Biochemiczne metody badania aktywności i funkcji enzymów uczestniczących w metabolizmie RNA (ze szczególnym uwzględnieniem kompleksu egzosomu)

Transkrypt

1 Biochemiczne metody badania aktywności i funkcji enzymów uczestniczących w metabolizmie RNA (ze szczególnym uwzględnieniem kompleksu egzosomu) Rafał Tomecki Pracownia Biologii RNA i Genomiki Funkcjonalnej IBB oraz IGiB UW Wykład w ramach fakultetu: Molekularne techniki analizy RNA ;

2 RNazy uczestniczące w metabolizmie RNA Endorybonukleazy: np. RNaza E (bakterie) Egzorybonukleazy 5 3 : procesywna hydrolityczna Xrn1 3 5 : procesywne (rdzeń egzosomu) lub dystrybutywne (Rrp6p) procesywne fosforolityczne: PNPaza (bakterie; organella komórek eukariotycznych) oraz kompleks egzosomu u archebakterii procesywne hydrolityczne: rodzina RNazy R / RNazy II Hydroliza : RNA + H 2 O monofosforany rybonukleozydów (rnmp) Fosforoliza : RNA + PO - 4 difosforany rybonukleozydów (rndp) wiązanie fosfodiestrowe i jonu dwuwartościowego (Mg 2+, Mn 2+, Zn 2+ ) u nukleofilowego)

3 Ścieżki metabolizmu eukariotycznych mrna Degradacja mrna w cytoplazmie jest inicjowana najczęściej poprzez odtrawienie ogona poli(a) z końca 3 (deadenylacja). W procesie tym, który ma charakter dystrybutywny, uczestniczy duży kompleks białkowy Ccr4-Not1. Po deadenylacji mrna może ulegać degradacji w dwóch różnych ścieżkach: w kierunku 3-5 (kompleks egzosomu) w kierunku 5-3 (kompleks usuwający czapeczkę z końca 5 oraz aktywność egzonukleazy Xrn1p) Garneau et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2007

4 Główne eukariotyczne enzymy degradujące RNA Xrn1 5-3 Enzym działający samodzielnie Chang et al., Nat Struct Mol Biol 2011 Egzosom 3-5 W jądrze komórkowym drożdży współdziała z kompleksem TRAMP (polimeraza poli(a) Trf4/5, helikaza RNA Mtr4 i białko wiążące RNA Air1/2); analog u ludzi kompleks NEXT W cytoplazmie drożdży współdziała z potencjalną GTPazą Ski7p oraz z kompleksem Ski złożonym z helikazy RNA Ski2p i dwóch dodatkowych białek (Ski3p i Ski8p)

5 Egzosom to duży 400 kda kompleks białkowy posiadający aktywność 3-5 egzorybonukleazy Jedyna niezbędna egzorybonukleaza 3-5 u drożdży, zaangażowana w wiele procesów metabolizmu RNA zarówno w jądrze komórkowym, jak i w cytoplazmie Tomecki et al., Chembiochem 2010

6 Skład podjednostkowy i lokalizacja wewnątrzkomórkowa kompleksów egzosomu u drożdży Chlebowski et al., w: RNA exosome, ed.: T.H. Jensen; Lades Bioscience 2010

7 Rdzeń egzosomu S. cerevisiae to chimera złożona z: a) 6-podjednostkowego kompleksu przypominającego pierścień RNAzy PH/PNPazy pochodzenia archebakteryjnego; b) 3 podjednostek zawierających domeny wiążące RNA (KH i S1), które występują także w bakteryjnej PNPazie; c)homologa RNazy II/R Dis3p/Rrp44 (jedyna podjednostka katalityczna rdzenia) Wszystkie podjednostki rdzenia egzosomu są niezbędne dla drożdży PIN

8 Nukleazy zawierające domeny RNazy PH uczestniczą w metabolizmie RNA w komórkach organizmów reprezentujących wszystkie królestwa świata żywego Ishii et al., J Biol Chem 2003 Shi et al., RNA 2008 Lu et al., PLoS One 2008

9 Jaka jest aktywność kompleksu egzosomu? Rozwiązane struktury krystaliczne archebakteryjnych kompleksów egzosomu wydawały się podobne do PNPazy. Zasugerowano, że mechanizm działania drożdżowego egzosomu może przypominać aktywność PNPazy i egzosomu archebakterii Büttner et al., Mol Cell 2005 Zaproponowano, że każda z 10 podjednostek drożdżowego egzosomu może posiadać jakąś aktywność katalityczną TO NIEPRAWDA!

