reakcją (Rys. 4): Rys. 4. Reakcja z udziałem dehydrogenazy L-mleczanowej oraz pirogronianiu W warunkach ćwiczenia równowaga tej odwracalnej reakcji, jest przesunięta w prawo (Rys. 4.) i przy nadmiarze NADH przebiega aż do momentu zużycia pirogronianu utworzonego w reakcji transaminacji. Szybkość utlenienia NADH i jego przemiana w NAD + (Rys. 5) może być zmierzona fotometrycznie. Zarówno NADH jak i NAD + wykazują silną absorbancję przy długości fali 260 nm (Rys. 6). Z kolei NADH wykazuje silną absorbancję przy długości fali 340 nm na skutek obecności układu dihydropirydyny, której nie wykazuje utleniona postać koenzymu (NAD + ). Oznacza to, że na podstawie pomiaru spadku absorbancji przy długości fali 340 nm, po odjęciu spadku dla prób kontrolnych, możemy wnioskować bezpośrednio o ilości pirogronianu, który uległ redukcji do L-mleczanu, a pośrednio także o aktywności AlaAT. Rys. 5. Krzywe absorpcji dla NADH i NAD + Rys. 6. Reakcja utlenienia i redukcji nukleotydu nikotynamidoadeninowego. 3

4 Odczynniki 1. Mieszanina alaniny i 2-oksoglutaranu w 0,2M buforze fosforanowm o ph 7, % Kwas trójchlorooctowy 3. 0,1 mm NADH w 0,4- M buforze Tris-HCl, ph 8,0. 4. Dehydrogenaza L-mleczanowa w 2M siarczanie amonowym o ph 7, ,2-molowy bufor fosforanowy o ph 7,4. Wykonanie Ćwiczenie wykonywane jest indywidualnie na zajęciach 4 godzinnych i parami na zajęciach 3 godzinnych. 1. Oznaczanie aktywności aminotransferazy alaninowej. Reakcję prowadzi się w temperaturze 30 o C w ph 7,4 przez 30 minut. Wyciąg enzymu otrzymany w kolbce na 10 ml uzupełnić wodą do kreski i dokładnie wymieszać. Do trzech 1,5 ml probówek Eppendorfa (2 próby pełne i 1 ślepa) dodać 0,5 ml mieszaniny alaniny i 2-oksoglutaranu (1), probówki wstawić do łaźni wodnej o temp. 30 o C i po 5 min do prób pełnych odmierzyć 0,5 ml wyciągu enzymu z kolbki miarowej. Zawartość szybko wymieszać i wstawić do łaźni wodnej na 30 min. Po tym czasie do wszystkich probówek dodać po 0,5 ml 4% kwasu trójchlorooctowego (2), a następnie do próby ślepej 0,5 ml wyciągu enzymowego. Zawartość każdej probówki dokładnie wymieszać i odwirować w wirówce przez 5 minut. Następnie z każdej probówki przenieść po 0,5 ml klarownego płynu znad osadu do kolejnych trzech mikrokuwet (1,5 ml), wcześniej umytych woda destylowaną, dodać do każdej 1 ml roztworu NADH (3) i wymieszać zawartość kuwet zatykając je parafilmem. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 340 nm, w fotometrze ustawionym na zero wobec wody destylowanej we wszystkich 3 kuwetach. Wyniki zanotować. Następnie do każdej mikrokuwety dodać po 10 µl dehydrogenazy L-mleczanowej (4), próby wymieszać i po 10 min zmierzyć i zapisać ich absorbancję. Po zakończeniu pomiarów kuwety przepłukać woda destylowaną. Obliczenie aktywności 1. Obliczyć różnice absorbancji dla każdej z trzech prób przed dodaniem dehydrogenazy mleczanowej i po dodaniu. Odjąć od uśrednionego wyniku prób pełnych wynik próby ślepej. 2. Obliczyć całkowitą ilość µmoli mleczanu powstałą z równoważnej ilości pirogronianu w ciągu 30 min dzieląc obliczoną różnicę absorbancji przez milimolowy współczynnik absorpcji światła dla NADH przy długości fali 340 nm, wynoszący 6, Aktywność aminotransferazy alaninowej wyrazić w μmolach produktu na 1 min na 1 g siewek pszenicy [μmole pirogronianu min. -1 g -1 siewek] uwzględniając: a. schemat rozcieńczeń podany przez prowadzącego b. czas trwania reakcji enzymatycznej Przykład obliczeń: Próby pełne ΔA 1 = ΔA 2 = Śr ΔA = Próba ślepa ΔA k = Spadek absorbancji ( A 340 )

5 Korzystamy ze wzoru: A 340 x 1,51 ml x 1,5 ml / 6,22 x 1 cm x 0,5 ml A 340 spadek absorbancji 1,51 ml objętość mieszaniny w kuwecie 1,5 ml objętość mieszaniny reakcyjnej po przerwaniu reakcji transaminacji 6,22 - współczynnik milimolowy absorbancji dla NADH, 1 cm szerokość kuwety, 0,5 ml - objętość użyta do pomiaru stężenia pirogronianu po przerwaniu reakcji transaminacji Podstawiając dane do wzoru otrzymujemy 0,020 μmola pirogronianu dla 0,5 ml rozcieńczonego do 10 ml wyciągu enzymu. Zatem aktywność aminotransferazy alaninowej w 10 ml zadania kontrolnego wynosi 0,400 μmola pirogronianu. Wiedząc, że przed rozcieńczeniem do objętości 10 ml kolbka zawierała 1 ml wyciągu przygotowanego przez homogenizację 1,5 g siewek pszenicy w 100 ml buforu możemy obliczyć aktywność aminotransferazy alaninowej uwzględniając schemat rozcieńczeń. 0,400 μmola pirogronianu x 100 = 40,00 μmoli pirogronianu w 100 ml homogenatu Przeliczając na 1 gram siewek: 40 μmoli pirogronianu/ 1,5 g = 26,667 μmoli pirogronianu x g -1 Po uwzględnieniu czasu reakcji 26,667 μmoli pirogronianu x g -1 / 30 minut co odpowiada 0,889 μmoli pirogronianu x g -1 x min -1. Pytania. 1. Jaką rolę w metabolizmie pełni aminotransferaza alaninowa? 2. Podać wzór i pełną nazwę koenzymu współdziałającego z aminotransferazami. Pochodną której witaminy jest ten koenzym? 3. Który z 2-oksokwasów jest najczęściej akceptorem grup aminowych w reakcjach transaminacji? Napisać wzór tego 2-oksokwasu i jego pochodnej L-aminokwasowej. 4. W jakich jednostkach wyraża się aktywność aminotransferazy alaninowej w metodzie stosowanej na ćwiczeniu? Literatura. 1. Wróblewski, F., Ladue, J.S. Serum Glutamic Pyruvic Transaminase in Cardiac and Hepatic Disease, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 91, 569 (1956). 2. Bergmeyer, H.U., and Horder, M. IFCC Methods for the Measurement of Catalytic Concentration of Enzymes, Part 3 IFCC Method For Alanine Aminotransferase, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 18, 521 (1980). 5