Wyznaczanie krzywej progresji reakcji i obliczenie szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez β-fruktofuranozydazy

Transkrypt

1 Wyznaczanie krzywej progresji reakcji i obliczenie szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez β-fruktofuranozydazy W organizmach żywych reakcje chemiczne rzadko zachodzą w nieobecności katalizatora. Katalizatorami są przede wszystkim swoiste białka zwane enzymami. ierwszym etapem katalizy enzymatycznej jest utworzenie kompleksu enzym substrat. ubstrat ulega związaniu w specyficznym regionie cząsteczki enzymu, zwanym miejscem (centrum) aktywnym i w kompleksie z enzymem przekształca się w produkt reakcji. W następnym etapie kompleks rozpada się na wolny enzym i cząsteczkę lub cząsteczki produktów. Najprostszy zapis każdej reakcji enzymatycznej jest zatem następujący: E E E E oczątkowa szybkość v reakcji enzymatycznych i aktywność enzymu oczątkową szybkość reakcji katalizowanej przez enzym przyjęto za miarę jego aktywności. Wylicza się ją z tzw. krzywej progresji. Krzywa ta ujmuje zależność ilości przetworzonego substratu (ubytek substratu Δ[]) lub też powstałego w reakcji produktu (Δ[]) od czasu jej trwania: [] = f(τ) lub [] = f(τ). Krzywa progresji obrazuje przebieg reakcji enzymatycznej w obecności enzymu o stałym stężeniu ([E] = const.) i przy wybranym początkowym stężeniu substratu ([ ] = const.) Wykres. Zależność czasu reakcji od początkowego stężenia substratu - τ = f([ ]) (krzywa ) oraz czasu reakcji od początkowego stężenia produktu - τ =f([ ]) (krzywa ) oczątkowa szybkość reakcji v równa jest tangensowi kąta α i można ją obliczyć z podanych poniżej wzorów:

2 v v lub v tg Gdzie,, i oznaczają stężenia substratu, a,, i - stężenia produktu po odpowiednich czasach reakcji (τ, τ, τ, τ ). zybkość reakcji wyliczona z powyższych równań ma stałą wartość: v k tylko w odpowiednio krótkim przedziale czasu (od τ do τ x, w podanym przykładzie τ = τ ). Krzywa progresji jest wówczas linią prostą, a reakcja ma charakter reakcji zerowego rzędu. zybkość początkowa reakcji odpowiada zatem tg kąta nachylenia w punkcie do krzywej progresji [] = f(τ) lub [] = f(τ). o dłuższym czasie trwania reakcji przyrost produktów reakcji Δ[] bądź ubytek substratu Δ[] przestaje być wprost proporcjonalny czasu jej trwania (tzn. krzywa progresji przestaje być funkcją liniową) i szybkość reakcji zmniejsza się. zybkość reakcji enzymatycznej w warunkach, w których przebiega ona według zerowego rzędu reakcji nazywa się szybkością początkową - v. zybkość początkowa reakcji enzymatycznej stanowi podstawę do oceny aktywności enzymu i badania jego właściwości kinetycznych. Z tego względu prawidłowe ustalenie wartości początkowej szybkości reakcji katalizowanej przez enzym jest bardzo ważne. Z kolei aktywność enzymu pośrednio określa jego stężenie w danym materiale biologicznym lub nieczyszczonym do homogenności preparacie enzymatycznym. tężenia enzymu w badanym materiale nie wyraża się z reguły w jednostkach wagowych, np. g L - lub g kg -, ponieważ wymagałoby to izolacji i oczyszczenia białka enzymatycznego, co jest na ogół bardzo pracochłonne, gdyż większość materiałów lub aktywnych preparatów enzymatycznych zawiera szereg innych substancji, w tym różnych białek. Aktywność enzymu określa się zwykle jako ilościowy przyrost produktów w odniesieniu do czasu reakcji katalizowanej przez enzym. W oznaczeniu stężenia produktów reakcji wykorzystuje się metody chemiczne, fizyczne i enzymatyczne. tężenie produktów wyraża się w tradycyjnych jednostkach [μm, Mm, μg cm -, mg cm -, itp.]. Według zaleceń Komisji Enzymowej z roku 964 jednostką standardową enzymu, oznaczaną symbolem J (ang. U), jest ta ilość enzymu, która katalizuje przemianę μmola substratu w ciągu minuty w standardowych warunkach reakcji przy stężeniu substratu gwarantującym maksymalna szybkość reakcji. Mianem jednostki standardowej aktywności enzymu jest więc [μmol min - ]. W roku 97 Komitet Enzymowy wprowadził zmiany w definicji jednostki aktywności enzymatycznej. Jednostką aktywności enzymatycznej jest ta aktywność (ilość lub wielkość aktywności), która przekształca mol substratu w czasie sekundy. Tę jednostkę nazwano katalem (kat.). Mianem katala jest mol s -. Obie jednostki wykorzystywane są w enzymologii równie często. Aby oznaczyć aktywność enzymu, inkubuje się jego roztwór przez określony czas z roztworem substratu w określonej temperaturze, a następnie przerywa reakcję (zwykle denaturując

