Autoreferat dr Marta Libik-Konieczny

Transkrypt

1 załącznik 3 INSTYTUT FIZJOLOGII ROŚLIN im. FRANCISZKA GÓRSKIEGO POLSKIEJ AKADEMII NAUK W KRAKOWIE Autoreferat dr Marta Libik-Konieczny Kraków, kwiecień 2015

2 I. Imię i Nazwisko: Marta Libik-Konieczny II. Wykształcenie oraz posiadane dyplomy i stopnie naukowe: 1988; matura w I Liceum Ogólnokształcącym im. B. Nowodworskiego w Krakowie ; pięcioletnie studia magisterskie na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie, kierunek biologia. 1994; stopień magistra biologii. Obrona pracy magisterskiej pod tytułem: Izolowanie gametofitów żeńskich u wybranych gatunków Angiospermae Promotor: prof. dr hab. Lesław Przywara. Zakład Cytologii i Embriologii Roślin, Instytut Botaniki, Uniwersytet Jagielloński. 1999; stopień doktora nauk biologicznych w zakresie biologii na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi na podstawie rozprawy doktorskiej pod tytułem Charakterystyka biochemiczna, lokalizacja i funkcje białka wiążącego wapń-kalretikuliny w kulturach in vitro Daucus carota L. Promotor: prof. dr hab. Lesław Przywara. Zakład Cytologii i Embriologii Roślin, Instytut Botaniki, Uniwersytet Jagielloński. Recenzenci: prof. dr hab. Elżbieta Bednarska, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu; prof. dr hab. Stanisław Więckowski Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński III. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych: ; słuchaczka Środowiskowego Studium Doktoranckiego, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Jagiellońskiego ; asystent w Zakładzie Cytologii i Embriologii Roślin, Instytut Botaniki Uniwersytetu Jagiellońskiego ; biolog w Instytucie Fizjologii Roślin im. F. Górskiego, Polska Akademia Nauk obecnie; adiunkt w Instytucie Fizjologii Roślin im. F. Górskiego, Polska Akademia Nauk. IV. Wskazanie osiągnięcia naukowego wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): Tytuł osiągnięcia naukowego: 1

3 Moje osiągnięcie naukowe, będące podstawą złożonego wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego, stanowi monotematyczny cykl 4 publikacji przedstawionych pod wspólnym tytułem: Udział nadtlenku wodoru i wybranych elementów systemu antyoksydacyjnego w procesie morfogenezy w kulturach in vitro Mesembryanthemum crystallinum L. V. Wykaz publikacji* wchodzących w skład osiągnięcia naukowego art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): 1. Libik M *, Konieczny R, Pater B, Ślesak I, Miszalski Z. (2005) Differences in the activities of some antioxidant enzymes and in H 2 O 2 content during rhizogenesis and somatic embryogenesis in callus cultures of the ice plant. PLANT CELL REPORTS 23: (IF: ; MNiSW: 35 pkt) Mój udział procentowy szacuję na 70%. 2. Libik-Konieczny M *, Konieczny R, Surówka E, Ślesak I, Michalec Ż, Rozpądek P, Miszalski Z. (2012) Pathways of ROS homeostasis regulation in Mesembryanthemum crystallinum L. calli exhibiting differences in rhizogenesis. PLANT CELL TISSUE AND ORGAN CULTURE 110: (IF: ; MNiSW: 30 pkt) Mój udział procentowy szacuję na 65%. 3. Konieczny R, Banaś AK, Surówka E, Michalec Ż, Miszalski Z, Libik-Konieczny M *. (2014) Pattern of antioxidant enzyme activities and hydrogen peroxide content during developmental stages of rhizogenesis from hypocotyl explants of Mesembryanthemum crystallinum L. PLANT CELL REPORTS 33: (IF: ; MNiSW: 35 pkt) Mój udział procentowy szacuję na 60%. 4. Libik-Konieczny M *, Kozieradzka-Kiszkurno M, Desel Ch, Michalec-Warzecha Ż, Miszalski Z, Konieczny R. (2015) The localization of NADPH oxidase and reactive oxygen species in in vitrocultured Mesembryanthemum crystallinum L. hypocotyls discloses their differing roles in rhizogenesis. PROTOPLASMA 252: (IF: ; MNiSW: 30 pkt) Mój udział procentowy szacuję na 65% 2

4 Sumarycznie: IF = ; pkt. wg wykazu MNiSW = 130 * autor korespondencyjny - oświadczenia wszystkich współautorów, określające indywidualny wkład każdego z nich w powstanie danej publikacji przedstawiono w załączniku 6 VI. Omówienie celu naukowego prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania: 1. Wprowadzenie Metody hodowli in vitro stanowią nie tylko podstawowe narzędzie biotechnologiczne wykorzystywane między innymi do mikrorozmnażania, selekcji nowych odmian czy też produkcji biomasy i substancji bioaktywnych na skalę przemysłową. Techniki te są również stosowane w badaniach podstawowych nad fizjologią wzrostu i rozwoju roślin, ze względu na możliwość przeprowadzenia analiz procesów zachodzących w kontrolowanych warunkach, bez udziału mechanizmów działających na poziomie całej rośliny. Podstawą technik in vitro jest ujawnienie się w warunkach hodowli zjawiska totipotencji czyli nieograniczonej zdolności komórek roślinnych do podziału, a następnie odtwarzania (regeneracji) poszczególnych organów i w konsekwencji całego organizmu. Proces morfogenezy in vitro może przebiegać na szlaku prowadzącym do formowania organów (organogeneza) takich jak: pędy (kaulogeneza) czy korzenie (ryzogeneza) lub zarodków somatycznych (embriogeneza somatyczna). Formowanie nowych organów in vitro może odbywać się na drodze bezpośredniej z wyłożonych na pożywce fragmentów rośliny (eksplantat) bądź z zawiesiny komórek lub izolowanych protoplastów. Z kolei organogeneza pośrednia, zawiera etap przejściowy w postaci wytworzenia tkanki kalusowej (kalogeneza), w której następnie tworzą się centra komórek merystematycznych, dające początek nowym organom. Niezależnie od sposobu powstawania i rodzaju formowanych organów w przebiegu morfogenezy in vitro wyróżnia się kilka etapów. Według modelu opracowanego przez Christianson i Warnick (1985) pierwszą fazą jest ujawnienie kompetencji lub uzyskanie kompetencji przez komórkę bądź grupę komórek eksplantatu do odbierania i reagowania na sygnał w postaci różnych czynników stosowanych w kulturach in vitro. W kolejnym etapie następuje indukcja rozwoju komórki kompetentnej w określonym kierunku rozwojowym. Ukierunkowanie rozwoju lub inaczej determinacja wynika z ekspresji specyficznych dla organów genów, odpowiedzialnych za realizację danego programu rozwojowego. Uruchomienie odpowiednich genów pozwala na kontynuowanie procesu rozwojowego niezależnie od czynników indukujących. Ostatnią fazą procesu morfogenezy jest 3

