TEMAT ĆWICZENIA: ROZDZIELENIE MIESZANINY LEKÓW PSYCHOTROPOWYCH TECHNIKĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ

Transkrypt

1 POBLEMATYKA: Chromaograficzne rozdzielanie składników próbek TEMAT ĆWICZENIA: OZDZIELENIE MIESZANINY LEKÓW PSYCHOTOPOWYCH TECHNIKĄ WYSOKOSPAWNEJ CHOMATOGAFII CIECZOWEJ METODA: Wysokosprawna chromaografia cieczowa WPOWADZENIE Chromaografia jes fizykochemiczną meodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku ich różnego podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu chromaograficznego. Twórcą chromaografii jes rosyjski boanik M.S. Cwie, kóry zajmował się badaniem barwników liści i jako pierwszy je rozdzielił. W 1905 zosała opublikowana jego pierwsza praca doycząca chromaografii. Sopniowo zaczęły powsawać nowe rodzaje echnik chromaograficznych i zaczęo konsruować różnorodną aparaurę, co swarzało nowe możliwości i zwiększało zakres zasosowania chromaografii. Obecnie chromaografia jes jedną z najbardziej rozpowszechnionych meod insrumenalnych w chemii analiycznej, a w analizie związków organicznych zajmuje pozycję lidera. Zapewnia ona możliwość idenyfikacji subsancji oraz ich ilościowej analizy, nawe w niskich sężeniach w obecności innych związków. Klasyfikację echnik chromaograficznych można przeprowadzić według kilku kryeriów. W zależności od użyej fazy ruchomej chromaografię dzielimy na: gazową (ang. gas chromaography, GC), cieczową (liquid chromaography, LC), z fazą ruchomą w sanie nadkryycznym (supercriical fluid chromaography, SFC). W zależności od zasosowanej fazy sacjonarnej dosajemy nasępujące układy chromaograficzne: Faza ruchoma Faza sacjonarna gaz - ciecz (ang. gas-liquid chromaography, GLC) ciecz - ciecz (ang. liquid-liquid chromaography, LLC) gaz - ciało sałe (ang. gas-solid chromaography, GSC) ciecz - ciało sałe (ang. liquid-solid chromaography, LSC) Ze względu na naurę zjawiska sanowiącego podsawę procesu chromaograficznego chromaografię dzielimy na: adsorpcyjną, w kórej rozdzielanie odbywa się w wyniku różnego powinowacwa adsorpcyjnego składników mieszaniny do powierzchni fazy sacjonarnej, zwanej w ym przypadku adsorbenem, podziałową, w kórej rozdzielanie odbywa się w wyniku różnych warości współczynników podziału składników mieszaniny pomiędzy dwie nie mieszające się fazy, z kórych jedna jes fazą sacjonarną (ciecz osadzona na nośniku), a druga fazą ruchomą (gaz, ciecz, płyn w sanie nadkryycznym), jonowymienną, w kórej podsawą rozdzielania są różnice w sile oddziaływań międzycząseczkowych pomiędzy jonami próbki a jonami związanymi z fazą sacjonarną. Faza sacjonarna zwana jes joniem nierozpuszczalna subsancja wielkocząseczkowa o budowie jonowej zdolna do wymiany jonów zgodnie z równaniami reakcji: 1