3 enzym termicznie lub chemicznie) i ilościowo oznacza przyrost produktów reakcji (czasem ubytek substratu). Enzymatyczna hydroliza β-fruktofuranozydów Badania kinetyczne będą wykonywane na przykładzie reakcji katalizowanej przez β-fruktoforanozydazę (fruktohydrolaza β-d-fruktofuranozydów, EC...6). Enzym ten należy do klasy hydrolaz i podklasy hydrolaz glikozydowych. β-fruktoforanozydaza katalizuje hydrolityczny rozkład wiązania glikozydowego pomiędzy anomerycznym atomem węgla reszty β-d-fruktofuranozy i anomerycznym atomem węgla reszty α-d-glukopiranozy w β-d-fruktofuranozydach, takich jak sacharoza i rafinoza. Niektóre β-fruktoforanozydazy rozkładają także inulinę, która jest polimerem fruktozy o charakterze β-,-d-fruktanu. W wyniku hydrolizy sacharozy powstaje cząsteczka glukozy i cząsteczka fruktozy. onieważ sacharoza jest cukrem nieredukującym, a produkty jej hydrolizy (glukoza i fruktoza) to cukry redukujące, aktywność β-fruktoforanozydazy można obliczyć przez pomiar cukrów redukujących, uwolnionych w trakcie reakcji katalizowanej przez ten enzym. Często β-fruktoforanozydaza nazywana jest sacharazą albo inwertazą. Nazwa sacharaza pochodzi od nazwy substratu sacharozy, natomiast inwertaza od towarzyszącej działaniu enzymu zmiany kąta skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego. Roztwór sacharozy skręca tę płaszczyznę w prawo, natomiast mieszanina glukozy i fruktozy, tzw. cukier inwertowany w lewo. Bogatym źródłem β-fruktoforanozydazy są drożdże piekarskie. Zasada oznaczania aktywności β-fruktoforanozydazy W celu zaobserwowania przebiegu hydrolizy sacharozy pod działaniem β- fruktoforanozydazy wykorzystuje się metody pozwalające na pomiar przyrostu stężenia cukrów redukujących uwalnianych z substratu przez enzym. ą to między innymi metody: Fehlinga, omogyi - Nelsona, oraz Hagedorna Jensena, w których stężenia cukrów redukujących oznacza się na podstawie ilości Cu O powstającego na skutek redukcji jonów miedziowych przez wolne grupy redukujące cukrów, oraz metoda Millera z kwasem,5 - dinitrosalicylowym (DN) stosowana w niniejszym ćwiczeniu. W metodzie Millera aktywność enzymu oznacza się mierząc przyrost cukrów redukujących uwolnionych w czasie reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez β-fruktoforanozydazę przebiegającej w przyjętych warunkach temperatury i ph. Cukry te oznacza się ilościowo stosując alkaliczny roztwór kwasu,5 -dinitrosalicylowego (DN). W analogiczny sposób można oznaczyć aktywność dowolnej hydrolazy glikozydowej, stosując

4 odpowiedni dla niej substrat. DN nie tylko umożliwia oznaczenie stężenia cukrów redukujących, ale także pełni rolę inaktywatora enzymu, hamującego katalizowaną przez niego reakcję. W środowisku alkalicznym i w temperaturze C DN ulega redukcji pod działaniem cukrów redukujących, dając pochodną aminową, zabarwioną w środowisku alkalicznym na kolor pomarańczowy. Natężenie barwy, o maksimum absorbancji przy długości fali λ = 54 nm, jest proporcjonalne do stężenia cukrów redukujących w badanym roztworze. tężenie cukrów redukujących w próbie odczytuje się z krzywej wzorcowej A 54 = f(c glukozy ), przygotowanej w warunkach oznaczenia. Wykres. Krzywa wzorcowa. Zależność absorbancji przy λ = 54 nm od stężenia glukozy - A 54 = f(c glukozy ) Obliczanie aktywności enzymu rzyrost stężenia cukrów redukujących w mieszaninie reakcyjnej oblicza się na podstawie różnicy absorbancję próby właściwej i kontrolnej: A A wlasc A 54. kontr. Aktywność preparatu enzymu (A) oblicza się ze wzoru: [ molsubstr c[ mol ml ] A ],5 min. mg [min.] [ E][ mg ml ] enzymu Współczynnik,5 we wzorze wynika z tego, że hydroliza cząsteczki sacharozy daje dwie cząsteczki cukrów redukujących. c stężenie cukrów redukujących w pierwotnej mieszaninie reakcyjnej w [µmol/ml] (Masa molowa glukozy: 8,6 g/mol) [E] ilość enzymu w pierwotnej mieszaninie reakcyjnej w [mg/ml] t czas reakcji w minutach

