ROZDZIAŁ 14 LIPIDY. Jan Gmiński. Dorota Polańska

Transkrypt

1 ROZDZIAŁ 14 LIPIDY Jan Gmiński Dorota Polańska Związki tłuszczowe osocza, jako nierozpuszczalne w wodzie transportowane są w kompleksie z białkami tworząc lipoproteiny. Wyjątkiem są wolne kwasy tłuszczowe przenoszone w osoczu przez albuminy. Lipoproteiny stanowią heterogenną grupę cząstek różniących się składem lipidowym, białkowym, miejscem syntezy i metabolizmem. Podstawą klasyfikacji lipoprotein jest rozdział metodą ultrawirowania (tab. 1) lub elektroforezy (tab. 2). Tabela 1. Frakcje lipoprotein osocza uzyskane metodą ultrawirowania. chylomikrony lipoproteiny o bardzo małej gęstości (VLDL) lipoproteiny o pośredniej gęstości (IDL) lipoproteiny o małej gęstości (LDL) lipoproteiny o dużej gęstości (HDL) Tabela 2. Frakcje lipoprotein rozdzielone metodą elektroforezy. chylomikrony β-lipoproteiny pre-β-lipoproteiny α-lipoproteiny Co raz częściej wykorzystuje się metodę opartą na spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), pozwalającą rozdzielić poszczególne frakcje lipoprotein na podfrakcje oraz określić nie tylko stężenie cholesterolu poszczególnych podfrakcji, ale także ilość cząsteczek lipoprotein oraz ich wielkość. 215

2 Dane te znacznie lepiej odzwierciedlają ryzyko wieńcowe pacjenta niż do tej pory stosowany panel badań lipidowych. Głównym składnikiem lipidowym LDL i HDL jest cholesterol, a chylomikronów i VLDLi triglicerydy. Cząstki LDL transportują cholesterol do wątroby i tkanek pozawątrobowych, gdzie podlega dalszym przemianom, natomiast HDL uczestniczy w zwrotnym transporcie cholesterolu z tkanek obwodowych do wątroby. Triglicerydy zawarte w chylomikronach są pochodzenia pokarmowego, natomiast występujące w VLDL są syntetyzowane w wątrobie. Zainteresowanie badaniami diagnostycznymi w zakresie gospodarki lipidowej spowodowane jest powiązaniami doświadczalnymi, epidemiologicznymi i klinicznymi między podwyższonym stężeniem cholesterolu i triglicerydów w osoczu a nasileniem procesu miażdżycowego. Miażdżyca tętnic jest morfologicznym podłożem chorób układu krążenia (choroba niedokrwienna serca, zawał mięśnia sercowego, udar mózgu), które są główną przyczyną zgonów w krajach rozwiniętych ekonomicznie. Najistotniejszymi lipidowymi czynnikami ryzyka choroby niedokrwiennej serca jest podwyższenie stężenia cholesterolu frakcji LDL i obniżenie we frakcji HDL. Częstość zaburzeń biochemicznych w zakresie przemian lipidowych jest bardzo wysoka. Wg badania Pol-MONICA przeprowadzonego przy współpracy z WHO 2/3 dorosłej populacji w naszym kraju ma podwyższone wartości stężeń cholesterolu i/lub triglicerydów. Badania laboratoryjne oceniające gospodarkę lipidową mają różną przydatność diagnostyczną, dostępność i koszt wykonania (tab. 3). Tabela 3. Badania laboratoryjne gospodarki lipidowej Podstawowe cholesterol całkowity trójglicerydy cholesterol HDL cholesterol LDL Uzupełniające test zimnej flotacji elektroforeza lipoprotein Specjalistyczne Lp(a) apob apoai fenotyp apoe profil LDL enzymy: LCAT, LPL, HTGL, CETP badania genetyczne 216