2 (M - - Y + ) j + (X + ) r (M - - X + ) j + (Y + ) r (M -+ - Y - ) j + (X - ) r (M + - X - ) j + (Y - ) r Indeks j oznacza fazę joniu, indeks r fazę rozworu. Technika a sosowana jes przede wszyskim w analizach związków zjonizowanych lub ulegających jonizacji. Subsancje niejonowe można analizować po uprzednim przeprowadzeniu w kompleksy jonowe, siową (żelową, sączenie molekularne), w kórej o rozdzieleniu składników mieszaniny decydują rozmiary cząsek. Chromaografię można podzielić akże pod względem echniki eksperymenalnej chromaografia kolumnowa i planarna (możliwa ylko w układzie, w kórym fazą ruchomą jes ciecz). Schema podziału chromaografii przedsawiono na rysunku 1: ys.1. Klasyfikacja echnik chromaograficznych (Wikiewicz Z., Podsawy Chromaografii, WNT, Warszawa, 00) Możliwość rozdzielania chromaograficznego subsancji wynika z faku, że poszczególne składniki próbki w niejednakowym sopniu ulegają podziałowi między dwie nie mieszające się fazy, przy czym jedna z ych faz jes ruchoma (zw. eluen), a druga sanowi nieruchome wypełnienie kolumny chromaograficznej (faza sacjonarna). óżnica we współczynnikach podziału (K) składników mieszaniny pomiędzy fazę ruchomą i fazę sacjonarną warunkuje rozdzielenie ych subsancji. Jeżeli C s i C m oznaczają sężenia składnika odpowiednio w fazie sacjonarnej i ruchomej o współczynnik podziału jes równy ich ilorazowi (1). K=C s /C m (1) K jes wielkością charakeryzującą daną subsancję i zależy od fazy sacjonarnej. Między liczbą cząseczek związków chromaografowanych, obecnych w fazie ruchomej i nieruchomej, usala się równowaga dynamiczna. Nauralne przemieszczanie się subsancji rozdzielanych w kolumnie nasępuje ylko w fazie ruchomej, j. za pośrednicwem gazu nośnego (chromaografia gazowa) lub eluena (chromaografia cieczowa). Zaem większe warości K oznaczają dłuższy czas przebywania w fazie sacjonarnej (większe powinowacwo do fazy sacjonarnej) i sąd późniejsze opuszczenie kolumny, naomias e kóre mają większe powinowacwo do fazy ruchomej szybciej opuszczają kolumnę i mają niższą warość współczynnika podziału.

3 Wielkości reencyjne Efek rozdzielenia chromaograficznego wykreślony jes w posaci krzywej elucji (chromaogramu), przedsawiającego zależność sygnału analiycznego od czasu reencji lub objęości reencji. Czas reencji oznacza czas przebywania subsancji chromaografowanej w kolumnie. Całkowiy czas reencji,, subsancji chromaografowanej jes o czas od momenu zadozowania jej do kolumny do momenu zarejesrowania maksimum piku odpowiadającego ej subsancji. Czas en jes sumą czasu, w kórym subsancja oddziałuje na fazą sacjonarną i czasu, kóry jes jej porzebny do przejścia od momenu zadozowania do deekora gdyby akiego oddziaływania nie było. Dlaego eż, subsancja, kóra zupełnie nie oddziałuje z wypełnieniem fazy sacjonarnej wymaga skończonego czasu na przejście przez kolumnę od momenu wsrzyknięcia do pojawienia się sygnału na rejesraorze w posaci piku. Czas en definiowany jes jako zerowy czas reencji, 0, dawniej zwany eż marwym czasem reencji, M. Naomias czas oddziaływania subsancji na fazę sacjonarną nazywany jes zredukowanym czasem reencji, ', i jes równy różnicy całkowiego czasu reencji i zerowego czasu reencji (). Wielkości reencyjne przedsawiono na rysunku. ' = 0 () - 1 w 1 w ys.. Wielkości reencyjne chromaografowanych subsancji 1i, całkowiy czas reencji, M zerowy czas reencji, w szerokość piku przy podsawie. (W. Szczepaniak, Meody insrumenalne w analizie chemicznej, PWN, 00) Czas elucji jes funkcją prędkości fazy ruchomej i objęości eluena porzebnej do wymycia składnika z kolumny, zw. objęości reencji,v, (3) V =F* (3) przy czym F jes objęościową prędkością przepływu fazy ruchomej. Iloczyn czasu zerowego przez prędkość przepływu eluena daje analogicznie zerową warość objęość reencji V 0 (4). V 0 =F* 0 (4) Zerowa objęość reencji (V 0 ) nie przyczynia się w sposób bezpośredni do rozdziału i zależy od wymiarów kolumny i wypełnienia. Pewien udział w objęości fazy ruchomej mają eż dozowniki, deekory i łączniki. Sąd poszczególne udziały można określić jako zw. udziały kolumnowe i efeky pozakolumnowe. W chromaografii gazowej efeky pozakolumnowe można częso zaniedbać, naomias w chromaografii cieczowej nie można ich zlekceważyć. Z ego powodu szczególną uwagę należy zwrócić na konsrukcję deekorów i dozowników, aby miały jak najmniejszą objęość marwą. Wykorzysując zmierzone wielkości reencyjne, można wyznaczyć kolejne wielkości charakeryzujące rozdzielenie chromaograficzne. Jedną z nich jes współczynnik reencji k (5) (dawniej określany jako współczynnik pojemnościowy). Jes o sosunek czasu, w kórym 3