5 różnicowanie komórek i powstanie wyspecjalizowanych strukturalnie i funkcjonalnie tkanek danego organu. W zdecydowanej większości z danej kompetentnej komórki lub grupy kompetentnych komórek możliwe jest powstanie tylko jednego typu organu. Efektywność procesu morfogenezy uwarunkowana jest wieloma czynnikami endogennymi m.in. genotypem rośliny i jej stanem fizjologicznym, jednakże znaczącą rolę w indukcji tworzenia nowych organów odgrywają czynniki egzogenne. Istotną rolę w przebiegu morfogenezy in vitro odgrywają roślinne regulatory wzrostu (fitohormony), które decydują o uzyskaniu przez komórkę kompetencji oraz wpływają na wydajność procesu morfogenezy. W dużym stopniu o indukcji danego szlaku rozwojowego i regeneracji odpowiedniego typu organu decyduje odpowiednia proporcja między stężeniami egzogennych fitohormonów takich jak auksyny i cytokininy: wyższe stężenie auksyn w stosunku do cytokinin prowadzi do indukcji procesu ryzogenezy, a odwrotne proporcje między wymienionymi grupami fitohormonów powodują indukcję morfogenezy na drodze kaulogenezy, natomiast porównywalne stężenia auksyn i cytokinin w pożywce indukują kalogenezę (Skoog i Miller 1957). Niewątpliwie ważny udział fitohormonów w indukcji morfogenezy nie jest jedynym czynnikiem egzogennym wpływającym na potencjał morfogeniczny eksplantatu. Wiele badań eksperymentalnych wykazało istotną rolę różnych typów stresorów (stres osmotyczny, stres temperaturowy, stres mechaniczny, stres hipoksji, stres metali ciężkich., stres związany ze zmianami ph pożywki, stres wywołany promieniowaniem UV) w indukcji nowych szlaków rozwojowych (Potters i in. 2007). Wspólną reakcją komórek roślinnych na działanie różnych czynników stresowych jest nadprodukcja reaktywnych form tlenu (RFT). Reaktywne formy tlenu są produktami niepełnej redukcji cząsteczki tlenu i powstają w chloroplastach, peroksysomach i mitochondriach, ale również w retikulum endoplazmatycznym, w błonie komórkowej, w cytoplazmie i apoplaście, jako uboczny produkt metabolizmu tlenowego. Do podstawowych RFT zaliczamy cząsteczki o charakterze rodnikowym takie jak: anionorodnik ponadtlenkowy (O - 2 ) czy też rodnik hydroksylowy ( OH), ale także nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) i tlen singletowy ( 1 O 2 ), które nie są wolnymi rodnikami (Bartosz 2006). Wysokie stężenie RFT w komórkach wpływa negatywnie na elementy strukturalne komórki prowadząc do ich utlenienia i degradacji, a w konsekwencji do śmierci komórek i całego organizmu. Dlatego też konieczne jest funkcjonowanie obok procesów w których powstają RFT, systemu odpowiedzialnego za usuwanie nadmiaru RFT i utrzymanie homeostazy redoks. W komórkach roślinnych system antyoksydacyjny obejmuje drobnocząsteczkowe związki antyutleniające i enzymy antyoksydacyjne. Każdy przedział komórkowy zawiera własną pulę antyoksydantów, a dla każdego z rodzajów RFT istnieje kilka sposobów jego dezaktywacji (Gechev i in. 2006). Brak równowagi pomiędzy generacją RFT, a zdolnościami antyoksydacyjnymi organizmu określa się, jako stres oksydacyjny. Do najważniejszych enzymatycznych elementów systemu antyoksydacyjnego, zabezpieczającego 4

6 komórki roślinne przed stresem oksydacyjnym należą: dysmutazy ponadtlenkowe (SOD), katalazy (KAT), peroksydazy (POD). SOD są jedynymi enzymami roślinnymi, które mogą usuwać O - 2. Istnieje kilka form SOD, które różnią się rodzajem metalu przejściowego: Cu/ZnSOD, MnSOD, FeSOD oraz lokalizacją w komórce: Cu/ZnSOD występuje w chloroplastach i cytozolu, MnSOD w mitochondriach i peroksysomach, a FeSOD w chloroplastach (Halliwell 2006). KAT rozkładają nadtlenek wodoru bez udziału dodatkowych reduktorów i występują w największych ilościach w peroksysomach, a także na terenie mitochondriów i chloroplastów. POD rozkładają nadtlenek wodoru przy udziale reduktora takiego jak między innymi askorbinian (peroksydaza askorbinianowa) lub glutation (peroksydaza glutationowa) i działają na terenie chloroplastów, mitochondriów, peroksysomów, retikulum endoplazmatyczengp, cytozolu, a także apoplastu. W przypadku działania czynników stresowych na komórki bardzo często dochodzi do zaburzenia metabolizmu i podwyższenia produkcji RFT na skutek niewystarczającej aktywności elementów systemu antyoksydacyjnego. Dochodzi wtedy do uruchomienia mechanizmów sygnałowych odpowiadających za inicjację odpowiedzi związanej z aklimatyzacją komórek do zmienionych warunków (Bohnert i Sheveleva 1998, Gechev i in. 2006). W ostatnim dziesięcioleciu coraz powszechniej podkreśla się rolę RFT jako cząsteczek sygnałowych uruchamiających różnorodne procesy fizjologiczne roślin w odpowiedzi na indukowany czynnikami abiotycznymi i biotycznymi stres oksydacyjny (Gapper i Dolan 2006). Początkowo główną funkcję sygnałową przypisywano H 2 O 2 z uwagi na dużą stabilność tej cząsteczki i większy zasięg działania dzięki zdolność przenikania przez błony komórkowe. Jednakże, doświadczenia prowadzone w ostatnich latach wykazały, że w systemach transdukcji sygnału biorą również udział: anionorodnik ponadtlenkowy oraz tlen singletowy (Gechev i in. 2006). Regulacyjna rola RFT wynika nie tylko z możliwości bezpośredniego oddziaływania na ekspresję niektórych genów (Breusegem i in. 2008, Gapper i Dolan 2006, Mittler i in. 2004, Vranova i in. 2002), ale także ze współdziałania tych cząsteczek z innymi szlakami sygnałowymi zwłaszcza indukowanymi za pośrednictwem fitohormonów. RFT produkowane w odpowiedzi na działanie stresorów mogą wpływać na modyfikację transportu i/lub zawartości auksyn w komórkach roślinnych, które prowadzą do indukcji reakcji morfogenicznej znanej jako odpowiedź morfogeniczna indukowana przez stres (SIMR, ang. stress induced morphogenic response) (Potters i in. 2007). 2. Omówienie celu naukowego prac i osiągniętych wyników W doświadczeniach, których rezultatem są cztery publikacje prezentowane jako moje główne osiągnięcie naukowe, nadrzędnym celem było zbadanie zależności między poziomem RFT, aktywnością wybranych elementów systemu antyoksydacyjnego, a przebiegiem morfogenezy indukowanej in vitro w hypokotylach Mesembryanthemum crystallinum L. (przypołudnik kryształkowy). W literaturze, którą prześledziłam rozpoczynając eksperymenty, nie można było 5