10 Oznaczenia biochemiczne aktywności rybonukleaz na przykładzie kompleksu egzosomu [1] pozyskanie materiału do badań: oczyszczanie kompleksów lub pojedynczych białek z komórek gospodarza (np. z wykorzystaniem znacznika TAP) LUB/I nadprodukcja heterologiczna białek w bakteriach i ich oczyszczanie w formie rekombinowanej (ewentualnie rekonstytucja kompleksu z oczyszczonych białek rekombinowanych) optymalizacja warunków reakcji dla konkretnej aktywności: m.in. rodzaj i stężenie kationu dwuwartościowego, czynnik buforujący stężenie soli, temperatura, czas reakcji konieczność przygotowania wersji białka z mutacjami w potencjalnych centrach katalitycznychjako kontroli negatywnych możliwość zawężenia analizy do przypuszczalnej domeny katalitycznej w przypadku, gdy białko pełnej długości jest nierozpuszczalne

11 Oznaczenia biochemiczne aktywności rybonukleaz na przykładzie kompleksu egzosomu [2] poddawanie analizie substratów RNA znakowanych w różny sposób (na końcu 5 lub 3 ; wewnątrz cząsteczki) analizowanie degradacji substratów o różnej strukturze (jednoniciowe liniowe lub koliste; dwuniciowe) badanie degradacji zarówno syntetycznych oligorybonukleotydów, jak i naturalnych substratów RNA, uzyskiwanych w wyniku transkrypcji in vitro ZESTAWIENIE WYNIKÓW ANALIZ BIOCHEMICZNYCH in vitro Z DANYMI STRUKTURALNYMI ORAZ WYNIKAMI DOŚWIADCZEŃ in vivo

12 Oczyszczanie egzosomu z drożdży Oczyszczanie na złożu IgG (białko Dis3p opatrzone znacznikiem TAP jako przynęta) + sączenie molekularne (kolumna Superdex S-200). Z 18 litrów hodowli można otrzymać 200 μg kompleksu mau Exosome nm 254nm profile elucji (FPLC) A13 A14 A15 B15 B14 B13 B12 B11 B10 B9 B8 B7 B6 B5 B4 B3 B2 B1 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13C ml

13 Oznaczanie aktywności biochemicznej egzosomu W celu zbadania aktywności rdzenia egzosomu (9- składnikowy pierścień + białko Dis3p), kompleks oczyszczano przy użyciu fuzji Rrp41p-TAP ze szczepu S. cerevisiae pozbawionego RRP6. We wstępnych doświadczeniach wykryto bardzo niską aktywność hydrolityczną i nie stwierdzono żadnej aktywności fosforolitycznej. Wymusiło to konieczność optymalizacji parametrów do oznaczania aktywności biochemicznej kompleksu Dziembowski et al., Nat Struct Mol Biol 2007

14 Analiza aktywności egzosomu metodą TLC (PEI-celuloza) przy różnym stężeniu Mg 2+ i EDTA (bufor: 10 mm Tris ph=8; 75 mm NaCl; 1 mm β- merkaptoetanol) Dziembowski et al., Nat Struct Mol Biol 2007 Egzosom jest hydrolazą Aktywność egzosomu jest zależna od jonów Mg 2+, ale silnie hamowana przy stężeniu magnezu powyżej 1 mm. Przykład optymalizacji stężenia kationu dwuwartościowego stosowanego w reakcji Wszystkie wcześniejsze doświadczenia in vitro wykonywano w warunkach, w których aktywność kompleksu jest około 100-krotnie niższa od warunków optymalnych Nie wykryto fosforolizy i powstawania UDP analiza TLC

15 Frãzao et al., Nature 2006 Dis3 potencjalna podjednostka katalityczna Organizacja domen funkcjonalnych białka Dis3 - zidentyfikowano mutację znoszącą aktywność RNazy II E. coli (D209N) [aminokwas D209 bierze udział w koordynacji jonu Mg 2+ ] substrat znakowany na końcu 5