3 W zasięgu możliwości lekarza podstawowej opieki zdrowotnej jest wykonanie podstawowych. Są one tanie, dostępne i pozwalają w większości przypadków postawić prawidłowe rozpoznanie i wdrożyć właściwe leczenie. Najczęstszym błędem uniemożliwiającym prawidłową interpretację uzyskanego wyniku jest niewłaściwe przygotowanie pacjenta do badania, opieranie się na jednorazowym oznaczeniu i wreszcie nieuwzględnienie przeciwwskazań do przeprowadzenia diagnostyki (tab. 4). Tabela 4. Zasady diagnostyki układu lipidowego. A. Przygotowanie pacjenta 16 godzinna dieta 0 stabilna masa ciała B. Wykonanie badania 2-3 razy w dostępach dni stosowanie identycznej diety C. Przeciwwskazania (uzyskany wynik jest niediagnostyczny) ostra faza zawału mięśnia sercowego ostre stany zapalne niewyrównane zaburzenia endokrynologiczne stosowanie leków wywołujących zaburzenia lipidowe ciąża Oznaczając stężenia poszczególnych frakcji cholesterolu należy pamiętać, że wymagane są co najmniej dwa oznaczenia, aby średnia z tych oznaczeń nie odbiegała o więcej niż 10% od rzeczywistego stężenia badanego parametru lipidowego u pacjenta. Według ESC pomiar parametrów lipidowych ze względu na ich dużą zmienność należy wykonać trzykrotnie, przy czym badanie powinno być wykonane na czczo. U pacjentów z ostrymi epizodami wieńcowymi i zawałem serca badanie układu lipidowego można wykonać do 24 godzin od wystąpienia objawów, lub po 12 tygodniach. Należy jednak pamiętać, że nawet do 3 miesięcy po ostrym incydencie wieńcowym lub zabiegu kardiochirurgicznym stężenie cholesterolu może być zaniżone, natomiast trójglicerydów podwyższone. Na podstawie uzyskanych wyników stężenia cholesterolu całkowitego, triglicerydów i cholesterolu frakcji HDL dokonuje się obliczenia stężenia cholesterolu LDL ze wzoru Friedewalda (tab. 5). Ograniczeniem jego stosowalności jest stężenie triglicerydów przekraczające 450 mg/dl (5,0 mm), co zdarza się bardzo rzadko. Wówczas zachodzi konieczność bezpośredniego oznaczenia stężenia cholesterolu LDL. 217

4 Tabela 5. Wzór Friedewalda cholesterol LDL (mg/dl) = cholesterol całkowity (mg/dl) cholesterol HDL (mg/dl) [triglicerydy (mg/dl) : 5] cholesterol LDL (mm) = cholesterol całkowity (mm) cholesterol HDL (mm) [triglicerydy (mm) : 2,2] Hiperlipoproteinemie są heterogenną grupą zaburzeń przemian lipidów, w których dochodzi do wzrostu stężenia cholesterolu lub triglicerydów w osoczu. Najbardziej przydatnym dla lekarza praktyka jest kliniczny podział hiperlipoproteinemii dokonany przez Europejskie Towarzystwo Miażdżycowe (EAS) (tab. 6). Tabela 6. Klasyfikacja hiperlipoproteinemii wg EAS Typ zaburzenia Stężenie cholesterolu Stężenie triglicerydów całkowitego hipercholesterolemia > 200 mg/dl < 200 mg/dl hipertriglicerydemia < 200 mg/dl > 200 mg/dl (>150 mg/dl)* hiperlipidemia > 200 mg/dl > 200 mg/dl (>150 mg/dl)* mieszana * wg NCEP ATP III (2004) Wiele badań, zarówno eksperymentalnych, jaki i epidemiologicznych i klinicznych wskazuje, że najistotniejszym czynnikiem odpowiedzialnym za rozwój miażdżycy tętnic i jej powikłań jest cholesterol LDL. Co więcej, obniżenie jego stężenia wiąże się z redukcją ryzyka wystąpienia CHD (ang. coronary heart disease choroba wieńcowa). Dlatego czynnikiem decydującym o rozpoczęciu terapii hipolipemizującej jest stężenie cholesterolu LDL. Według NCEP ATP III u osób powyżej 20 r.ż. powinno się co 5 lat wykonywać panel lipidowy obejmujący oznaczanie stężenia: cholesterolu całkowitego (TCh), LDL, HDL oraz trójglicerydów (TG). Powyższe badanie screeningowe powinno być wykonywane na czczo. Alternatywnie jeśli mamy do dyspozycji precyzyjne metody oznaczania HDL, badanie screeningowe możemy oprzeć na oznaczaniu TCh i HDL (na czczo lub po posiłku). Samo oznaczanie TCh nie może być wykorzystywane jako badanie screeningowe. W przypadku kiedy TCh>200mg/dl lub HDL<40mg/dl należy wykonać ponowne pełne badanie lipidogramu na czczo. Oznaczanie LDL lub TCh w połączeniu z HDL niesie podobną wartość diagnostyczną, a ponieważ oznaczanie LDL jest kosztowniejsze, a pacjent musi być na czczo, badania screeningowe można oprzeć na oznaczaniu TCh+HDL. 218