4 subsancja chromaografowana oddziałuje z wypełnieniem fazy sacjonarnej do czasu, w kórym przebywa ona w fazie ruchomej. Współczynnik k określa ile razy dłużej subsancja oddziałująca na fazę sacjonarną, przechodzi przez kolumnę niż gdyby akiego oddziaływania nie było (subsancja przebywałaby ylko w fazie ruchomej). ' 0 k = = (5) 0 0 Ogólne zasady rozdzielania Zrozumienie pojęcia rozdzielanie w chromaografii wymaga przede wszyskim ilościowego określenia sopnia rozdzielenia za pomocą zdolności rozdzielczej S. Tak jak powiedziano wcześniej rozdzielenie subsancji na kolumnie nasępuje na skuek ich zróżnicowanych prędkości migracji. To czy dana faza sacjonarna (lub rozpuszczalnik) może spowodować rozdzielenie subsancji, zależy od ermodynamicznych własności układu. Sprawność rozpuszczalnika można wyrazić ilościowo, posługując się reencją względną α (6) zwaną eż współczynnikiem selekywności lub współczynnikiem rozdzielania. K ' 0 α = = = = (6) ' K k1 k Sprawność fazy sacjonarnej określa współczynnik reencji, naomias sprawność kolumny chromaograficznej mierzy się dla danej subsancji liczbą pólek eoreycznych, N, w kolumnie. Pod pojęciem półki eoreycznej należy rozumieć najmniejszą objęość kolumny, w kórej zosaje osiągnięy san równowagi pomiędzy sężeniem analiu w fazie ruchomej i sacjonarnej. Półki eoreyczne są pojęciem umownym, ponieważ kolumna nie zawiera niczego, co mogłoby przypominać fizyczne półki desylacyjne czy inne podobne elemeny. Zależność (7) podaje jeden ze sposobów wyznaczenia liczby półek eoreycznych, przy założeniu że pik pochodzący od subsancji ma kszał krzywej Gaussa. N = 16 w Częso podawana jes efekywna liczba pólek eoreycznych (8), gdzie udział efeków pozakolumnowych na jej warość zosał zminimalizowany (7) N ef = (8) w Wysokość równoważna półce eoreycznej, HETP (ang. heigh equivalen o a heoreical plae), jes zdefiniowana za pomocą równania 9. Pod pojęciem HETP należy rozumieć najmniejszą wysokość kolumny, w kórej zosaje osiągnięy san równowagi pomiędzy sężeniem subsancji chromaografowanej w fazie ruchomej i sacjonarnej. L HETP = (9) N Zdolność rozdzielczą pików, S, wyznaczamy w oparciu o równanie (10). Zazwyczaj podaje się zdolność rozdzielczą dla dwóch składników, kóre są najmniej dobrze rozdzielone. Zdolność rozdzielcza dla pozosałych par składników jes ak samo dobra o ile nie lepsza jak a podana. 4

5 1 = S (10) w1 + w ozdzielczość, S, można wyrazić za pomocą współczynnika reencji (k), współczynnika selekywności (α) i liczby pólek eoreycznych (N). Zależność ą opisuje równanie (11), przy czym indeks doyczy składnika dłużej zarzymywanego na kolumnie. S = 1 4 α 1 α k 1+ k * N (11) APAATUA Do wykonania analiz echniką chromaografii cieczowej kolumnowej służy chromaograf cieczowy. Schema blokowy chromaografu cieczowego przedsawiono na rysunku 3. ys.3. Schema blokowy chromaografu cieczowego (1- zbiornik fazy ruchomej, -filr, 3-pompa, 4-manomer, 5-dozownik, 6-kolumna, 7-ermosa, 8-deekor, 9-wzmacniacz, 10-kompuer, 11-auomayczny podajnik próbek, 1-kolekor frakcji) (W. Szczepaniak, Meody insrumenalne w analizie chemicznej, PWN, 00) Ze zbiornika lub zbiorników pompą łoczy się do kolumny, wypełnionej faza sacjonarną, fazę ruchomą. Kolumna zazwyczaj jes umieszczona w ermosacie w celu urzymania sałej emperaury w procesu separacji. Między pompą a kolumną znajduje się dozownik, kóry umożliwia wprowadzenie próbki do układu. Na kolumnie składniki próbki są rozdzielane i na wyjściu z niej są wykrywane przez deekor. Sygnał elekryczny z deekora jes rejesrowany za pomocą kompuera lub już coraz rzadziej - inegraora w posaci piku chromaograficznego. Pompy Pompa w chromaografie cieczowym zapewnia przepływ fazy ruchomej przez wypełnienie kolumny, kóre sawia duży opór. Paramery, kóre ważne są przy konsruowaniu pomp o: zakres objęościowego wydaku, maksymalne ciśnienie robocze, odwarzalność wydaku objęościowego, zakres pulsacji wydaku. Obecnie używane są pompy sałociśnieniowe i sałoprzepływowe. Pompy sałoprzepływowe używane są znacznie częściej ze względu na urzymanie sałej prędkości przepływu niezależnie od składu fazy ruchomej. Ich 5