5 mol Uzyskany wynik, podany w [ min. mg ], czyli jednostkach standardowych w przeliczeniu na mg preparatu β-fruktofuranozydazy, należy wyrazić także w katalach [mol s - ] w odniesieniu do tej samej ilości preparatu. Literatura: tryer L., Biochemia, WN, Withers G, Mechanisms of glycosyl transferases and hydrolases, Carbohydr olym 44: 5-7, Miller G.L.; Use of dinitriosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem.,, 46 48, 959 ODCZYNNIKI-MATERIAŁY-RZĘT preparat β-fruktofuranozydazy z drożdży (inwertazy) (,5 mg/ml) 5 mm roztwór sacharozy w, M buforze sodowo-octanowym o ph 4,7 % alkaliczny roztwór kwasu,5 -dinitrosalicylowego (DN) woda destylowana pipety drożdże aceton probówki termoblok stoper spektrofotometr ROCEDURY Izolowanie β-fruktofuranozydazy z drożdży. Naważkę,5 g drożdży piekarskich dokładnie rozetrzeć w moździerzu z,5 g piasku. Dodać 5 ml wody i rozcierać dalej do otrzymania homogennej konsystencji.. Dodać jeszcze 5 ml wody i po wymieszaniu przelać homogenat do probówki wirówkowej na 5 ml. Moździerz przepłukać dodatkowo 5 ml wody i połączyć wodę z homogenatem znajdującym się w probówce.. robówki wirówkowe zrównoważyć parami po czym wirować homogenat przez 5 min przy szybkości 4 x g. 4. o odwirowaniu znajdujący się nad osadem supernatant ostrożnie przelać do cylinderka i zmierzyć objętość. 5. rzenieść preparat do probówki wirówkowej na 5 ml i dodać 5-krotną objętość zimnego acetonu. Aceton należy dodawać powoli, mieszając zawartość probówki. 6. o 5 min odwirować wytrącone białka z szybkością x g. 7. upernatant ostrożnie przelać do pojemnika na zlewki acetonowe, a osad rozpuścić w ml wody.

6 rzygotowanie prób właściwych. Do dwóch ciągów po 6 probówek odmierzyć po,5 ml 5 mm roztworu sacharozy (oznaczenia będą wykonywane w dwóch powtórzeniach).. Dodać do każdej z probówek po,5 ml roztworu enzymu (postarać się aby do wszystkich probówek dodać enzym w tym samym czasie).. Tak przygotowane mieszaniny reakcyjne inkubować w temperaturze pokojowej w ciągu,5; ; ; ; 4 i 5 minut 4. o upływie kolejnych czasów reakcji przerwać hydrolizę sacharozy w dwóch probówkach poprzez dodanie do każdej probówki po,5 ml roztworu DN. 5. Zawartość probówek dokładnie wymieszać i inkubować w ciągu 5 minut w termobloku C. 6. o inkubacji probówki schłodzić pod bieżącą wodą do temperatury pokojowej, następnie z każdej probówki przenieść po, ml mieszaniny reakcyjnej do nowych probówek. 7. Dodać do każdej po,4 ml wody destylowanej i zmierzyć absorbancję otrzymanych mieszanin dla λ = 54 nm (A 54 ) wobec próby odczynnikowej. rzygotowanie próby kontrolnej. Do,5 ml roztworu enzymu dodać,5 ml roztworu DN, a następnie,5 ml 5 mm roztworu sacharozy (dokładnie w takiej kolejności).. Zawartość wymieszać i inkubować w ciągu 5 minut w termobloku C.. o 5 minutach probówkę schłodzić pod bieżącą wodą do temperatury pokojowej, przenieść z niej, ml mieszaniny do nowej probówki i dodać,4 ml wody destylowanej. 4. Zmierzyć absorbancję próby dla λ = 54 nm (A 54 ) wobec próby odczynnikowej. rzygotowanie próby odczynnikowej. Do,5 ml wody destylowanej dodać,5 ml roztworu DN. Zawartość wymieszać i inkubować w ciągu 5 minut w termobloku C.. o schłodzeniu probówki do temperatury pokojowej, przenieść z niej, ml mieszaniny do nowej probówki i dodać do niej,4 ml wody destylowanej i otrzymany roztwór zastosować do kalibracji spektrofotometru. Opracowanie wyników. Obliczyć ΔA 54 i na jej podstawie obliczyć przyrost stężenia cukrów redukujących uwolnionych w różnym czasie reakcji.. Wykonać wykres zależności ilości uwolnionych cukrów redukujących (glukozy) od czasu reakcji [] = f(t reakcji ) i obliczyć wartość początkowej szybkości reakcji (v ).. Obliczyć aktywność preparatu β-fruktofuranozydazy.