7 odnaleźć wiele informacji dotyczących udziału RFT w indukcji morfogenezy i różnicowaniu organów in vitro. Ponadto, publikowane dane były często rozbieżne, np. w badaniach przeprowadzonych przez Papadakis i Roubelakis-Angelakis (2002) stwierdzono, że indukcji totipotencji towarzyszy obniżenie wewnątrzkomórkowego poziomu RFT oraz podwyższenie aktywności enzymatycznych antyoksydantów, podczas gdy w pracy Cui i in. (1999) obserwowano zjawiska przeciwne. W rezultacie rola RFT w procesach morfogenezy in vitro nie była jednoznacznie określona. M. crystallinum jest fakultatywnym halofitem. Jednym z mechanizmów adaptacyjnych tej rośliny do warunków silnego zasolenia gleby i niedoboru wody w podłożu jest zmiana typu metabolizmu z C 3 na CAM (ang. crassulacean acid metabolism) (Lüttge 1993, Adams i in. 1998). Gatunek ten jest modelowym obiektem wielu analiz, dotyczących udziału RFT w indukcji zmiany typu fotosyntezy. Roślina ta nie była dotychczas przedmiotem badań nad regulacyjną rolą RFT w indukcji i przebiegu morfogenezy in vitro. W czasie gdy rozpoczynałam swoje doświadczenia, w literaturze dostępne były dwa protokoły opisujące indukcję regeneracji in vitro M. crystallinum na drodze kaulogenezy (Meiners i in. 1991) oraz somatycznej embriogenezy (Cushman i in. 2000). Celem tych doświadczeń było uzyskanie efektywnej regeneracji roślin, a autorzy nie podejmowali prób wyjaśnienia zagadnień związanych z mechanizmami regulującymi proces morfogenezy. Doświadczenia rozpoczęłam od analizy morfologicznej, histologicznej i biochemicznej kalusów uzyskanych z hypokotyli siewek M. crystallinum (poz. V. 1.). W wyniku hodowli eksplantatów na pożywkach MS (Murashige i Skoog 1962) różniących się rodzajem oraz stężeniem auksyn i cytokinin, a także zawartością NaCl, otrzymałam dwa typy morfologiczne kalusów: kalus grudkowaty i kruchy oraz kalus o gładkiej powierzchni i galaretowatej konsystencji. Różnice histologiczne pomiędzy uzyskanymi typami kalusów polegały na obecności licznych grup komórek merystematycznych w kalusie grudkowatym, podczas gdy kalus gładki zbudowany był głównie z komórek parenchymatycznych. Obserwacje te wskazywały, że uzyskane kalusy różnią się pod względem możliwości morfogenicznych. Stwierdziłam, że obecność w pożywce kwasu 2,4- dichlorofenoksyoctowego (2,4-D), kinetyny i NaCl, prowadzi do wytworzenia kalusa, w którym formowane są centra komórek merystematycznych. Ten typ kalusa określiłam jako kalus posiadający potencjał regeneracyjny. Natomiast, zastosowanie w pożywce kombinacji fitohormonów w postaci kwasu 1-naftylooctowego (NAA, ang. 1-naphthaleneacetic acid) i 6- benzyloaminopuryny (BAP), a także brak chlorku sodu, prowadzi do powstania kalusa, w którym nie obserwowałam ugrupowań komórek merystematycznych. Ten typ kalusa określiłam jako kalus nieregenerujący. Do indukcji różnicowania nowych organów z centrów merystematycznych kalusa grudkowatego konieczne było usunięcie auksyny z pożywki. Kontynuując kulturę na pożywce bez 2,4-D obserwowałam głównie różnicowanie korzeni (kalus z rozwijającymi się korzeniami). Na nielicznych kalusach ryzogenicznych formowany był dodatkowo kalus odróżniający się morfologicznie silnie zielonym 6

8 zabarwieniem. Fragmenty zielonego kalusa, po odseparowaniu od reszty tkanki kalusa ryzogenicznego, w ciągu dalszej kultury tworzyły zarodki somatyczne (kalus z zarodkami somatycznymi). Stwierdziłam również, że w moim modelu eksperymentalnym ryzogeneza jest dominującym typem regeneracji (86% eksplantatów). Proces somatycznej embriogenezy obserwowano tylko na 14% eksplantatów. Należy zaznaczyć, że pomimo tych samych warunków indukujących morfogenezę, dwa typy regeneracji nigdy nie pojawiały się na tym samym eksplantacie, co może wskazywać, że indukcja danego typu morfogenezy u M. crystallinum zależy głównie od czynników endogennych. Dodatkowo, korzenie różnicowały się z komórek merystematycznych położonych głęboko w tkankach kalusa, natomiast zarodki somatyczne rozwijały się z centrów merystematycznych formowanych w peryferycznych warstwach kalusa. Fakt ten może z kolei wskazywać na istnienie w obrębie kalusa gradientu substancji indukujących dany typ morfogenezy. Rozpoczynając badania biochemiczne na uzyskanych typach kalusów założyłam istnienie różnic w poziomie stresu oksydacyjnego wyrażonego stężeniem endogennego nadtlenku wodoru oraz w aktywności enzymatycznych antyoksydantów regulujących poziom H 2 O 2 w badanym materiale. Analizy biochemiczne z wykorzystaniem metod spektrofotometrycznych, elektroforezy natywnej, barwienia żeli poliakrylamidowych na aktywność SOD i KAT oraz metody fluorymetrycznej przeprowadziłam na typach kalusów o rożnym potencjale morfogenicznym (kalus nieregenerujący oraz kalus posiadający potencjał regeneracyjny), a także na kalusach z rozwijającymi się korzeniami lub zarodkami somatycznymi. Stwierdziłam, że uzyskane typy kalusów różniące się zdolnością i sposobem regeneracji wykazują odmienną zawartości H 2 O 2 oraz aktywności SOD i KAT. Najwyższy poziom nadtlenku wodoru obserwowałam w kalusie posiadającym potencjał regeneracyjny, natomiast najniższy poziom tej cząsteczki odnotowałam w komórkach kalusa nieregenerującego i kalusa z zarodkami somatycznymi. Komórki kalusa z rozwijającymi się korzeniami także wykazywały stosunkowo niską zawartość nadtlenku wodoru. Aktywność KAT we wszystkich typach badanego kalusa korelowała z zawartością nadtlenku wodoru: najniższą aktywność tego enzymu zanotowałam w kalusie wykazującym potencjał regeneracyjny, podczas gdy kalus nieregenerujący oraz kalus z rozwijającymi się korzeniami lub zarodkami somatycznymi zaopatrzone były w KAT o stosunkowo wysokiej aktywności, zwłaszcza w przypadku kalusa embriogenicznego. Wizualizacja aktywności SOD na żelach poliakrylamidowych wykazała obecność kilku izoform tego enzymu we wszystkich badanych typów kalusów. Izoformy te zostały zidentyfikowane jako: MnSODII, MnSOD, FeSOD i CuZnSOD. We wszystkich badanych typach kalusów największe różnice w aktywności wykazywała izoforma FeSOD i MnSODII. Najwyższą aktywność FeSOD odnotowano w kalusie nieregenerującym oraz w kalusie z rozwijającymi się zarodkami somatycznymi. We wcześniejszych badaniach przeprowadzonych przez Miszalski i in. (1998) stwierdzono, że izoforma FeSOD zlokalizowana jest 7