6 główną wadą jes możliwość pulsacji co skukuje zmianami w linii podsawowej chramaogramu i możliwość spadku czułości deekora. Ciśnienie, kóre jes wywarzane przez pompę łokową (rodzaj pompy sałoprzepływowej) może wynosić nawe 50 MPa. Dozownik Dozownik pozwala na wprowadzenie próbki pod ciśnieniem amosferycznym do kolumny gdzie ciśnienie może sięgać kilkudziesięciu MPa. W chromaografii niskociśnieniowej podobnie jak w chromaografii gazowej używane są dozowniki membranowe. W wysokociśnieniowej chromaografii cieczowej w celu wprowadzenia próbki do kolumny skonsruowano zawory dozujące z pęlami dozującymi o różnej objęości. Próbka do pęli dozującej jes wprowadzana za pomocą srzykawki. Możliwe jes auomayczne podawanie próbek do kolumny za pomocą auomaycznego podajnika próbek. Kolumny i ich wypełnienie Kolumna jes o rurka, wykonana ze sali nierdzewnej, rzadziej ze szkła czy polimerów, zakończona filrami i zaoparzoną w końcówki umożliwiające podłączenie do deekora i dozownika. Wewnąrz rurki znajduje się faza sacjonarna, dzięki kórej możliwy jes proces rozdzielania. Długość kolumny nie przekracza 5 cm, obecnie coraz częściej sosowane są kolumny krósze 10 cm, 15 cm. Średnica kolumny zazwyczaj wynosi 4,6 mm ale używane są eż o innych średnicach np. 1 mm czy 3,5 mm. Wybór paramerów kolumny decyduje o paramerach rozdzielenia np. liczbie pólek eoreycznych. Jednak dużo ważniejszy jes odpowiednie dobranie wypełnienia kolumny, kóre warunkuje rozdzielenie składników próbki. Jako fazy sacjonarne w chromaografii adsorpcyjnej sosowane są sorbeny powierzchniowoporowae, jak również zapewniające wyższą sprawność i pojemność sorpcyjna sorbeny objęościowo-porowae. Wypełnienia mogą mieć różny sopień polarności. Jeżeli faza sacjonarna jes polarna o wedy faza ruchoma powinna być od niej mniej polarna. Faza ruchoma (eluen) Wybór odpowiedniej fazy ruchomej decyduje o powodzeniu procesu rozdzielania. Fazę ruchomą może sanowić pojedynczy rozpuszczalnik albo mieszanina dwóch lub rzech rozpuszczalników. ozpuszczalniki sosowane w wysokosprawnej chromaografii cieczowej muszą spełniać szereg wymagań. Powinny charakeryzować się wysoką czysością, powinny być rwałe w warunkach procesu chromaograficznego, nie mogą wchodzić w reakcje ze składnikami próbki jak i z fazą sacjonarną, muszą umożliwiać deekcje składników próbki. Skład eluenu podczas procesu chromaograficznego może być sały mówimy wedy o elucji izokraycznej albo może nasępować skokowa lub sała zmiana składu eluenu w czasie rwania analizy. Taki sposób prowadzenia procesu chromaograficznego nosi nazwę elucji gradienowej i pozwala na modyfikacje siły elucyjnej eluenu w rakcie analizy co może prowadzić do poprawy jakości rozdzielenia składników próbki. Deekory Za pomocą deekora wykrywane są subsancje opuszczające kolumnę. W chromaografii cieczowej sosuję się różne deekory umożliwiające wykrycie badanych związków np. deekor fluorescencyjny, deekor z marycą diod, deekory elekrochemiczne. Deekory powinny charakeryzować się dużą czułością zn. sygnał pochodzący od wykrywalnego składnika powinien być jak największy. Ilościowo czułość deekora opisuje sosunek przyrosu sygnału do przyrosu sężenia. Deekor charakeryzuje akże granica wykrywalności, kóra sanowi najniższe sężenie składnika jakie deekor jes w sanie wykryć. Deekor powinien charakeryzować się dużą sabilnością linii podsawowej na chromaogramie oraz sygnał z deekora musi być odwarzalny dla akich samych ilości oznaczanych subsancji. Kolejną cecha charakeryzującą deekor jes zakres jego liniowości, kóry powinien być szeroki. 6