16 Czy analogiczna mutacja białka Dis3p wpływa na przeżywalność drożdży? - homologiczny asparaginian (D551) w DIS3 zmutowano w asparaginę poprzez rekombinację in vivo w dwóch szczepach: szczepie dzikim (do analizy fenotypów) oraz w szczepie z delecją RRP6 (Δrrp6) (do oczyszczania kompleksu i badania aktywności) WT D551N Mutacja DIS3 D551N powoduje bardzo silny fenotyp wzrostowy WNIOSEK: Nienaruszony aminokwas D551 jest konieczny dla prawidłowego funkcjonowania komórek HIPOTEZA: Mutacja D551N w Dis3p znosi aktywność katalityczną egzosomu

17 Czy mutacja D551N znosi aktywność hydrolityczną egzosomu? substrat znakowany na końcu 3 analiza SDS-PAGE Analiza aktywności egzorybonukleolitycznej egzosomów zawierających WT Dis3 lub Dis3 D551N w obecności substratu RNA znakowanego [ 32 P]-pUpU na końcu 3 WNIOSEK: Obecność nienaruszonego aminokwasu D551 jest warunkiem prawidłowej aktywności nukleolitycznej kompleksu egzosomu Dziembowski et al., Nat Struct Mol Biol 2007

18 Kompleks egzosomu i białko Dis3p wykazują podobną aktywność względem różnych substratów RNA (jednoniciowych) analiza PAGE substrat naturalny (pre-trna) syntetyczny oligorybonukleotyd krótkie produkty degradacji świadczą o aktywności egzorybonukleolitycznej 3-5 WNIOSEK: Wyniki doświadczeń in vitro wskazują, że białko Dis3p jest główną podjednostką katalityczną kompleksu egzosomu Dziembowski et al., Nat Struct Mol Biol 2007

19 Obserwacje z doświadczeń in vivo dostarczają silnego poparcia dla wyników eksperymentów biochemicznych Dziembowski et al., Nat Struct Mol Biol 2007 Czy Dis3p jest rzeczywiście jedyną podjednostką katalityczną rdzenia drożdżowego egzosomu? Mutacja katalityczna Dis3 D551N powoduje fenotyp charakterystyczny dla deplecji poszczególnych podjednostek egzosomu: akumulacja prekursora 7S obróbki 5.8S rrna akumulacja 5 -ETS inhibicja degradacji mrna przy jednoczesnym zahamowaniu ścieżki degradacji w kierunku 5'-3' akumulacja 5'-ETS w mutancie Dis3 D551N

20 W jaki sposób określa się kierunek działania rybonukleazy? egzorybonukleazy 5-3 endorybonukleazy *

21 Czy ludzkie homologi Dis3p hdis3 i hdis3l są również egzonukleazami 3-5? analiza PAGE Tomecki et al., EMBO J 2010

22 Dla pewności trzeba zbadać substrat wyznakowany na przeciwnym końcu analiza PAGE analiza TLC Tomecki et al., EMBO J 2010

23 Ludzkie homologi Dis3 są egzorybonukleazami 3-5 egzorybonukleazy 5-3 endorybonukleazy *

24 Pellegrini et al., Methods enzymol 2008 A jak to wygląda w przypadku egzonukleaz 5-3? Przykład 1: Xrn1 z S. cerevisiae znakowaniekońca 5 [γ- 32 P] i T4 PNK znakowaniekońca 3 [ 32 P] pcp

25 Xrn1 jest egzorybonukleazą 5-3 egzorybonukleazy 5-3 endorybonukleazy *

26 Czy RNaza J1 działa w kierunku 3-5, czy 5-3? znakowaniekońca 5 [γ- 32 P] i T4 PNK znakowaniekońca 3 [ 32 P] pcp Clouet-d'Orval et al., J Biol Chem 2010 G pierwszy nukleotyd substratu sr47 analiza TLC Nie można stwierdzić na podstawie powyższych wyników

27 Nie zawsze jest to oczywiste egzorybonukleazy 5-3 endorybonukleazy *

28 Jak to ostatecznie stwierdzić? Asymetryczne wprowadzenie do substratu elementu spowalniającego aktywność nukleolityczną jest!!! (5-3 ) brak (nie 3-5 ) Clouet-d'Orval et al., J Biol Chem 2010