9 głównie w chloroplastach komórek M. crystallinum, gdzie uczestniczy w regulacji poziomu RFT produkowanych w procesie fotosyntezy. Ten rezultat korelował z wynikiem pomiarów aktywności fotosyntetycznej badanych typów kalusów wykonanej za pomocą pomiarów fluorescencji chlorofilu a. Parametr wskazujący na maksymalną wydajność fotosyntetyczną PSII (Fv/Fm) był najwyższy w typach kalusów, w których aktywność FeSOD była również wysoka. Ponadto, w dwóch badanych typach tj. kalusie posiadającym potencjał regeneracyjny oraz w kalusie z rozwijającymi się korzeniami, w których parametr Fv/Fm był niski, zaobserwowałam pojawienie się dodatkowego prążka odpowiadającego aktywności SOD, który oznaczyłam jako MnSODII. We wcześniejszych analizach aktywności SOD w różnych organach M. crystallinum stwierdzono, że obecność tej izoformy ograniczona jest do komórek korzenia roślin rosnących zarówno w warunkach in vivo (Libik i in. 2005, II B5; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5) jak i in vitro (Ślesak i Miszalski 2003). Pojawienie się prążka odpowiadającego aktywności MnSODII nie tylko w kalusie z rozwijającymi się korzeniami, ale również w kalusie wykazującym potencjał regeneracyjny może wskazywać, że aktywność tej izoformy jest nie tylko organospecyficzna, lecz związana z typem metabolizmu. Wskazują na to wyniki analizy aktywności fotosyntetycznej PSII. Wartości parametru Fv/Fm były niskie w typach kalusów, w których obserwowano aktywność MnSODII. Wyniki te skłoniły mnie do wysnucia hipotezy, że różnice w aktywności antyoksydacyjnej pomiędzy badanymi typami kalusów mogą wynikać z różnic w ich aktywności metabolicznej. Na uwagę zasługuje fakt, że pomimo kultury w tych samych warunkach oświetlenia oraz stężenia cukru w pożywce komórki analizowanych typów kalusów różniących się potencjałem regeneracyjnym oraz rodzajem morfogenezy realizowały inny typ metabolizmu z przewagą autotrofizmu lub heterotrofizmu. Podsumowując wyniki uzyskane w ramach przeprowadzonych doświadczeń stwierdziłam, że typy kalusów posiadające różny potencjał regeneracyjny charakteryzują się odmienną aktywnością enzymów antyoksydacyjnych regulujących poziom endogennego nadtlenku wodoru. Wysokie stężenie H 2 O 2, niska aktywność KAT, a także indukcja dodatkowej izoformy MnSODII towarzyszy indukcji potencjału regeneracyjnego w komórkach kalusa. Stwierdziłam również, że indukcja danej ścieżki rozwojowej może zależeć od typu metabolizmu, który realizują różnicujące się komórki kalusa: heterotrofizm koreluje z rozwojem korzeni natomiast autotrofizm towarzyszy rozwojowi zarodków somatycznych. W kolejnych doświadczeniach skoncentrowałam się na badaniach mechanizmów regulacji poziomu RFT w komórkach kalusa wykazującego potencjał regeneracyjny, indukowanego z hypokotyli M. crystallinum pod wpływem 2,4D, kinetyny i NaCl (poz. V. 2.). Założyłam, że obecność chlorku sodu odgrywa znaczącą rolę w indukcji stresu oksydacyjnego, którego poziom wyrażony stężeniem H 2 O 2 i regulowany przez aktywność enzymów antyoksydacyjnych odpowiada za indukcję potencjału morfogenicznego. 8

10 Jedną z adaptacji komórek M. crystallinum do stresu związanego z obecnością NaCl w podłożu jest akumulacja substancji kompatybilnych określanych również mianem metabolitów stresowych, które pozwalają na utrzymanie równowagi osmotycznej pomiędzy wakuolą, w której gromadzone są jony, a cytoplazmą. Jedną z takich substancji jest prolina (Parvaiz i Satyawati 2008). W doświadczeniach przeprowadzonych wcześniej na roślinach M. crystallinum poddanych stresowi zasolenia wykazano, że prolina pełni również funkcje antyoksydacyjne, usuwając anionorodnik ponadtlenkowy (Shevyakova i in. 2009). Ponadto, badania przeprowadzone na gatunkach roślin tolerujących wysokie stężenia NaCl, wykazały, że prolina odgrywa także rolę cząsteczki sygnałowej, wpływającej na ekspresję genów odpowiedzialnych za indukcję szlaków metabolicznych takich jak oksydacyjny szlak pentozofosforanowy, który zabezpiecza komórki przed szkodliwym działaniem stresu (Hare i Cress 1997). Wykazano również, że prolina indukuje podziały komórkowe i różnicowanie w procesie kaulogenezy w kulturach in vitro Arabidopsis thaliana (Hare et al. 2001). W celu weryfikacji tezy dotyczącej roli NaCl w indukcji potencjału regeneracyjnego z kalusa M. crystallinum analizowałam stężenie endogennego nadtlenku wodoru, aktywność wybranych enzymatycznych elementów systemu antyoksydacyjnego, a także zawartości proliny w komórkach kalusów indukowanych na pożywkach różniących się zawartością chlorku sodu. Wykazałam, że indukcji potencjału regeneracyjnego z kalusa na pożywce zawierającej NaCl towarzyszy niski poziom endogennego H 2 O 2, wysoka aktywność SOD, KAT oraz peroksydazy askorbinianowej (APX) i gwajakolowej (POD), a także wysokie stężenie proliny w porównaniu z kalusem którego komórki nie wykazują zdolność do regeneracji, indukowanym na pożywce nie zawierającej chlorku sodu. Ponadto stwierdziłam, że komórki kalusa indukowanego bez udziału NaCl reagują na warunki kultury akumulując znaczne ilości metabolitów wtórnych w postaci betacyjanin. Związki te, nadające komórkom czerwone zabarwienie, należą do betalain charakteryzujących się wysoką aktywnością antyoksydacyjną (Cai i in. 2003). Są one syntetyzowane i akumulowane w zastępstwie antocyjanów w komórkach większości gatunków roślin z rodziny Caryophyllaceae (Goździkowate), do której należy również M. crystallinum (Strack i in. 2003). Pomimo wykazanej zdolności do usuwania RFT, betacyjaniny nie były jak dotychczas przedmiotem wielu badań dotyczących zależności pomiędzy indukcją ich syntezy oraz zmian ich stężenia w odpowiedzi na działanie stresu oksydacyjnego u M. crystallinum. W literaturze dostępne jest jedno doniesienie świadczące o wzmożonej syntezie i akumulacji betacyjanin w komórkach liści M. crystallinum w odpowiedzi na działanie stresu świetlnego (Ibdah i in. 2002). Uzyskane przeze mnie rezultaty wskazują, że w komórkach kalusa hodowanego bez dodatku NaCl, stres oksydacyjny wywołany warunkami hodowli niezależnymi od światła, prowadzi do uaktywnienia mechanizmów adaptacyjnych w postaci zwiększonej akumulacji betacyjanin. Uzyskane wyniki skłoniły mnie do przeprowadzenia doświadczenia polegającego na manipulowaniu poziomem stresu oksydacyjnego poprzez zahamowanie aktywności KAT i SOD za pomocą 9

