Dr hab. Jacek Patykowski, prof. nadzw. Łódź, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytet Łódzki ul Banacha 12/ Łódź

Transkrypt

1 Dr hab. Jacek Patykowski, prof. nadzw. Łódź, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytet Łódzki ul Banacha 12/ Łódź Recenzja Rozprawy doktorskiej mgr Kamili Kulbat pt: Zmiany zawartości związków biologicznie czynnych i alergenności roślin z rodziny Lamiaceae w odpowiedzi na stres abiotyczny wywołany obecnością metali ciężkich wykonanej pod kierunkiem dr. hab. inż. Joanny Leszczyńskiej i dr inż. Doroty Mańkowskiej w Instytucie Podstaw Chemii Żywności, Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej Zanieczyszczenie gleby metalami ciężkimi stanowi jeden z głównych problemów, z jakimi boryka się współczesne rolnictwo. Nadmierne ilości jonów metali ciężkich w glebie mogą prowadzić do stresu oksydacyjnego w tkankach roślinnych doprowadzając do trwałych uszkodzeń struktur komórkowych. Cytując autorkę należy stwierdzić, iż systemy antyoksydacyjne uruchamiane w komórkach roślinnych nie zawsze mogą sobie poradzić ze stresem oksydacyjnym objawiającym się w początkowych etapach na generowaniu reaktywnych form tlenu. Jak autorka trafnie stwierdza najbardziej reaktywnym jest rodnik hydroksylowy, którego pojawienie się zapoczątkowuje wiele łańcuchowych reakcji wolnorodnikowych. Rośliny są powszechnie stosowane jako przyprawy, a ich składniki stosowane jako dodatki do kosmetyków lub produktów farmaceutycznych. W dobie rolnictwa ekologicznego wydaje się celowym zbadanie wpływu nadmiernej ilości jonów metali ciężkich w glebie na uprawę roślin stosowanych jako przyprawy. Zamierzeniem przedstawionej do oceny pracy jest zbadanie wpływu stresu abiotycznego wywołanego 1

2 obecnością w podłożu jonów niklu, miedzi i cynku na zawartość związków biologicznie czynnych, w tym białek alergennych, w roślinach przyprawowych bazylii pospolitej (Ocimum basilicum L.) oraz lebiodki pospolitej (Origanum vulgare L.). Doktorantka we wstępie rozprawy charakteryzuje mechanizmy pobierania metali ciężkich z gleby, ich akumulację oraz działanie i rolę związków chelatujących. Obszerną część wstępu stanowi omówienie toksyczności metali ciężkich i związany z nim wybuch oksydacyjny ze szczególnym uwzględnieniem toksyczności reaktywnych form tlenu. Autorka omawia mechanizm obrony antyoksydacyjnej tkanek roślinnych realizowany poprzez nieenzymatyczne i enzymatyczne składniki komórkowe. Doktorantka charakteryzuje wpływ jonów metali na zawartość chlorofilu oraz jednego z najistotniejszych, a ostatnio często badanych wyznaczników stresu, zmian zawartości proliny. Ostatnimi rozdziałami wstępu są charakterystyki wybranych przez doktorantkę metali niklu, miedzi i cynku oraz charakterystyki badanych roślin: bazylii pospolitej i lebiodki pospolitej. Ocena poprawności struktury pracy Przedstawiona do recenzji rozprawa doktorska liczy 140 stron i ma układ typowy dla prac eksperymentalnych. Rozprawa rozpoczyna się streszczeniem (po polsku i po angielsku), po nich następuje Wstęp liczący 28 stron, który wprowadza czytelnika w zakres badań opisanych w rozprawie. Po Wstępie Doktorantka zamieściła Cele pracy, opis Materiałów i Metod (25 stron), Wyniki i Dyskusję (60 stron), Wnioski, oraz Bibliografię (188 pozycji + 7 źródeł internetowych). Na końcu znajdują się spisy odczynników, tabel i rycin. Praca ilustrowana jest 65 rysunkami (rycinami) i 7 tabelami. Ocena merytoryczna rozprawy Cele pracy zostały przedstawione jasno sprecyzowane i zgodne z tematem rozprawy. Wyjaśniono, z jakich powodów analizowano materiał roślinny na obecność metali ciężkich. Objaśniono, dlaczego analizowano rośliny pod względem stężenia chlorofili, związków fenolowych, proliny, potencjału antyoksydacyjnego, stężenia nadtlenku wodoru oraz stopnia peroksydacji lipidów. Doktorantka argumentowała przyczyny analizowania badanych rośliny pod względem obecności białek alergennych. Autorka rozprawy postawiła hipotezę, iż zmiany stężeń metali ciężkich w glebie mogą wpływać na zawartość związków biologicznie czynnych zaangażowanych w neutralizowanie skutków stresu 2