29 Za usuwanie pirofosforanu u E. coli odpowiada pirofosfohydrolaza RppH. Jest to krok inicjujący degradację, który poprzedza trawienie RNA przez RNazę E! Aktywność wielu rybonukleaz zależy od statusu fosforylacji końca 5 jak badać to zjawisko? Przygotowanie substratów z różnym końcem 5 : Transkrypcja in vitro w obecności [α- 32 P]UTP: 1) równe stężenia wszystkich NTP trifosforan 2) nadmiar NMP odpowiadającego 1. nukleotydowi substratu monofosforan 3) potraktowanie substratu fosfatazą alkaliczną grupa hydroksylowa 4) nadmiar analoga czapeczki (transkrypty eukariotyczne) czapeczka Escherichia coli analiza PAGE Celesnik et al., Mol Cell 2007

30 Inne przykłady rybonukleaz zależnych od czujnika 5 RNaza J1 Bacillus subtilis i Archaea (patrz powyżej) RNaza Y Bacillus subtilis analiza PAGE Shahbabian et al., EMBO J 2009 Rat1 (współdziała z pirofosfohydrolazą Rai1) Xrn1 (stąd konieczne usunięcie czapeczki) Rai1 Pellegrini et al., Methods enzymol 2008 Xiang et al., Nature 2009

31 Do czego to można wykorzystać w praktyce?

32 Czy Dis3p jest wyłącznie egzorybonukleazą 3-5? O tym, że warto poświęcić dłuższą chwilę wnikliwej analizie sekwencji aminokwasowej badanego białka Organizacja domen funkcjonalnych białka Dis3p N-końcowa domena PIN jest silnie zachowana w ewolucji D91 D171 D198

33 Białka zawierające domenę PIN są nukleazami RNAza H bakteriofaga T4 endonukleaza FEN1 Struktura białka hsmg6 (Glavan et al., EMBO J, 2006) białko Nob1p uczestniczy w endonukleolitycznej obróbce 20S pre-rrna białko hsmg6 będące elementem maszynerii NMD, wykazuje aktywność endonukleolityczną

34 Mutant Dis3p D551N pozbawiony aktywności egzorybonukleolitycznej degraduje RNA in vitro Przykład optymalizacji rodzaju kationu dwuwartościowego stosowanego w reakcji Wymagania odnośnie kofaktorów: [Mn 2+ ] > [Zn 2+ ] > [Mg 2+ ] substrat znakowany na końcu 5 Lebreton, Tomecki et al., Nature 2008

35 Aktywność nukleolityczna mutanta Dis3p D551N wymaga wysokiego stężenia Mn 2+ Przykład optymalizacji stężenia kationu dwuwartościowego stosowanego w reakcji substrat znakowany na końcu 5

36 Czy obserwowana aktywność nukleolityczna jest związana z N-końcową domeną PIN? Dodatkowe mutacje konserwowanych reszt asparaginianu w obrębie triady katalitycznej domeny PIN D171 D198 Lebreton, Tomecki et al., Nature 2008

37 Obecność katalitycznych reszt asparaginianu w Dis3 PIN jest konieczna dla degradacji RNA in vitro analiza PAGE substrat znakowany na końcu 5 substrat znakowany na końcu 3 drabinka produktów degradacji w przypadku substratów znakowanych na óżnych końcach sugeruje, że obserwujemy aktywność endorybonukleolityczną

38 Przykład wzoru degradacji endorybonukleolitycznej egzorybonukleazy 5-3 endorybonukleazy *

39 Jak jednoznacznie potwierdzić, że domena PIN jest związana z aktywnością endorybonukleazy? Badanie aktywności enzymu wobec substratu RNA pozbawionego wolnych końców (czyli KOLISTEGO) Domena PIN jest związana z nowo odkrytą aktywnością nukleolityczną białka Dis3, zdolną do degradacji różnego rodzaju substratów: znakowanych na końcu 5 znakowanych na końcu 3 kolistych co świadczy o tym, że jest endonukleazą! Lebreton, Tomecki et al., Nature 2008

40 Degradacja substratu kolistego tylko endonukleazy egzorybonukleazy 5-3 endorybonukleazy *

41 Czy aktywność endorybonukleolityczna domeny PIN jest zależna od reszty białka Dis3p? Konieczność oczyszczenia pojedynczej domeny białka i zbadania jej aktywności sączenie molekularne (A) eluat po 1. czyszczeniu na złożu niklowym i trawieniu proteazą SUMO (B) wypłukane białka nie wiążące się ze złożem niklowym podczas 2. czyszczenia (TU: badane białko) (C) eluat po 2. czyszczeniu na złożu niklowym