11 inhibitorów w postaci odpowiednio aminotriazolu (AT) lub dietyloditiokarbaminianu (DDTC, ang. diethyldithiocarbamate) dodanych do pożywek indukujących rozwój kalusa. Eksperymenty te miały na celu stwierdzenie czy w ten sposób zmieniony poziom stresu oksydacyjnego spowoduje modyfikację odpowiedzi adaptacyjnej w postaci indukcji regeneracji lub syntezy i akumulacji betacyjanin. Wyniki tych doświadczeń wykazały, że zastosowanie inhibitorów KAT lub SOD w hodowlach kalusa w obecności fitohormonów i NaCl powoduje wzrost ilości endogennego nadtlenku wodoru i zablokowanie zdolności regeneracyjnych tych komórek. Na skutek inhibicji aktywności KAT komórki kalusa hodowanego w obecności NaCl tracą możliwości adaptacyjne i degenerują. Natomiast zablokowanie aktywności SOD nie prowadzi do zmian nekrotycznych, a obserwowany wysoki poziom H 2 O 2 może wskazywać na inne niż reakcja dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego źródło nadtlenku wodoru w badanych komórkach. Wykazałam również, że po zahamowaniu aktywności SOD przez DDTC poziom proliny znacznie wzrasta, co dodatkowo świadczy o udziale tego związku w regulacji stężenia O - 2, natomiast wskazuje również, że wzrost stężenia proliny nie jest głównym czynnikiem wpływającym na indukcję potencjału regeneracyjnego. Z drugiej strony, zahamowanie aktywności zarówno SOD jak i KAT w komórkach kalusa hodowanego na pożywce bez dodatku NaCl prowadzi do obniżenia poziomu H 2 O 2. Po zablokowaniu aktywności KAT funkcje usuwania nadtlenku wodoru przejmują APX i POD, których aktywność znacznie wzrasta. W obydwu przypadkach zastosowanych inhibitorów zmniejszone stężenie H 2 O 2 koreluje z obniżeniem stężenia betacyjanin w komórkach kalusa indukowanego na pożywce bez NaCl, co stanowi dodatkowy argument, przemawiający za indukcją syntezy tych metabolitów wtórnych w odpowiedzi na podwyższony poziom RFT. Wyniki uzyskane w tej pracy wskazują na możliwość indukcji różnych procesów adaptacyjnych w hodowanych kalusach M. crystallinum w zależności od warunków kultury indukujących stres oksydacyjny oraz zaangażowania specyficznych elementów systemu antyoksydacyjnego w regulację poziomu RFT. Stresowi oksydacyjnemu wywołany warunkami kultury na pożywce pozbawionej chlorku sodu towarzyszy wysoka aktywnością SOD i KAT oraz niska aktywnością POD i APX, co skutkuje ustaleniem wysokiego poziomu H 2 O 2, wzrostem syntezy i akumulacji betacyjanin oraz brakiem zdolności do regeneracji. Warunki hodowli kalusa na pożywce z dodatkiem NaCl wpływają na aktywację wszystkich badanych enzymatycznych antyoksydantów oraz indukcję akumulacji proliny powodując ustalenie niskiego poziomu H 2 O 2 w porównaniu z kalusem hodowanym na pożywce bez dodatku NaCl. W ten sposób ustalony poziom RFT sprzyja indukcji potencjału regeneracyjnego. Kontynuując badania nad rolą RFT i enzymów antyoksydacyjnych w regulacji procesów morfogenicznych w kulturach in vitro M. crystallinum uznałam za konieczne opracowanie modelu eksperymentalnego, w którym ilość czynników egzogennych stosowanych do indukcji regeneracji 10

12 byłaby ograniczona, a także regeneracja przebiegałaby bezpośrednio z komórek eksplantatu, z pominięciem etapu formowania kalusa, którego komórki często wykazują niestabilność fizjologiczną i genetyczną. Dlatego też, opracowałam system regeneracji na drodze ryzogenezy bezpośredniej, stosując do hodowli hypokotyli M. crystallinum pożywkę zawierającą tylko auksynę w postaci 2,4-D lub NAA. Obydwa rodzaje fitohormonów należą do auksyn syntetycznych, które różnią się sposobem oddziaływania na komórki: 2,4-D indukuje głównie podziały komórkowe, natomiast NAA wpływa preferencyjnie na wydłużanie komórek (Campanoni i Nick 2005). W przeprowadzonych doświadczeniach nad indukcją ryzogenezy bezpośredniej wykazałam, że indukcja potencjału morfogenicznego nie zależy od rodzaj auksyny. Zarówno w przypadku obecności w pożywce 2,4-D jak i NAA proces ryzogenezy przebiega z taką samą częstotliwością i obejmuje od 80 do 90% eksplantatów (poz. V. 3. i poz. V. 4.). Badania nad ryzogenezą bezpośrednią rozpoczęłam od wyznaczenia najważniejszych etapów tworzenia korzeni takich jak indukcja kompetencji do ryzogenezy, determinacji i różnicowania. W tym celu wykorzystałam eksperyment transferu tkanek według Christiansona i Warnicka (1983) (poz. V. 3.). Wykazałam, że komórki hypokotyli uzyskują kompetencję - czyli zdolność do reagowania na czynnik indukujący ryzogenezę (w moim doświadczeniu egzogenną auksynę NAA) w trzecim dniu hodowli. Determinacja rozwoju w kierunku tworzenia korzeni następuje natomiast po pięciu dniach ekspozycji na auksynę. Na podstawie analizy histologicznej procesu ryzogenezy stwierdziłam, że indukcja kompetencji zbiega się w czasie z inicjacją podziałów komórkowych w obrębie walca osiowego. W czasie indukcji determinacji z kolei zaobserwowałam wyodrębnianie się grup komórek w peryferycznych rejonach steli, z których tworzyły się centra merystematyczne, a z nich w kolejnych dniach kultury różnicują się zawiązki korzeni, a następnie korzenie. W celu wykazania udziału RFT oraz enzymatycznych antyoksydantów w procesie ryzogenezy bezpośredniej, analizowałam poziom endogennego H 2 O 2 oraz aktywność wybranych enzymatycznych antyoksydantów takich jak SOD, KAT i POD w kolejnych fazach regeneracji. Na podstawie pomiarów spektrofotometrycznych wykazałam, że we wczesnych etapach ryzogenezy następuje wzrost stężenia endogennego H 2 O 2, a jego najwyższy poziom osiągany jest w czasie indukcji kompetencji do regeneracji. Aktywność enzymów rozkładających H 2 O 2 jest w tym okresie znacznie obniżona. Stwierdziłam również, że dodanie do pożywki kwasu askorbinowego, który jest powszechnie znanym drobnocząsteczkowym antyoksydantem powoduje obniżenie stężenia endogennego H 2 O 2 i zahamowanie ryzogenezy. Wykonując pomiary aktywności fotosyntetycznej oraz oddychania komórkowego, wykazałam, że w czasie indukcji kompetencji intensywność podstawowych procesów anabolicznych i katabolicznych jest niewielka. Z danych literaturowych wynika, że jest to jeden z mechanizmów adaptacyjnych do stresowych warunków kultur in vitro poprzedzający wzrost i rozwój nowych organów (Gaspar i in. 2002). Wyniki moich badań pozwoliły 11