5 Badania screeningowe zaleca się u wszystkich osób powyżej 20 r.ż., a szczególnie u osób z podwyższonym ryzykiem CHD: cukrzycą jeśli u ojca choroba wieńcowa wystąpiła <50 r.ż., a u matki <60 r.ż z wywiadem rodzinnym sugerującym rodzinną hiperlipidemię z wieloma czynnikami ryzyka. Wg ESC dobrym parametrem odzwierciedlającym ryzyko wieńcowe jest stosunek LDL/HDL, jednakże, kiedy stężenie LDL wyliczamy ze wzoru Friedewalda lepszym parametrem jest stosunek TCh/HDL (ze względu na błędy oznaczania HDL przenoszące się na wyliczone ze wzoru stężenie LDL). Stosunek TCh/HDL>5 świadczy o zwiększonym ryzyku wieńcowym. Każda osoba z podwyższonym stężeniem cholesterolu LDL lub inną postacią hiperlipidemii powinna przed rozpoczęciem terapii hipolipemizującej mieć wykonane badania wykluczające wtórne przyczyny zaburzeń lipidowych. Najczęstsze przyczyny wtórnych hiperlipidemii: cukrzyca niedoczynność tarczycy choroby wątroby przewlekła niewydolność nerek leki zwiększające stężenie cholesterolu LDL i zmniejszające stężenie cholesterolu HDL (progestageny, sterydy anaboliczne, kortykosterydy) zapalenie trzustki zespół Cushinga ciąża Po wykluczeniu przyczyn wtórnych należy jeśli to konieczne wdrożyć leczenie mające na celu osiągnięcie docelowego stężenia cholesterolu wg tabeli 8. Tabela 7. Klasyfikacja zaburzeń lipidowych wg ATP III (wartości wyrażone w mg/dl) Cholesterol LDL <100 optymalny bliski optymalnego/powyżej optymalnego granicznie wysoki wysoki 190 bardzo wysoki Cholesterol całkowity <200 pożądany granicznie wysoki 240 wysoki Cholesterol HDL <40 niski 60 wysoki Hipertriglicerydemia jest niezależnym czynnikiem ryzyka choroby niedokrwiennej serca. Szczególne znaczenie przypada tu cząstkom VLDL i ich remnantom bogatym w apob 100. Tego rodzaju zaburzenie ma najczęściej charakter wtórny i towarzyszy insulinooporności. Stwierdzane wówczas stężenie triglicerydów jest umiarkowanie podwyższone, nie przekraczając wartości 400 mg/dl. Wysoka hipertriglicerydemia 219

6 (>1000 mg/dl) jest najczęściej spowodowana kumulacją chylomikronów wskutek zaburzeń enzymatycznych ich hydrolizy (lipaza lipoproteinowa) i wiąże się ze zwiększonym ryzykiem ostrego zapalenia trzustki. Trójglicerydy < 150 mg/dl prawidłowe mg/dl umiarkowanie wysokie mg/dl wysokie > 500 mg/dl bardzo wysokie Interpretując wynik badania lipidowego należy wziąć pod uwagę możliwy błąd oznaczenia wynikający ze stosowanej metody oznaczania. Wg NCEP dopuszczalny błąd całkowity dla pojedynczej próbki powinien być mniejszy niż: TCh<8,9%, HDL<13%, LDL<12%, w przypadku LDL oznaczanego metodami precyzyjnymi <4%. O ile stężenie cholesterolu całkowitego i triglicerydów jest podstawą rozpoznania hiperlipoproteinemii, to monitorowanie skuteczności leczenia dokonuje się w oparciu o stężenie cholesterolu frakcji LDL. Docelowe stężenie cholesterolu LDL (tab. 8) zależy od typu prewencji oraz występowania innych czynników ryzyka choroby niedokrwiennej serca (tab. 10). Tabela 8. Docelowe stężenie cholesterolu LDL wg Narodowego Programu Edukacji Cholesterolowej III Panelu Leczenia Dorosłych (NCEP ATP III 2001). CHD lub ekwiwalenty CHD <100 mg/dl Wiele (>2) czynników ryzyka, 10-letnie ryzyko <20% <130 mg/dl 0 lub 1 czynnik ryzyka <160 mg/dl Tabela 9. Pożądane stężenia lipidów wg ESC (wartości wyrażone w mg/dl) Osoby bez CVD i cukrzycy (prewencja pierwotna) Cholesterol całkowity <190 LDL <115 Osoby z CVD lub cukrzycą (prewencja wtórna) Cholesterol całkowity <175 LDL <100 Zwiększone ryzyko CVD Kobiety <40 HDL Mężczyźni <46 Triglicerydy >150 Tabela 10. Główne czynniki ryzyka modyfikujące cele terapii palenie papierosów nadciśnienie ( 140/90 mmhg lub leczenie przeciwnadciśnieniowe) niski cholesterol HDL (<40 mg/dl) rodzinnie wcześnie występująca choroba wieńcowa (u krewnego pierwszego stopnia płci żeńskiej <55 r.ż.; męskiej <65 r.ż) wiek (mężczyźni 45 r.ż.; kobiety 55 r.ż.) 220