42 Sama domena PIN wykazuje aktywność endonukleolityczną, która jest znoszona przez mutacje konserwowanych reszt asparaginianu w centrum aktywnym substrat znakowany na końcu 5 substrat znakowany na końcu 3 substrat kolisty Lebreton, Tomecki et al., Nature 2008

43 Czy aktywność domeny PIN jest ważna dla fizjologii drożdży? Korelowanie wyników eksperymentów biochemicznych z doświadczeniami in vivo + białko A (pa) w szczepie z tet-off::dis3 i RRP41-CBP koimmunoprecypitacja Komplementacje obniżonego poziomu ekspresji endogennego DIS3 (badanie wzrostu drożdży w pożywce z doxycykliną) analiza western-blot Lebreton, Tomecki et al., Nature 2008

44 Substraty egzosomu w ścieżce obróbki rrna

45 Wpływ mutacji w Dis3 na substrat egzosomu: 5 -ETS Lebreton, Tomecki et al., Nature 2008

46 Mapowanie intermediatów degradacji w crt-pcr popiera hipotezę cięcia endonukleolitycznego in vivo Lebreton, Tomecki et al., Nature 2008

47 Dis3 PIN wprowadza cięcia preferencyjnie w obrębie pętli Struktura w oparciu o Brulé et al., EMBO J 1996

48 Cięcie 5 -ETS przez PIN zostało potwierdzone in vitro Lebreton, Tomecki et al., Nature ETS otrzymany w reakcji transkrypcji in vitro w obecności [α- 32 P]UTP marker wielkości pbr322/mspi znakowany na końcu 5 przy pomocy T4 PNK i [γ- 32 P]ATP

49 Jak obie aktywności współpracują ze sobą? model Hipoteza na podstawie danych z doświadczeń biochemicznych i eksperymentów in vivo Tomecki and Dziembowski, RNA 2010 Dis3p D551N (exo- endo+) Dis3p D171N D551N (exo- endo-)

50 Trzecia aktywność w egzosomie Dis3 PIN jest endonukleazą specyficzną względem ssrna In vitro, tnie zarówno liniowe, jak i koliste substraty RNA In vivo, uczestniczy w degradacji naturalnych substratów egzosomu Mutacje katalityczne domeny PIN skutkują synergicznymi fenotypami w połączeniu z mutacjami aktywności egzonukleolitycznych Aktywność endonukleolityczna PIN może pomagać egzonukleazom Dostarczając alternatywnych miejsc startu degradacji jeśli droga egzosomu jest zablokowana przez obecność struktur drugorzędowych w substracie RNA

51 Aktywność Dis3p a aktywność egzosomu o czym nam mówią takie porównania? O tym, że warto badać wzór degradacji substratów o różnej strukturze Jakieś właściwości egzosomu powodują, że wydajność degradacji substratów dwuniciowych jest niższa niż w przypadku wolnego Dis3p substraty jednoniciowe substraty dwuniciowe * Lorentzen et al., Mol Cell 2008

52 Czy Dis3p wykazuje własności helikazy RNA? substraty dwuniciowe * Lorentzen et al., Mol Cell 2008 Dis3p ma zdolność rozplatania dwuniciowych substratów RNA - pod warunkiem obecności jednoniciowego fragmentu o odpowiedniej długości na końcu 3 jednej z nici - brak domeny PIN obniża wydajność rozplatania substratów dwuniciowych z elementem jednoniciowym o średniej długości

53 Podłoże różnic we właściwościach biochemicznych Dis3p i RNazy II tkwi w różnym usytuowaniu przestrzennym domen wiążących RNA O tym, jak ważne jest zestawianie danych biochemicznych z informacjami strukturalnymi Dis3p RNase II degraduje dsrna Lorentzen et al., Mol Cell 2008 zatrzymuje się po napotkaniu struktury dwuniciowej

54 Dane strukturalne wyjaśniają zdolność Dis3p do rozplatania dwuniciowych substratów RNA podczas ich trawienia Dis3p RNase II Lorentzen et al., Mol Cell 2008 Hydroliza RNA prowadzi do rotacji łańcucha RNA, co dostarcza energii pozwalającej na rozplatanie nici podczas kolejnych rund katalizy

55 wg Liu et al., Cell 2006; Hernandez et al., EMBO Rep 2006; Dziembowski et al., NSMB 2007 Czy tajemnica różnic między aktywnościami Dis3p i egzosomu tkwi w strukturze kompleksu? Gdzie lokalizuje się Dis3p względem pierścienia? rdzeń egzosomu PM-Scl100 /Rrp6 Lrp1/ Rrp47 + podjednostki jądrowospecyficzne Dis3/ Rrp44