13 na stwierdzenie, że komórki hypokotyli we wczesnych fazach hodowli na pożywce indukującej ryzogenezę przechodzą w stan przypominający anabiozę, polegający na maksymalnym ograniczeniu procesów metabolicznych, oraz ograniczeniu procesów wzrostowych, a większość posiadanej energii wykorzystują do procesów przeorganizowania aktywności genetycznej koniecznej do rozpoczęcia nowych szlaków rozwojowych. Wyniki pomiarów poziomu endogennego nadtlenku wodoru a także eksperymenty z dodaniem kwasu askorbinowego wykazały, że RFT pełnią istotną rolę regulacyjną we wczesnych etapach ryzogenezy, jednak ich źródłem na tym etapie rozwojowym nie są intensywne procesy metabolizmu podstawowego. W procesach różnicowania i wzrostu korzeni zaobserwowałam spadek ilości endogennego nadtlenku wodoru, co korelowało z podwyższona aktywnością KAT i POD. Stwierdziłam również, że hypokotyle wytwarzające korzenie charakteryzują się wysoką aktywnością zarówno fotosyntetyczną jak i oddechową, co potwierdza, że wzrost i różnicowanie to procesy wymagające nakładu energii. Intensywny metabolizm jest źródłem produkcji RFT, których poziom jest regulowany przez KAT o czym świadczy indukcja w fazie wzrostu korzeni dodatkowej izoformy tego enzymu oznaczonej jako KAT2 oraz POD gwajakolowej biorącej udział w syntezie ścian nowo powstających komórek (Molassiotisi in. 2004). Szczególnie interesującym wynikiem, który uzyskałam podczas prowadzenia opisywanych doświadczeń jest zidentyfikowanie aktywności dodatkowej izoformy SOD oznaczonej jako MnSOD2 w komórkach hodowanych hypokotyli. Indukcję aktywności tej izoformy stwierdziłam już we wczesnych etapach ryzogenezy, tj. w piątym dniu hodowli, w którym obserwowałam podwyższenie poziomu H 2 O 2 oraz formowanie centrów merystematycznych. Aktywność MnSOD2 utrzymywała się przez kolejne dni kultury również w czasie różnicowania i wzrostu korzeni. Natomiast w materiale hodowanym na pożywce w obecności kwasu askorbinowego, w którym nie dochodziło do indukcji ryzogenezy, nie zaobserwowałam indukcji aktywności MnSOD2 przez cały okres kultury. We wcześniejszych doświadczeniach indukcję aktywności tej samej izoformy obserwowano w korzeniach roślin M. crystallinum hodowanych zarówno w warunkach in vivo (Libik i in. 2005, II B5; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5) jak i in vitro (Ślesak i Miszalski 2003) wnioskując, że jej aktywność jest organospecyficzna. Uzyskane przeze mnie wyniki badań nad indukcją aktywności MnSOD2 w komórkach kalusa wykazującego potencjał regeneracyjny w kierunku ryzogenezy oraz w kalusie z rozwijającymi się korzeniami wskazały na zależność pomiędzy typem metabolizmu, a indukcją aktywności tej izoformy (poz. V. 1.). Wyniki uzyskane w opisywanej tu pracy wskazują dodatkowo, że aktywność MnSOD2 charakteryzuje zarówno komórki wykazujące niską aktywność metaboliczną w czasie indukcji determinacji do ryzogenezy, jak również komórki wykazujące wzrost aktywności oddechowej i fotosyntetycznej w trakcie procesów różnicowania morfologicznego i wzrostu korzeni. Na podstawie tych informacji stwierdziłam, że indukcja aktywności tego białka nie jest bezpośrednio związana z nasileniem 12

14 procesów metabolizmu podstawowego. Jednakże można uznać, że ekspresja aktywności MnSOD2 może stanowić biochemiczny marker procesu ryzogenezy w hodowlach in vitro hypokotyli M. crystallinum. Dodatkowo, wciąż nie rozwiązanym zagadnieniem dotyczącym MnSOD2 pozostaje biochemiczna natura tego białka. Wcześniejsze rezultaty opublikowane w pracy Ślesak i Miszalski (2003) wskazujące na wysoką masę cząsteczkową MnSOD2 niespotykaną wśród typowych MnSOD w żadnej grupie organizmów, a także negatywne wyniki przeprowadzonej przeze mnie identyfikacji MnSOD2 za pomocą przeciwciał przeciw MnSOD Arabidopsis thaliana (dane nie publikowane) podały w wątpliwość przynależność badanego białka do rodziny MnSOD. Ślesak i Miszalski (2003) sugerowali, że analizowane białko może należeć do grupy tzw. germin i/lub białek germinopodobnych (ang. germin-like proteins, GLP), zwłaszcza, że u M. crystallinum zidentyfikowano korzeniowo-specyficzną GLP, której sekwencja aminokwasowa wykazuje duże podobieństwo do germin i GLP o aktywności MnSOD (Michalowski and Bohnert 1992). Jednakże przeprowadzone przeze mnie w opisywanych doświadczeniach analizy ekspresji genu kodującego korzeniowa specyficzną germinę zidentyfikowaną u M. crystallinum nie potwierdziły obecności transkryptu kodowanego przez ten gen w hodowanych in vitro hypokotlach M. crystallinum na żadnym etapie procesu ryzogenezy, co wyklucza możliwość, że białko oznaczone jako MnSOD2 należy do grupy germin i/lub białek germinopodobnych. Podsumowując opisane wyniki należy stwierdzić, że podwyższony endogenny poziom RFT wpływa na indukcję kompetencji do ryzogenezy bezpośredniej w komórkach hypokotyli hodowanych na pożywce zawierającej auksynę. Komórki hodowanych explantatów uzyskują kompetencję do regeneracji po trzech dniach ekspozycji na działanie regulatora wzrostu czemu towarzyszy wzrost poziomu nadtlenku wodoru oraz obniżenie aktywności enzymatycznych antyoksydantów. Wzrost ilości H 2 O 2 nie wynika z aktywności procesów metabolizmu podstawowego. Udział RFT w indukcji kompetencji ryzogenicznej potwierdzają obserwacje nad obniżeniem endogennego poziomu H 2 O 2 i zahamowaniem różnicowania korzeni w obecności kwasu askorbinowego. W kolejnych fazach regeneracji tj. w czasie indukcji determinacji oraz różnicowania morfologicznego i wzrostu korzeni następuje obniżenie poziomu endogennego nadtlenku wodoru czemu towarzyszy wzrost aktywności enzymów antyoksydacyjnych takich jak KAT i POD oraz indukcja aktywności metabolicznej. Na podstawie uzyskanych rezultatów szczególną rolę w procesie regeneracji przypisuję zidentyfikowanej formie SOD oznaczonej jako MnSOD2. Ekspresję aktywności tego białka stwierdziłam w czasie indukcji determinacji do ryzogenezy oraz w czasie różnicowania morfologicznego i wzrostu korzeni i na tej podstawie określiłam, że może ono stanowić biochemiczny marker ryzogenezy w hypokotylach M. crystallinum. Biochemiczna natura i funkcje tego białka nie zostały jeszcze wyjaśnione. Wyniki doświadczeń przeprowadzonych w 13