7 1 0 Oprócz cholesterolu LDL na ryzyko CHD wpływ ma wiele innych czynników, z których najistotniejsze zostały wymienione w tabeli 10. Oprócz czynników ryzyka wyróżniamy tzw. ekwiwalenty choroby wieńcowej, które zostały przedstawione w tabeli 11. W tych przypadkach ryzyko 10-letnie wystąpienia CHD, wg predyktorów opartych na badaniu Framingham, jest większe od 20%. Tabela 11. Ekwiwalenty choroby wieńcowej: cukrzyca inne manifestacje kliniczne miażdżycy: miażdżyca tętnic obwodowych tętniak aorty brzusznej miażdżyca tętnic wieńcowych W chwili opracowywania NCEP ATP III nie było dowodów iż obniżanie LDL poniżej podanych 100mg/dl u pacjentów szczególnie wysokiego ryzyka CHD przynosi dalsze korzyści kliniczne. Obecnie po opublikowaniu nowych badań klinicznych, m.in. HPS (ang. Heart Prevention Study), PROVE-IT TIMI 22 (ang. Pravastatin or Atorvastatin Evaluation and Infection Therapy) oraz REVERSAL (ang. Reversal of Atherosclerosis with Aggressive Lipid Lowering) wydaje się, iż zależność ryzyka wieńcowego od stężenia LDL jest liniowa i nie ma żadnego progu poniżej którego pacjent nie odnosiłby dalszych korzyści klinicznych jest to tzw. linearyzowany model redukcji ryzyka wieńcowego (ryc. 1). Podsumowaniem tego jest zasada im niżej tym lepiej Ryzyko względne CHD (Skala logarytmiczna) Grundy SM et al. Circulation 2004;110: LDL-C (mg/dl) Ryc. 1. Wyniki badań HPS i PROVE-IT TIMI 22 pokazują, że nie ma dolnej granicy stężenia LDL poniżej której pacjenci nie odnosiliby korzyści z dalszej redukcji stężenia LDL. Do takiej intensywnej terapii hipolipemizującej (LDL<70mg/dl) kwalifikują się pacjenci o szczególnie dużym ryzyku wieńcowym (tab. 12). 221

