Ćwiczenie 10 Metody oczyszczanie kompleksów białkowych w badaniach mózgu.

Transkrypt

1 Ćwiczenie 10 Metody oczyszczanie kompleksów białkowych w badaniach mózgu. Oczyszczanie kompleksów białkowych podjednostki α białka Gq z wykorzystaniem etykietki STREP II-FLAG za pomocą tandemowej chromatografii powinowactwa (TAP) Planowanie eksperymentu: 1. lokalizacja metki: zarówno N- jak i C-koniec podjednostki α heterotrimerycznych białek G jest istotny dla lokalizacji i funkcji białka; N-koniec podjednostki α białka Gq jest palmitylowany; C-koniec podjednostki α białka Gq jest zaangażowany w oddziaływanie z receptorem metki należy wstawić wewnątrz białka! 2. niewielkie metki nie powinny zaburzyć fadowania i oddziaływań Gq z innymi białkami; 3. kompleksy są oczyszczane z ludzkich komórek niewskazane jest więc użycie CBP (Calmodulin Binding Peptide), ponieważ wiele ssaczych białek wiąże kalmodulinę; niewskazane jest również użycie metki histydynowej. Wybór metki: Metka STREP II-FLAG, SF-tag (mały rozmiar -masa 4,6 kda) oraz brak cięcia proteolitycznego) FLAG-tag - hydrofilowy ośmioaminokwasowy peptyd: DYKDDDDK; -istnieją trzy rodzaje przeciwciał monoklonalnych rozpoznających FLAG: M1 (rozpoznaje FLAG na N-końcu białka, wiązanie jest zależne od wapnia), M2 (rozpoznaje FLAG na N-, Met-N- i C-końcu oraz wewnątrz białka) oraz M5 (wykazuje większe powinowactwo do FLAG na N-końcu poprzedzonego metioniną); -elucja w warunkach natywnych możliwa poprzez użycie peptydu FLAG (elucja kompetycyjna). STREP II: -ośmioaminokwasowy peptyd: WSHPQFEK; -oczyszczanie na złożu ze Strep-Tactin (mutant streptawidyny o większym powinowactwie do oktapeptydu); -elucja z użyciem pochodnej biotyny (destiobiotyny). Tak wygląda sekwencja wprowadzona do podjednostki α białka Gq: 1

2 SGGGGSDYKDDDDK GSAASWSHPQFEKGGGSGGGSGGGS WSHPQFEKGA Składa się ona z :FLAG-tag, Strep II-tag oraz sekwencji linkerowych. Długość sekwencji: 49 aa Sekwencja podkreślona: wzorowana na publikacji Gloeckner et al., 2007 Powtórzenie sekwencji Strep-tag 2 razy ma zwiększać efektywność oczyszczania (Junttila et al., 2005). Tworzenie konstruktu: - zmodyfikowane białko ma być produkowane w komórkach HEK293; - plazmid wyjściowy: gen podjednostki α ludzkiego białka Gq wklonowany do plazmidu pcdna 3.1 (+) w miejscach cięcia dla enzymów: KpnI (5') oraz XhoI (3'); - plazmid pcdna 3.1 umożliwia namnożenie genu w E.coli oraz produkcję białka w komórkach ssaczych; - aby wprowadzić metkę FLAG-Strep II wykorzystano serię reakcji megaprimier-pcr. 2