15 tej pracy wskazują, że MnSOD2 nie należy do grupy tzw. germin i/lub białek germinopodobnych. W publikowanych w ostatnich latach rezultatach badań podkreśla się fakt, że specyfikę odpowiedzi komórek na działanie RFT warunkuje nie tylko rodzaj RFT, ale również miejsce ich produkcji. Szczególną rolę w indukcji odpowiedzi adaptacyjnej komórek roślinnych przypisuje się RFT produkowanym w przestrzeni apoplastycznej przez kompleks enzymatyczny błonowej oksydazy NADPH (NOX) (Sagi i Fluhr 2006, Gechev i in. 2006). Powyższe dane literaturowe skłoniły mnie do przeprowadzenia doświadczeń dotyczących udziału NOX oraz różnych rodzajów RFT w regulacji ryzogenezy w komórkach hypokotyli M. crystallinum (poz. V. 4.). W zastosowanym do badań modelu eksperymentalnym wykorzystałam hypokotyle hodowane na pożywce indukującej ryzogenezę w obecności NAA oraz hypokotyle hodowane na tej samej pożywce uzupełnionej dodatkowo chlorkiem difenylenoiodoniowym (DPI ang. diphenylene iodonium), Związek ten jest powszechnie stosowanym inhibitorem NOX (Riganti i in. 2004). Na podstawie obserwacji morfologicznych stwierdziłam, że obecność DPI w pożywce prowadzi do całkowitej inhibicji procesu ryzogenezy. W wyniku analizy histologicznej hypokotyli hodowanych w obecności DPI stwierdziłam nieliczne podziały w obrębie komórek walca osiowego, które prowadziły do powstania grup komórek parenchymatycznych. Badania aktywności NOX przeprowadzone w oparciu o analizę spektrofotometryczną oraz wizualizację prążków odpowiadających aktywności badanego enzymu na żelach poliakrylamidowych, wykazały zablokowanie aktywności NOX pod wpływem zastosowanego w hodowli DPI. Przeciwnie komórki hypokotyli hodowane na pożywce nie zawierającej DPI, charakteryzowały się indukcją aktywności NOX pod wpływem warunków hodowli, która korelowała z wysoką aktywnością mitotyczną komórek w obrębie walca osiowego. Aktywność NOX była najwyższa w trakcie intensywnych podziałów komórek w obrębie walca osiowego hypokotyli prowadzących do powstania merystemoidów, natomiast wraz z rozwojem korzeni aktywność tego enzymu stopniowo obniżała się. Na podstawie tych wyników założyłam, że wzrost aktywność NOX prowadzi do nadprodukcji RFT, które odgrywają znaczącą rolę w indukcji procesów ryzogenezy. Wyniki pomiarów stężenia nadtlenku wodoru, potwierdziły moje założenie i wykazały, że wzrost aktywności NOX koreluje ze wzrostem ilości nadtlenku wodoru w komórkach hypokotyli we wczesnych stadiach indukcji ryzogenezy. Natomiast zahamowanie aktywności NOX koreluje z niskim poziomem nadtlenku wodoru w hodowanych w obecności DPI hypokotylach, które nie wykazują zdolności do ryzogenezy. Na podstawie badań ultrastrukturalnych nad lokalizacją nadtlenku wodoru przeprowadzonych we współpracy z dr hab. Małgorzatą Kozieradzką-Kiszkurno z Katedry Cytologii i Embriologii Roślin Uniwersytetu Gdańskiego, wykazałam, że H 2 O 2 generowany jest głównie w apoplaście intensywnie dzielących się komórkach walca osiowego oraz w komórkach kory pierwotnej hypokotyli 14

16 wykazujących ryzogenezę, a także hypokotyli nieryzogenicznych hodowanych w obecności DPI. Jednakże zaobserwowałam pewne różnice w rozmieszczeniu elektronowo gęstych precypitatów nadtlenku ceru, powstałych w reakcji chlorku ceru z H 2 O 2, pomiędzy analizowanymi komórkami. W hypokotylach wykazujących ryzogenezę, w obrębie walca osiowego precypitaty, były widoczne po stronie wewnętrznej ściany komórkowej, podczas gdy w komórkach kory pierwotnej ich obecność ograniczona była do blaszki środkowej. W hypokotylach nieryzogenicznych, hodowanych na pożywce z DPI, precypitaty były również widoczne, ale tylko w komórkach kory pierwotnej, gdzie zlokalizowany były głównie w przestrzeniach międzykomórkowych sąsiadujących ze sobą komórek. Te wyniki skłoniły mnie do sformułowania wniosku, że w różnych tkankach hypokotyli M. crystallinum poziom H 2 O 2 jest regulowany przez różne elementy systemu antyoksydacyjnego. W komórkach walca osiowego, w których rozpoczyna się proces ryzogenezy poziom RFT regulowany jest przez NOX, która tym samym jest odpowiedzialna za produkcję RFT biorących udział w procesie ryzogenezy, natomiast w komórkach kory pierwotnej nie uczestniczących w tworzeniu nowych organów regulacyjną role poziomu RFT mogą spełniać peroksydazy związane ze ścianą komórkową. Przemawia za tym fakt, że w hypokotylach nieryzogenicznych hodowanych w obecności inhibitora NOX również obserwowałam obecność licznych precypitatów nadtlenku ceru w komórkach kory pierwotnej. Być może wynika to z odmiennej roli jaką pełnią RFT w badanych komórkach. Komórki kory pierwotnej hypokotyli, narażone są na stres mechaniczny związany z naporem powiększającego się wskutek podziałów walca osiowego. Komórki kory pierwotnej reagują wytwarzając mechanizmy usztywniające ścianę komórkową, w których uczestniczy H 2 O 2, natomiast w komórkach walca osiowego, podlegających licznym podziałom na skutek wysokiej aktywności mitotycznej, indukowane są mechanizmy rozluźniające strukturę ściany komórkowej, w których bierze udział O - 2. Wizualizację rozmieszczenia rodzajów RFT w hodowanych in vitro hypokotylach przeprowadziłam na poziomie histologicznym, wykorzystując barwienie anionorodnika ponadtlenkowego błękitem nitrotetrazolowym (NBT, ang. nitrotetrazolium blue) lub nadtlenku wodoru diaminobenzydyną (DAB, ang 3,3 -diaminobenzidine). Badania te wykonałam w ramach nawiązanej współpracy z dr Christine Desel podczas pobytu na stażu naukowym w Instytucie Botaniki na Uniwersytecie w Kilonii w Niemczech. Na podstawie tych analiz wykazałam, że różne rodzaje RFT (O - 2 i H 2 O 2 ) są produkowane i akumulowane w różnych częściach eksplantatów w kolejnych fazach tworzenia korzeni. We wczesnych stadiach ryzogenezy, na etapie indukcji aktywności mitotycznej w komórkach walca osiowego oraz formowania centrów merystematycznych, zaobserwowałam - wysokie stężenie O 2 w obrębie walca osiowego, natomiast H 2 O 2 w obszarze kory pierwotnej oraz w tkance przewodzącej hypokotyli. Różnice w lokalizacji analizowanych RFT wykazałam również na - etapie różnicowania się korzeni. Zaobserwowałam, że akumulacja O 2 związana jest głównie z obszarem formowania merystemu apikalnego nowych organów oraz ze strefą wydłużania się 15

17 komórek, podczas gdy H 2 O 2 rozmieszczony jest głównie w komórkach tworzących system tkanek przewodzących nowych organów. Uzyskane rezultaty wskazują jednoznacznie, że: wzrost aktywności NOX zbiega się w czasie ze wzrostem stężenia endogennego H 2 O 2 i indukcją aktywności mitotycznej w komórkach walca osiowego hypokotyli. Sugeruje to, że RFT produkowane przez NOX odgrywają istotną rolę w indukcji ryzogenezy w kulturach in vitro hypokotyli M. crystallinum. Wskazują na to również wyniki moich badań przeprowadzonych na hypokotylach rosnących w obecności inhibitora NOX w pożywce. Wykazały one, że inhibicja aktywności NOX powoduje obniżenie stężenia endogennego H 2 O 2 oraz zahamowanie ryzogenezy. Różnice w rozmieszczeniu H 2 O 2 na poziomie ultrastrukturalnym pomiędzy komórkami walca osiowego i kory pierwotnej wynikają z zaangażowania specyficznych elementów systemu antyoksydacyjnego w regulację stężenia RFT w komórkach tych tkanek. W aktywnych mitotycznie komórkach walca osiowego O - 2 uczestniczy w rozluźnianiu ściany komórkowej, a jego poziom regulowany jest przez NOX. W komórkach kory pierwotnej H 2 O 2 uczestniczy w procesach prowadzących do usztywniania ścian komórek, a jego - stężenie regulują prawdopodobnie POD związane ze ścianą komórkową. Odmienna lokalizacja O 2 i H 2 O 2 na poziomie histologicznym wskazuje również na różną funkcję poszczególnych rodzajów - RFT. Obecność O 2 w walcu osiowym hypokotyli ryzogenicznych oraz merystemie apikalnym i strefie wydłużania komórek w nowopowstałych korzeniach wskazuje, że miejsce intensywnej - produkcji O 2 związane jest z obszarami aktywności podziałowej i procesami wydłużania się komórek, które wymagają obecności tej formy RFT do rozluźniania ścian komórek. Natomiast lokalizacja H 2 O 2 w korze pierwotnej zarówno hypokotyli ryzogenicznych jak i hypokotyli nieryzogenicznych, a także w tkankach przewodzących zregenerowanych korzeni przemawia za udziałem tej formy RFT w mechanizmach usztywniania ścian komórek, które związane są między innymi z procesami różnicowania. 3. Najważniejsze osiągnięcia W publikacjach składających się na osiągnięcie naukowe będące podstawą do ubiegania się o stopień doktora habilitowanego udowodniłam zaangażowanie RFT w indukcję procesów morfogenezy oraz wykazałam regulacyjną rolę elementów systemu antyoksydacyjnego w ustaleniu poziomu stresu oksydacyjnego optymalnego do indukcji potencjału regeneracyjnego w hodowlach in vitro hypokotyli Mesembryanthemum crystallinum L.. Postawiony w przedstawionym cyklu publikacji cel zrealizowałam w oparciu o wielopłaszczyznowe badania na poziomie histologicznym, ultrastrukturalnym jak i biochemicznym w odniesieniu do dwóch systemów eksperymentalnych: organogenezy pośredniej i organogenezy bezpośredniej. Na podstawie uzyskanych rezultatów wykazałam, że: 16