8 Tabela 12. Pacjenci bardzo dużego ryzyka kwalifikujący się do obniżania LDL<70mg/dl: ustalone rozpoznanie choroby wieńcowej i: wiele czynników ryzyka (szczególnie cukrzyca) poważne i słabo kontrolowane czynniki ryzyka (np. palenie papierosów) zespół metaboliczny (wysokie trójglicerydy, niskie HDL) ostry zespół wieńcowy Tabela 13. Docelowe stężenie cholesterolu LDL wg Narodowego Programu Edukacji Cholesterolowej III Panelu Leczenia Dorosłych (NCEP ATP III 2004) z uwzględnieniem wyników badań HPS i PROVE-IT TIMI 22. Pacjenci o bardzo wysokim ryzyku (tab. 12) <70 mg/dl CHD lub ekwiwalenty CHD <100 mg/dl Wiele (>2) czynników ryzyka, 10-letnie ryzyko <20% <130 mg/dl 0 lub 1 czynnik ryzyka <160 mg/dl Spośród badań uzupełniających istotne znaczenie praktyczne ma elektroforeza lipoprotein osocza na żelu agarozowym. Uzyskany elektroforegram jest podstawą klasyfikacji fenotypowej hiperlipoproteinemii (tab. 14). Podział ten został wprowadzony przez Fredricksona w 1967 roku, a w 3 lata później WHO zmodyfikowała go, dokonując wyodrębnienia podtypu IIa i IIb. Tabela 14. Fenotypowa klasyfikacja hiperlipoproteinemii. Typ Elektroforeza I chylomikrony IIa b-lipoproteiny IIb b- i pre-b-lipoproteiny III b-vldl IV pre-b-lipoproteiny V chylomikrony i pre-b-lipoproteiny Elektroforeza lipoprotein osocza jest szczególnie przydatna w rozpoznawaniu hiperlipoproteinemii typu III, tzw. choroby szerokiego prążka (ze względu na obraz elektroforetyczny). Zaburzenie to klasyfikowane jest wg podziału klinicznego jako hiperlipidemia mieszana. Związane jest z nieprawidłową izoformą apolipoproteiny E (E 2 /E 2 ) i mimo normalnego lub obniżonego stężenia cholesterolu LDL związane jest z podwyższonym ryzykiem choroby niedokrwiennej serca. Mimo, iż elektroforeza lipoprotein osocza jest badaniem technicznie prostym z niezrozumiałych względów wykonuje się ją rzadko. Przybliżony wgląd w fenotypowy podział hiperlipoproteinemii można uzyskać wykonując test zimnej flotacji (test lodówkowy). Polega on na umieszczeniu osocza w temp. 4 o C na okres godzin, a następnie ocenie jego wyglądu. Nawet bardzo wysokie stężenie cholesterolu nie powoduje zmian w przejrzystości próbki. Triglicerydy zawarte w VLDL powodują zmętnienie osocza od lekkiej opalescencji do barwy mleczno białej w miarę wzrostu stężenia. Chylomikrony lokalizują się na powierzchni, jako biały kożuch (tab. 14). 222

9 Tabela 15. Test zimnej flotacji. Typ hiperlipoproteinemii I IIa IIb III IV V Wygląd osocza przejrzyste, kożuch przejrzyste opalescencja zmętnienie, delikatny kożuch zmętnienie zmętnienie, kożuch 223

10 ĆWICZENIA PRAKTYCZNE ĆWICZENIE 1. OZNACZANIE STĘŻENIA CHOLESTEROLU METODĄ ENZYMATYCZNĄ Zasada metody Oznaczanie stężenia cholesterolu przeprowadza się przy wykorzystaniu reakcji enzymatycznych z udziałem esterazy i oksydazy cholesterolowej oraz metody Trindera (peroksydaza/fenol/4-aminoantypiryna), w której zastąpiono fenol jego substytutem (sulfonian p-hydroksybenzenowy) nie wykazującym właściwości żrących. estry cholesterolu esteraza cholesterol + kwasy tłuszczowe oksydaza CHOLESTEROL + O 2 4 -CHOLESTENON + H 2 O 2 peroksydaza 2H 2 O aminoantypiryna barwnik chinonominowy + p-hbs + 2H 2 O Powstające czerwone zabarwienie mierzone przy długości fali 520 nm jest proporcjonalne do stężenia cholesterolu całkowitego. MATERIAŁ BADANY Surowica Odczynniki 1. Wzorzec cholesterolu o stężeniu 200 mg/dl 2. Odczynnik do oznaczania cholesterolu o składzie: 4-aminoantypiryna 0,6 mm cholan sodowy 8,0 mm esteraza cholesterolowa >1500 U/I peroksydaza chrzanowa 1500 U/I oksydaza cholesterolowa > 200 U/I sulfonian p-hydroksybenzenowy (p-hbs) 20 mm 224