3 abiotycznego, prowadząc do zmian jakościowych i ilościowych białek, w tym o właściwościach alergicznych. Materiały oraz metody zostały opisane w sposób szczegółowy w dwu oddzielnych rozdziałach i w sumie w dwudziestu podrozdziałach. Szczególnie starannie opisano metodykę oznaczania proliny, oznaczania antyoksydanów dwiema metodami, zawartości białka i związków fenolowych umieszczając odpowiednie krzywe wzorcowe. Opisano metodykę testu immunoezymatycznego ELISA, metodę oznaczania zawartości metali w tkance oraz elektroforezę w żelu akrylamidowym. Rozdział Wyniki i Dyskusja to bardzo dobrze oceniana przeze mnie część pracy. Opis przeprowadzonych doświadczeń jak i poprawne obserwacje oraz wnioski przeplatane fragmentami cytowanych obcych prac stanowią podstawę do przedyskutowania własnych rezultatów. Autorka umiejętnie konfrontuje uzyskane wyniki z rezultatami przedstawionymi w literaturze naukowej. W tym obszernym rozdziale doktorantka odwołuje się do wyników opisanych przez siebie doświadczeń podsumowując je oraz uzupełnia o analizę i komentarze. Oprócz wymienionych wcześniej oznaczeń potencjału antoksydacyjnego, związków fenolowych, nadtlenku wodoru i proliny doktorantka zastosowała nowoczesne precyzyjne metody próbując udowodnić założenia swej hipotezy badawczej. Szczególnie trafnie autorka wyjaśnia możliwe przyczyny zmian zawartości profilin i białka całkowitego w badanych roślinach w oparciu o dostępną literaturą. Do określenia stopnia alergenności roślin doktorantka przeprowadziła testy typu ELISA z zastosowaniem surowicy krwi pochodzącej od 18 pacjentów uczulonych na przyprawy. Testy te przeprowadzono z wykorzystaniem ekstraktów z badanych roślin i ponadto z mięty pieprzowej, kopru ogrodowego oraz pietruszki naciowej. Wydaje się interesującym, iż ekstrakty z bazylii i oregano wykazywały najniższą immunoreaktywność. Przeprowadzono także metodami elektroforetyczną oraz cieczowej chromatografii połączonej ze spektrometrią masową analizę białek oraz próby identyfikacji wybranych 3 ugrupowań białek otrzymanych na żelu akrylamidowym. Doktorantka zidentyfikowała na podstawie bazy danych zgodnie z sekwencją aminokwasów charakterystyczne białka oraz podjednostki białkowe. Autorka wykazała, że najistotniejszą pulę zidentyfikowanych podjednostek stanowiło Rubisco główne białko fazy ciemnej fotosyntezy i fotorespiracji. Zidentyfikowano także chloroplastową ATP syntazę oraz rybosomalne białko L14. Nie udała się doktorantce identyfikacja alergenów u bazylii i oregano hodowanych w glebie ze zwiększonymi stężeniami metali ciężkich. 3