56 Dis3p lokalizuje się pod pierścieniem egzosomu (po przeciwnej stronie niż trimer podjednostek KH/S1) rdzeń z Dis3p rdzeń bez Dis3p wejście RNA do kanału? utra rdzenia mu adnikowy eń + Dis3p) ana przy centrum aktywne Dis3p Wang et al., PNAS 2007

57 Wolne białko Dis3p i egzosom wiążą jednoniciowe fragmenty RNA bardzo różnej długości wejście do kanału wyjście z kanału Bonneau et al., Cell 2009 WNIOSEK: RNA przechodzi przez kanał przed dotarciem do centrum aktywnego Dis3p

58 Droga substratu wiodąca przez kanał pierścienia jest rzeczywiście zachowana ewolucyjnie Malet et al., EMBO Rep 2010 oligonukleotyd RNA (częściowo dwuniciowy, z ~35 nt odcinkiem jednoniciowym) biotynylowany na końcu 5, sprzężony ze streptawidyną wyznakowaną złotem koloidalnym (5 nm) CZARNE KROPKI widoki z góry struktura apo struktura z RNA struktura rdzenia egzosomu rozwiązana przy użyciu mikroskopii elektronowej (negative staining)

59 Czy ta droga jest wykorzystywana zarówno w przypadku kierowania substratu do domeny RNB, jak i do domeny PIN? Malet et al., EMBO Rep 2010 widoki z boku struktura apo struktura z RNA PIN RNB

60 Dwuniciowe substraty RNA są degradowane przez domenę RNB w kontekście rdzenia egzosomu pod warunkiem obecności odpowiednio długiego odcinka jednoniciowego Bonneau et al., Cell 2009

61 Zablokowanie kanału obniża wydajność degradacji substratów RNA, zarówno jedno- jak i dwuniciowych Drążkowska et al., Nucleic Acids Res 2013

62 Zablokowanie kanału hamuje również aktywność endonukleolityczną domeny PIN! Drążkowska et al., Nucleic Acids Res 2013

63 Podsumowanie, czyli o czym należy pamiętać 1. Wychodzić zawsze od szczegółowej analizy sekwencji badanego białka i dostępnych informacji na temat homologów 2. Testować możliwie dużą liczbę warunków reakcji (różne substraty, różne kofaktory, różne bufory) i pamiętać o wszystkich możliwych kontrolach, jakie nam przyjdą do głowy (zarówno negatywne w szczególności mutanty w potencjalnych miejscach katalitycznych, jak i pozytywne) 3. Porównywać aktywności pojedynczych białek oraz całych kompleksów lub subkompleksów przeważnie prowadzi to do ujawnienia interesujących informacji 4. Dążyć do uzyskania struktury badanego białka/kompleksu, bo dopiero jej posiadanie pomoże nam poprawnie zinterpretować wyniki naszych mokrych doświadczeń, ale 5. sama struktura niewiele nam powie bez danych biochemicznych 6. Próbować zweryfikować dane strukturalne i biochemiczne przez doświadczenia na żywym układzie czy to, co odkryliśmy w probówce rzeczywiście działa podobnie w komórce i ma istotne znaczenie biologiczne?

64 DIS3 and FAM46C in the pathogenesis of Multiple Myeloma. Andrzej Dziembowski

65 Multiple myeloma Second most common blood cancer Affected plasma cells produce large amounts of abnormal immunoglobulin (M protein) Currently incurable 4% >50 years George et al Khan, 2007

66 Mutations in MM

67 DIS3: FAM46C: Member of FAM46 family The major eukaryotic Dziembowski et al exonuclease Putative poly(a) polymerase Robinson, 2015

68 What is the role of Dis3 and Fam46C proteins in cancer formation?

69 DIS3 and RNA exosome architecture RRP6 DIS3 Hernández and Dziembowski et al. EMBO rep 2006 Dziembowski, et al. NSMB 2007 Lebreton and Tomecki et al. Nature 2008 Lorentzen et al. Mol CELL 2008 Li et al. CELL 2006 Makino et al. Nature 2013 Bonneau et al. Cell 2009 Malet et al. EMBO Rep 2010

70 Pervasive transcription products accumulate robustly upon DIS3 dysfunction Szczpińska et al. Genome res 2015

71 More than 70% of the genome is covered with RNA-seq reads in DIS3 mutant cells Szczpińska et al. Genome res 2015

72 Global deregulation of protein coding genes in DIS3 mutants Szczpińska et al. Genome res 2015

73 Conditional DIS3 knockout in chicken DT40-cell line - DIS3 is essential in vertebrates Tomecki et al. NAR 2014

74 DIS3 mutations in MM are enriched in the RNB domain resposible for exo activity Figure 2 Mutations in the DIS3 found in MM patients from Walker et al 2015 (1). RNB domain is shown in red.