18 1/ linie kalusów posiadające różny potencjał regeneracyjny oraz wykazujące różny typ morfogenezy charakteryzują się odmienną aktywnością enzymów antyoksydacyjnych regulujących poziom endogennego nadtlenku wodoru. 2/ wysokie stężenie H 2 O 2, niska aktywność KAT, a także indukcja dodatkowej izoformy SOD, określonej jako MnSOD2, towarzyszy indukcji potencjału regeneracyjnego na drodze ryzogenezy w komórkach kalusa. 3/ indukcja danej ścieżki rozwojowej może zależeć od typu metabolizmu, który realizują różnicujące się komórki kalusa: heterotrofizm koreluje z rozwojem korzeni natomiast autotrofizm towarzyszy rozwojowi zarodków somatycznych. 4/ stres solny aplikowany w czasie indukcji regeneracji w hodowlach kalusa wpływa na potencjał regeneracyjny na skutek zaangażowania specyficznych elementów systemu antyoksydacyjnego, takich jak prolina, w regulację poziomu RFT. 5/ stres oksydacyjny wywołany warunkami hodowli na pożywce pozbawionej chlorku sodu powoduje wysoką aktywność SOD i KAT oraz niską aktywność POD i APX, co skutkuje ustaleniem wysokiego poziomu H 2 O 2, na który komórki kalusa reagują brakiem zdolności do regeneracji na korzyść syntezy i akumulacji betacyjanin. 6/ wysoki poziom nadtlenku wodoru oraz obniżenie aktywności enzymatycznych antyoksydantów jest niezbędne do uzyskaniu kompetencji do ryzogenezy przez komórki hodowanych in vitro hypokotyli. W czasie indukcji kompetencji hypokotyle wykazują niskie natężenie procesów fotosyntezy i oddychania komórkowego co wskazuje, że te dwa procesy nie stanowią źródła nadprodukcji RFT na tym etapie regeneracji in vitro. 7/ w czasie indukcji determinacji i różnicowania morfologicznego oraz wzrostu korzeni następuje obniżenie poziomu endogennego nadtlenku wodoru czemu towarzyszy wzrost aktywności enzymów antyoksydacyjnych takich jak KAT i POD oraz indukcja aktywności metabolicznej. 8/ MnSOD2 można uznać za biochemiczny marker ryzogenezy w hodowlach in vitro hypokotyli M. crystallinum ponieważ ekspresja jego aktywności towarzyszy indukcji determinacji do regeneracji oraz różnicowaniu morfologicznemu i wzroście korzeni. 9/ MnSOD2 nie należy do grupy białek z rodziny germin i/lub białek germinopodobnych, a jego natura biochemiczna powinna zostać dokładnie sprecyzowana ze względu na specyficzne cechy biochemiczne podające w wątpliwość przynależność tego białka do rodziny dysmutaz ponadtlenkowych. 10/ kompleks enzymatyczny błonowej oksydazy NADPH (NOX), produkującej anionorodnik ponadtlenkowy w przestrzeni apoplastycznej odgrywa znaczącą rolę w produkcji RFT zaangażowanych w indukcję kompetencji do regeneracji na drodze ryzogenezy bezpośredniej z komórek hypokotyli M. crystallinum. 17

19 11/ różne rozmieszczenie H 2 O 2 na poziomie ultrastrukturalnym pomiędzy komórkami walca osiowego i kory pierwotnej hodowanych hypokotyli w czasie indukcji kompetencji do ryzogenezy wynika z zaangażowania specyficznych elementów systemu antyoksydacyjnego w regulację stężenia RFT w komórkach tych tkanek. W aktywnych mitotycznie komórkach walca osiowego poziom RFT, które uczestniczą w rozluźnianiu ściany komórkowej, regulowany jest przez NOX. W komórkach kory pierwotnej regulacyjną rolę pełnią prawdopodobnie POD związane ze ścianą komórkową. W komórkach kory pierwotnej, H 2 O 2 wykorzystywany jest w procesach prowadzących do usztywniania ścian. - 12/ odmienna lokalizacja O 2 i H 2 O 2 na poziomie histologicznym wskazuje na różną funkcję - poszczególnych rodzajów RFT w procesie ryzogenezy bezpośredniej. Miejsca intensywnej produkcji O 2 związane są z obszarami aktywności podziałowej w walcu osiowym hypokotyli i procesami wydłużania się komórek w nowopowstałych korzeniach. Natomiast lokalizacja H 2 O 2 w korze pierwotnej hypokotyli oraz w tkankach przewodzących nowych korzeni przemawia za udziałem tej formy RFT w mechanizmach usztywniania ścian komórek, które związane są między innymi z procesami różnicowania. Większość badań przedstawionych w opisanym cyklu publikacji została sfinansowana ze środków kierowanego przeze mnie projektu badawczego o numerze N przyznanego w roku 2008 przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego (XI 6, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). 4. Kierunki i perspektywy dalszych badań Kontynuując badania nad rolą RFT i systemu antyoksydacyjnego w morfogenezie in vitro M. crystallinum chciałabym skoncentrować się na identyfikacji specyficznego dla ryzogenezy bialka o aktywności dysmutazy ponadtlenkowej, oznaczonego jako MnSOD2. W celu określenia jego chemicznej natury konieczna jest kompleksowa analiza proteomiczna związana z oczyszczeniem korzeniowo-specyficznego białka wykazującego aktywność dysmutazową, a następnie analiza jego sekwencji z zastosowaniem spektrometrii masowej i dostępnych narzędzi bioinformatycznych. Na podstawie uzyskanych w ten sposób wyników będzie można z dużym prawdopodobieństwem oznaczyć przynależność MnSOD2 do konkretnej grupy białek oraz wnioskować o jego specyficznej funkcji. Realizacja tego celu będzie możliwa dzięki nawiązanej przeze mnie współpracy z prof. S. Lüthje, która kieruje laboratorium Stresu Oksydacyjnego i Proteomiki Roślin na Wydziale Biologii Uniwersytetu w Hamburgu w Niemczech. Obecnie, dzięki nawiązanej współpracy trwają badania nad analizą proteomiczną i identyfikacją białek specyficznie aktywnych w kolejnych etapach ryzogenezy w hypokotylach M. crystallinum L. 18