11 bufor ph 7,2 ±0,1 azydek sodowy 0,01 % nieaktywne stabilizatory Wykonanie Oznaczenie wykonać według schematu: Składnik odczynnik do oznaczania cholesterolu Próba próby wzorcowa - W badana - B odczynnikowa - O 1 ml 1 ml 1 ml Inkubacja w temp. 37 C przez 5 min. wzorzec 10 µl - - surowica - 10 µl - H 2 O dest µl Inkubacja w temp. 37 C przez 5 min. Odczytać absorbancję próby wzorcowej i badanej względem próby odczynnikowej przy długości fali 520 nm. Obliczenia Stężenie cholesterolu oblicza się z wzoru: cholesterol mg /dl = A B A W st. wzorca mg /dl Uwagi Oznaczenie cholestrolu powinno być wykonywane w wolnej od hemolizy surowicy krwi. Cholesterol jest stabilny w surowicy przez 7 dni w temp. pokojowej (18-25 C) lub 6 miesięcy po zamrożeniu (temp. -20 C). ĆWICZENIE 2. OZNACZANIE STĘŻENIA CHOLESTEROLU FRAKCJI HDL Zasada metody Metoda oznaczania lipoprotein o dużej gęstości (HDL) polega na selektywnym wytrącaniu frakcji o niskiej gęstości (LDL i VLDL). Prezentowana metodyka opiera się na wykorzystaniu glikolu polietylenowego jako odczynnika wytrącającego. Otrzymany w wyniku wirowania supernatant, zawierający jedynie frakcję HDL stanowi materiał do oznaczania stężenia cholesterolu metodą enzymatyczną. 225

12 MATERIAŁ BADANY Surowica Odczynniki Wzorzec HDL o stężeniu 50mg/dl Odczynnik wytrącający 20% w/v glikol polietylenowy w buforze glicynowym o ph 10 Wykonanie Oznaczenie wykonać wg schematu: Separacja frakcji HDL Składnik Próba próby wzorcowa - W 1 badana - B 1 surowica - 0,5 ml wzorzec HDL 0,1 ml - odczynnik wytrącający 0,1 ml 0,5 ml Dokładnie wymieszać przez wstrząsanie. Próbę badaną (B 1 ) wirować przez 30 min przy 4000 obr./min. Oznaczanie cholesterolu frakcji HDL Składnik Próba próby wzorcowa badana odczynnikowa W 2 B 2 O odczynnik do oznaczania cholesterolu 1 ml 1 ml 1 ml roztwór wzorca HDL i odcz. wytrącającego W 1 50 µl - - supernatant uzyskany po odwirowaniu B 1-50 µl - H 2 O destylowana µl Inkubacja w temp. 37 C przez 10 min. Odczytać absorbancję próby wzorcowej i badanej względem próby odczynnikowej przy długości fali 520 nm. Obliczenia Stężenie cholesterolu frakcji HDL oblicza się wg wzoru: 226 cholesterol HDL mg/dl = A B A W st. wzorca mg /dl

13 Uwagi Surowice pacjentów z żółtaczką oraz o znacznej hemolizie mogą dawać fałszywie podwyższone wyniki. Kwas askorbinowy hamuje aktywność enzymów zawartych w odczynniku do oznaczania cholesterolu. ĆWICZENIE 3. OZNACZANIE STĘŻENIA TRIGLICERYDÓW METODĄ ENZYMATYCZNĄ Zasada metody Triglicerydy są hydrolizowane przez lipazę do kwasów tłuszczowych i glicerolu, a glicerol jest następnie fosforylowany w reakcji katalizowanej przez kinazę glicerolową (GK) do 3-fosfoglicerolu (G3P). 3-fosfoglicerol w dalszym etapie jest utleniany do fosfodihydroksyacetonu (DAP) przez oksydazę glicerofosforanową (GPO). Powstający nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) jest oznaczany w reakcji z 4- aminoantypiryną (4-AAP) i 3-hydroksy-2,4,6-trójbromobenzoesanem (TBHB), w wyniku której powstaje czerwony barwnik. Intensywność zabarwienia mierzona przy długości fali 540 nm jest proporcjonalna do stężenia triglicerydów w próbce surowicy. triglicerydy lipaza glicerol + kwasy tłuszczowe GLICEROL + ATP GK G3P + ADP G3P + O GPO 2 DAP + H 2 O 2 H 2 O 2 + 4AAP + TBHP MATERIAŁ BADANY Surowica peroksydaza barwnik chinonoiminowy + H 2 O Odczynniki 1. Wzorzec triglicerydów o stężeniu 200 mg/dl 2. Odczynnik do oznaczania triglicerydów (TG) o składzie: ATP 10 mm, Mg ++ > 5,0 mm, TBHB - 2,0 mm, GPO > 2000 U/I peroksydaza > 500 U/I, azydek sodowy 0,1%, bufor i niereaktywne stabilizatory 227