75 Purification of various recombinant versions of hdis3 protein following overexpression in E. coli Tomecki et al. NAR 2014

76 MM mutations inhibit the exo activity of hdis3 Tomecki et al. NAR 2014

77 MM associated DIS3 mutations in RNB domain inhibit growth of HK293 cells Tomecki et al. NAR 2014

78 PE2, a MM cell line with DIS3 mutation PE2 MM cell line harbor hemizygous DIS3 mutation WT DIS3 transfected to Dis3-/- PE2 MM cell line, does not rescue the oncophenotype. increased cell proliferation and survival transcriptome changes (by RNAseq)

79 Dis3 G766R mouse line Mutation in Dis3 RNB domain (G766R) Tomecki et al Clinique de la Souris; Institute de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire; Strasbourg

80 G766R/G766R mutation is embryolethal at preimplantation stage Dis3

81 G766R/wt mice are smaller than their wild-type littermates Dis3 W e i g h t [g] Murine Embryonic Fibroblasts derived from G766R/wt fetuses exhibit growth retardation.

82 Molecular phenotype of Dis3 G766R/+ cells (MEF) Dis3 G766R/+ Dis3 G766R/+ WT WT Total RNAseq DE analysis Transcriptome analysis RNAseq: no significant annotated transcriptome deregulation subtle but general changes in repetitive regions deregulated pericentromeric and centromeric repeats

83 No difference in survival/cancer occurrence in Dis3 G766R/+ versus WT Kaplan Meier estimator

84 Induced plasmocytomaa murine model of Multiple Myeloma (MM) 0m 2m 6m 8m 4m 10m Pristane intraperitoneal injections Pro B-cell Naïve B-cell Plasma cell Activation Bone marrow Periphery Germinal center Bone marrow

85 DIS3 G766R/+ mutation predisposes mice to plasmacytoma development.

86 Immunoglobulin class switch recombination

87 Immunoglobulin class switch recombination

88 Basu 2011, 2014

89 DIS3 mutation does not inhibit immunoglobulin class switch recombiantion

90 Dis3 G766R/+ mutation increases the rate of chromosomal translocations Translocations with the immunoglobulin loci 8% 7% 6% 5% 4% 3% 2% 1% Chimeric reads 0% 10p 57p Mate-pair DNAseq

91 Data supporting the AID-dependent pathogenesis model RNB mutant has a higher affinity to substrates compared to WT HEK293 WT RNB HEK293 WT RNB UV - + M M UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (CLIP) HEK293 cells

92 Model: AID dependent Dis3 G766R/+ pathogenesis Dis3 G766R/+ gives a B-cell lineage specific mutator phenotype

93 DIS3 PIN domain as a novel MM drug target Synthetic lethal interaction between hdis3 MM mutations in RNB domain and abolishing of PIN domain endonucleolytic activity

94 DIS3 PIN domain as a novel MM drug target Synthetic lethal interaction between hdis3 MM mutations in RNB domain and abolishing of PIN domain endonucleolytic activity PIN WT PIN mut

95 Can we utilize the synthetic interaction between MMlike mutations in the RNB domain and abolishing of PIN domain endonuclease activity for drug design? 3-2-hydroxy-(4H)-isoquinoline-1,3-dione = AC1LAHYL a known inhibitor of RNase H O O H 2 NOBzl O N O Bzl BBr 3 O N OH O O O 1 2 3

96 AC1LAHYL specifically inhibits growth of yeast strains with mutations in the RNB domain

97 DIS3 PIN domain as a MM drug target Newly discovered, patented by us, target for targeted therapies of MM with DIS3 mutations. Lack of obvious phenotypes of DIS3 PIN domain inactivation in knock in mice as well as in human cells; Existing models for pre-clinical analysis Availability of the crystals of humanized yeast DIS3 PIN domain