4 Czytając rozdział Wnioski można się zorientować, że odpowiadają one na wyznaczone cele i znajdują pokrycie w przeprowadzonych eksperymentach i uzyskanych wynikach. Najważniejszy wniosek to wykazanie, że oba gatunki kumulują jony cynku, a ich wysokie stężenia hamują wzrost i rozwój roślin. Wszystkie jony badanych metali powodowały zmniejszenie zawartości chlorofili. Doktorantka stwierdziła, że głównie jony miedzi indukowały stres oksydacyjny. W przypadku bazylii pospolitej zwiększało się stężenie profilin i zmniejszała ilości białka całkowitego. Jednym z istotnych stwierdzeń zawartych we wnioskach jest wykazanie braku obecności analogów białek alergennych LPT oraz Bet v1 w tkankach badanych gatunków. Sugeruję, iż można by spróbować odpowiedzieć na pytanie, czy rośliny hodowane na glebie ze zwiększoną nieznacznie zawartością metali ciężkich mogą być wykorzystywane jako rośliny przyprawowe. Bibliografia zawiera pozycje przedstawiające zagadnienia związane z tematem pracy. Recenzent nie ma zastrzeżeń związanych z doborem prac. Cytowane prace są w ogromnej większości angielskojęzycznymi pozycjami z ostatnich kilku lat publikowanymi w renomowanych czasopismach. Ocena strony edytorskiej rozprawy Rozprawa została napisana poprawnym językiem polskim. Występują bardzo nielicznie błędy, które potocznie nazywa się literówkami. Dla przykładu przytoczę kilka takich jak: np. str. 6 dwudziesta drugi wiersz od góry (przesuniecie całego wiersza), str. 77 dziesiąty wiersz od góry (błąd w słowie spowodowała), str. 78 pierwszy wiersz od góry (błąd w słowie maniftować zapewne doktorantce chodziło o słowo manifestować). W tabelach umieszczono niejednolite oznaczenia s.m lub ś,m dotyczacej świeżej masy. Uwagi, pytania i zastrzeżenia: 1. Proszę o uściślenie sformułowania: strona 38 paragraf 7.4. Warunki uprawy roślin Przygotowane próby (każda w 4... powtórzeniach) zostały Dyskutując wyniki dotyczące zawartości nadtlenku wodoru i zmian stężenia MDA (wyznacznika peroksydacji lipidów) doktorantka przytacza pracę, w której za zmniejszenie zmian MDA i nadtlenku wodoru może odpowiadać wysoka aktywność peroksydaz i katalazy (strona ). Wielka szkoda, że takich oznaczeń w niniejszych badaniach nie wykonano. Oznaczenia te są proste i mało czasochłonne. Badania poszerzyłyby interpretację zmian po stresie spowodowanym skażeniem metalami. 3. W opisie analizy statystycznej doktorantka napisała, iż na diagramach występowanie 4

5 istotnych statystycznie różnic zaznaczono literami. Sądzę, że można było powtórzyć bezpośrednio przy wykresach tego typu krótkie objaśnienia. Tym bardziej byłoby to wskazane, iż wykresów jest dużo. 4. Rozdziały elektroforetyczne białek przedstawione na rycinie 64, jak się wydaje zostały wykonane oddzielnie. Osobno poddano elektroforezie próby badane i oddzielnie markery białkowe. Sądzę, że w przypadku prób opublikowania tak przedstawionych wyników (fotografia) w wysoko punktowanym czasopiśmie byłby to zarzut. 5. Uwaga ostatnia: we wnioskach końcowych, które w sposób bezpośredni uwydatniają otrzymane wyniki, jak się wydaje brakuje zdania podsumowującego odnośnie przydatności obu gatunków hodowanych w warunkach nieznacznie zwiększonej zawartości metali ciężkich. Wykracza to nieco poza zakres ocenianej pracy, ale pragnę zapytać: czy znane są doktorantce normy prawne na podstawie, których dopuszczany jest do sprzedaży materiał roślinny, taki jak przyprawy oraz jakie instytucje są upoważnione do sprawdzania w nim np. zawartości metali ciężkich. Podsumowanie recenzji Uważam, iż rozprawa doktorska Pani mgr Kamili Kulbat pt.: Zmiany zawartości związków biologicznie czynnych i alergenności roślin z rodziny Lamiaceae w odpowiedzi na stres abiotyczny wywołany obecnością metali ciężkich jest dziełem samodzielnym i stanowi oryginalne rozwiązanie problemów naukowych. Doktorantka w rozprawie wykazała się znajomością swojej tematyki badawczej, umiejętnością interpretacji i wyciągania wniosków z uzyskanych rezultatów. Wyniki otrzymane przez doktorantkę otwierają dalsze perspektywy badawcze i aplikacyjne, a przedłożona praca doktorska potwierdza umiejętność samodzielnego prowadzenia pracy naukowej. Przedstawione przeze mnie drobne uwagi i wątpliwości mają charakter polemiczny i nie umniejszają wartości naukowej rozprawy. Moja recenzja jest jak najbardziej pozytywna. W związku z powyższym stwierdzam, że przedstawiona do recenzji praca spełnia wszystkie wymogi ustawowe stawiane rozprawom doktorskim i wnoszę do Rady Naukowej Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej o dopuszczenie mgr Kamili Kulbat do dalszych etapów przewodu doktorskiego. 5