14 Wykonanie Oznaczenie wykonać wg schematu: Składnik Próby wzorcowa W Próba badana B odczynnikowa 0 odczynnik do oznaczania TG 1 ml 1 ml 1 ml Inkubacja w temp. 37 C przez 5 min. Wzorzec 10 µl - - surowica - 10 µl - H 2 O dest µl Inkubacja w temp. 37 C przez 5 min. Odczytać absorbancję próby wzorcowej i badanej wobec próby odczynnikowej przy długości fali 540 nm. Barwa jest stabilna przez 30 min. Obliczenia Stężenie triglicerydów oblicza się wg wzoru: trójglicerydy mg/dl = A B A W st. wzorca mg /dl Uwagi Oznaczenie może być wykonane w osoczu pobranym na EDTA lub heparynę (nie stosować osocza cytrynianowego, szczawianowego lub zawierającego fluorek). Przedstawiona procedura polega na oznaczeniu wolnego glicerolu po hydrolizie enzymatycznej triglicerydów. Poziom glicerolu w krwi jest bardzo niski. Fałszywie podwyższone wyniki można uzyskać w przypadku próbek o silnej hemolizie lub wysokim poziomie bilirubiny, a także w przypadku ich niewłaściwego przechowywania. Triglicerydy są stabilne w temp. 2-8 C przez kilka dni. Nie przechowywać próbek w temperaturze pokojowej (18-25 C) - uwolniony z fosfolipidów glicerol będzie fałszywie podwyższał wyniki. Na oznaczenie wpływ mogą mieć również stosowane przez pacjenta leki. 228

15 Ćwiczenie 4. ELEKTROFOREZA LIPOPROTEIN ZASADA METODY Elektroforeza na żelu agarozowym jest stosowana do rozdziału lipoprotein na 4 frakcje, każdą złożoną z jednej lub więcej lipoprotein. Te frakcje to: chylomikrony, β- lipoproteiny, pre-β- lipoproteiny, α- lipoproteiny. Zasada elektroforezy jest oparta na tym, że lipoproteiny po umieszczeniu w polu elektrycznym wędrują w kierunku anody. MATERIAŁ BADANY Surowica Odczynniki Żel agarozowy Bufor barbitalowy (siła jonowa 0,05) Barwnik 0,07% Roztwór utrwalający (mieszanina alkoholu, wody destylowanej i kwasu octowego lodowatego w stosunku 6:3:1) Roztwór odbarwiający (mieszanina alkoholu i wody destylowanej w stosunku 9:11) WYKONANIE Zestaw THE PARAGON LIPO KIT przeprowadza rozdział elektroforetyczny w buforowanym żelu agarozowym. Po elektroforezie lipoproteiny w żelu są unieruchamiane roztworem fiksującym, a żel jest wysuszany. Rozdział lipoprotein jest uwidaczniany przez wybarwienie wysuszonego żelu barwnikiem charakterystycznym dla lipidów. Rozdział ten może być interpretowany wizualnie lub wyliczany densytometrycznie. Do elektroforezy można używać surowicę lub osocze (zalecanym antykoagulantem jest EDTA, przeciwskazana jest krew heparynizowana). Pacjenci powinni być na czczo (16 godzin od ostatniego posiłku). Najlepsze są świeżo pobrane próbki, ale można używać również próbek przechowywanych do 72 godzin w temperaturze 2-8 C. Wykonanie elektroforezy 1. Przygotować próbki zgodnie z instrukcją. 2. Napełnić każdą z części aparatu do eletroforezy 45 ml buforu barbitalowego. 3. Napełnić pojemniki poszczególnymi roztworami, w ilości 300 ml w następującej kolejności: A. roztwór fiksacyjny, B. barwnik, C. roztwór odbarwiający I, 229