7 LITEATUA OBOWIĄZUJĄCA 1. W. Szczepaniak, Meody insrumenalne w analizie chemicznej, PWN, 004, sr.55-69, Z. Wikiewicz, Podsawy chromaografii, WNT, 00, sr , ZAGADNIENIA DO KOLOKWIUM 1-4. Wyjaśnij pojęcia (każdy suden będzie musiał zdefiniować na kolokwium dwa z pośród wymienionych pojęć): a. chromaografia b. całkowiy czas reencji c. zerowy czas reencji d. zredukowany czas reencji e. objęość reencji f. współczynnik reencji g. współczynnik selekywności h. wysokość równoważna półce eoreycznej i. szereg eluoropowy j. eluen k. faza sacjonarna l. moc elucji m. chromaogram n. chromaografia w normalnym układzie faz o. chromaografia w odwróconym układzie faz 5. Jakie wymagania muszą spełniać rozpuszczalniki używane jako fazy ruchome w chromaografii cieczowej? 6. Wymień deekory sosowane w chromaografii cieczowej i wyjaśnij zasadę działania dwóch wybranych. 7. Wymień kolejno elemeny chromaografu cieczowego i wyjaśnij jakie zadanie spełniają.. 8. Dokonaj podziału meod chromaograficznych ze względu na sosowane układy faz. Jakie zjawisko sanowi podsawę procesu chromaograficznego w danym układzie faz Techniką HPLC rozdzielano subsancję A, B, C na kolumnie o długości 0 cm. Przepływ fazy ruchomej wynosił 0,5 ml*min -1. Czasy reencji pików i szerokości pików w wynoszą: Subsancja [min] w [min] A 5,4 0,4 B 13,4 0,8 C 16, 1 0,0 Oblicz: a) liczbę półek eoreycznych, N b) współczynnik reencji, k (dla składnika B) c) zdolność rozdzielczą dla pików A i B d) współczynnik selekywności, α 7

8 CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jes rozdzielenie mieszaniny leków psychoropowych (amirypylina, norrypylina, imipramina, dezypramina) oraz ich analiza ilościowa. PZYZĄDY, NACZYNIA, ODCZYNNIKI wysokosprawny chromaograf cieczowy, LaChrom, Merck, USA kolumna P SelecB o długości 1,5 cm, średnicy 4,6 mm, średnica ziarna 5 µm aceoniryl bufor fosforanowy ph=7,1 (10mM K HPO 4 ) meanolowe rozwory poszczególnych leków (sężenie 1mg/ml) meanolowy rozwór lorazepamu o sężeniu 10mg/ml (wzorzec wewnęrzny) SPOSÓB WYKONANIA Przygoować rozwór lorazepamu o sężeniu 0,5 mg/ml w mieszaninie aceonirylu i buforu fosforowego ph=7,1 (1:1 v/v) Przygoować próbkę zawierającą wzorce badanych leków w sężeniu 5µg/ml. (Pobrać do fiolki 5µl każdego rozworu leku psychoropowego o sężeniu 1mg/ml, odparować do sucha, rozpuścić w 1ml przygoowanego rozworu lorazepamu). Przygoować próbki wzorców leków o sężeniach,5 µg/ml oraz 1,5 µg/ml poprzez kolejne rozcieńczenia rozworu wyjściowego o sężeniu 5µg/ml. Przeprowadzić analizę chromaograficzną wzorców sosując program elucji gradienowej, prędkość przepływu fazy ruchomej ml/min, objęość próbki wprowadzonej do kolumny 10µl. Czas[min.] Faza wodna (%) Aceoniryl (%) Przeprowadzić analizę chromaograficzną próbki orzymanej od asysena sosując e same warunki chromaograficzne co przy analizie wzorców. Zidenyfikować rozdzielane związki w próbkach wzorców leków poprzez porównanie widm adsorpcyjnych w zakresie UV subsancji wzorcowych oraz sporządzić wykres krzywej kalibracyjnej. Zidenyfikować subsancje w próbce oraz podać ich sężenie. OPACOWANIE APOTU Na podsawie zarejesrowanych chromaogramów wyznaczyć paramery opisujące układ chromaograficzny: selekywność (α), zdolność rozdzielczą s, sprawność kolumny (HETP, N). Dokonać idenyfikacji subsancji w analizowanej próbce i ich analizy ilościowej (wykreślić krzywe kalibracyjne dla poszczególnych leków). 8