16 230 D. roztwór odbarwiający II, E. roztwór odbarwiający III, 4. Wyjąć żel z opakowania i umieścić na papierowym ręczniku. Osuszyć delikatnie bibułą. 5. Umieszczenie szablonu: A. zgiąć szablon wzdłuż, B. wyrównać szablon do pozycji C, zgodnie z kropkami umieszczonymi na brzegu żelu, C. przyłożyć szablon do żelu tak, aby pierwsza z powierzchnią żelu zetknęła się szczelina kontaktowa, D. delikatnie potrzeć palcem w poprzek szablonu, aby upewnić się, że dobrze przylega. 6. Nanieść 3-5 µl surowicy do każdego otworu szablonu, odpowiadającego ścieżkom żelu 1-8. Zewnętrzne otwory na szablonie nie powinny być używane. Poczekać 5 min od nałożenia ostatniej próbki, aby doszło do dyfuzji. 7. Delikatnie osuszyć szablon bibułą. Usunąć szablon i bibułę. 8. Umieścić żel na mostku, odpowiednio ustawiając + i -. Włożyć mostek do komory do elektroforezy i przykryć ją pokrywą. 9. Podłączyć komórkę do elektroforezy do zasilacza (100V), na 30 min. 10. Po zakończeniu elektroforezy wyjąć żel i umieścić w ramce. 11. Zanurzyć na 5 min. w roztworze utrwalającym. 12. Po wyjęciu z utrwalacza osuszyć nadmiar roztworu z tylnej powierzchni żelu i umieścić w suszarce do całkowitego wysuszenia. 13. Wysuszony żel należy umieścić w następujących roztworach: A. barwnik do lipoprotein - zanurzyć na 5 min, B. roztwór odbarwiający I - 3x zanurzyć, C. roztwór odbarwiający II - 3x zanurzyć, D. roztwór odbarwiający III - zanurzyć na 5 min. 14. Opłukać żel wodą destylowaną i umieścić w suszarce aż do całkowitego wysuszenia. 15. Ocenić żel optycznie albo wyliczyć procentowy udział każdej frakcji używając densytometru, przy długości fali 600 nm.

17 Ćwiczenie 5 OZNACZANIE STĘŻENIA LIPOPROTEINY (a) W SUROWICY METODĄ ELISA ZASADA METODY Immunoenzymatyczne oznaczanie liproteiny (a) wykonuje się w oparciu o ilościową technikę kanapkową. W technice tej używa się dwóch monoklonalnych przeciwciał przeciwko dwóm różnym epitopom Lp(a). Oba przeciwciała rozpoznają naturalną i rekombinowaną Lp(a) w takim samym stopniu. Podczas etapu inkubacji próbki zawierające Lp(a) wprowadzane są do odpowiednich dołków płytki serologicznej, pokrytych przeciwciałami. Następnie przez dodanie koniugatu drugiego przeciwciała z peroksydazą przeprowadza się jednoetapową reakcję immunologiczną. Po przemyciu buforem, pozostałość poddaje się reakcji z TMB (tetrametylobenzydyną), a powstający produkt oznacza się fotometrycznie. MATERIAŁ BADANY Surowica ODCZYNNIKI Przeciwciało opłaszczające (przeciwciało monoklonalne przeciwko lipoproteinie (a)) Wzorzec Lp(a) o stężeniu 1 mg/dl Koniugat (monoklonalne przeciwciała mysie anty-igg sprzeżone z peroksydazą) Roztwór substratu TMB (tetrametylobenzydyna) Roztwór hamujący reakcję - 1M H 2 SO 4 Bufor do inkubacji Bufor do przemywania WYKONANIE OZNACZENIA Materiał badany (B) rozcieńczyć buforem do inkubacji w stos. 1:100. Na płytkę serologiczną opłaszczona przeciwciałami odpipetować po 20 µl wzorca (W), wody destylowanej jako próby ślepej (O) oraz wcześniej rozcieńczonej surowicy (B). Następnie do wszystkich dołków dodać 100 µl koniugatu. Płytki serologiczne przykryć wieczkiem i inkubować przez 2 godz. w temperaturze o C. W kolejnym etapie usunąć zawartość przez dekantację, a pozostałość przemyć dwukrotnie buforem do przemywania (300 µl). Następnie do każdego dołka dodać 231

18 100 µl roztworu substratu TMB. Płytkę przykryć wieczkiem i inkubować w ciemności w temp C przez min. Po tym czasie do każdego dołka dodać 25 µl 1M H 2 SO 4 i inkubować przez ok. 1 min. Pomiar absorbancji przeprowadza się przy użyciu czytnika ELISA, przy długości fali 450 nm, w czasie 5 min. od dodania roztworu do hamowania reakcji. Obliczenia st. Lp a = A B A 0 A W A 0 100,0 1,0 mg /dl gdzie: A B absorbancja próby badanej A W absorbancja próby wzorcowej A 0 absorbancja próby ślepej 1,0 stężenie wzorca Lp(a) 100,0 przelicznik wynikający z rozcieńczenia surowicy 232