3 Badanie lokalizacji zmodyfikowanego białka- właściwa lokalizacja podjednostki α białka Gq niezbędna do pełnienia przez nią funkcji. Uzyskano stabilną transfekcję komórek HEK293 a następnie przeprowadzono barwienie immunocytochemiczne: 1. przeciwciała pierwszorzędowe: mysie przeciwciała anty-flag (M2); 2. przeciwciała drugorzędowe: anty-mysie przeciwciała z fluoroforem (Alexa 488). Przygotowane preparaty oglądano pod mikroskopem z użyciem techniki TIRF ang. Total Internal Reflection Fluorescence całkowite wewnętrzne odbicie (w Zakładzie Biologii Komórki). Białko z metką lokuje się w błonie komórkowej-właściwa lokalizacja. Poniższy protokół sporządzono na podstawie publikacji: Gloeckner CJ, Boldt K, Ueffing M.: Strep/FLAG tandem affinity purification (SF-TAP) to study protein interactions. Curr Protoc Protein Sci Aug;Chapter 19:Unit19.20.) Wykorzystywane na ćwiczeniach bufory: TBS: 30 mm Tris-HCl ph mm NaCl Bufor lizujący: TBS bufor 0.5% Nonidet-P40 1 x koktajl inhibitorów proteaz (Sigma-Aldrich) Bufor przemywający: TBS bufor 0.1% Nonidet-P40. Bufor do elucji z destiobiotyną: TBS bufor 2 mm destiobiotyna (IBA). Bufor do elucji FLAG: TBS bufor 200 µg/ml FLAG peptide (Sigma-Aldrich). Przygotowanie złóż przed rozdziałem: 1. przygotowanie złoża Strep Tactin superflow (IBA): przepłukać 2 x po 4 objętości złoża buforem TBS i 1 x po 4 objętości złoża buforem lizującym; po każdym płukaniu krótko zwirować. 2. przygotowanie złoża anti-flag-m2 agarose (Sigma-Aldrich): przemyć 3 x po 4 objętości złoża buforem TBS; zawiesić złoże w buforze TBS i przenieść do kolumienki, usunąć bufor (5 s, 100 x g). 3

4 Protokół oczyszczania kompleksów białkowych: 1. usunąć medium z szalek, komórki można przepłukać ciepłym buforem 1xPBS; 2. zdrapać komórki HEK293 z szalek, wirować (1 000 rpm, 10 min., 4 C); spulować wszystkie komórki do jednej probówki; 3. komórki zawiesić w odpowiedniej ilości zimnego buforu lizującego; 4. lizować komórki przez min., trzymać na lodzie; od czasu do czasu mieszać; 5. zwirować pozostałości komórek (10 min., x g, 4 C); 6. przepuścić supernatant przez filtr strzykawkowy (0.22 µm), aby uzyskać klarowny lizat; 7. inkubować lizat ze złożem Strep Tactin superflow (200 µl) przez 1 godz. w 4 C z mieszaniem (rotator); 8. zwirować (30 s., x g, 4 C), zbierać supernatant tak, aby pozostało 500 µl i przenieść do kolumny microspin; 9. usunąć pozostały supernatant poprzez wirowanie w kolumnie microspin (5 s, 100 x g), przemyć buforem przemywającym 3 x 500 μl, zwirować (5 s, 100 x g, 4 C) za każdym razem, aby usunąć supernatant; 10. elucja za pomocą buforu do elucji z destiobiotyną, 1 x 500 μl i inkubacja przez 10 min. na lodzie, mieszać kilka razy złoże, aby zapewnić równomierną dystrybucję buforu; 11. przenieść kolumnę do nowej probówki, zebrać eluat za pomocą wirowania (10 s, x g, 4 C); 12. przenieść eluat z I etapu oczyszczania do probówki ze złożem anti-flag-m2- agarose (100 µl) w microspin kolumnie; 13. inkubować przez 1 godz. w 4 C z mieszaniem (rotator); 14. przemyć buforem przemywającym, 1 x 500 μl i buforem TBS 2 x 500 μl (zwirować 5 s, 100 x g za każdym razem, aby usunąć supernatant); 15. elucja za pomocą buforu do elucji FLAG (200 μl) i inkubować przez 10 min na lodzie, mieszać kilka razy złoże, aby zapewnić równomierną dystrybucję buforu; 16. przenieść do nowej probówki i zwirować (10 s, x g); 17. otrzymane eluaty wykorzystać do rozdziału oczyszczonych białek metodą SDS- PAGE i identyfikacji techniką MS. 18. jeżeli otrzymana objętość eluatów jest zbyt duża, można je zagęścić wykorzystując kolumienki Vivaspin (Sartorius). 4

5 Schematyczny protokół procedury SF-TAP (Strep II- Flag -Tandem Affinity Purification) Zagadnienia do sprawozdania: 1. Aby wyniki uzyskane za pomocą eksperymentu przeprowadzonego na ćwiczeniach były wiarygodne należy je porównać z wynikami uzyskanymi z komórek stanowiących kontrole negatywne. Proszę zaproponować kontrole negatywne do tego eksperymentu. 2. Proszę opisać zalety i wady tandemowej chromatografii powinowactwa (TAP). 3. Kofaktorem pewnego ludzkiego enzymu jest kalmodulina. Proszę napisać, w jaki sposób można ten fakt wykorzystać przy oczyszczaniu kompleksów białkowych tworzonych przez ten enzym. Proszę krótko wymienić możliwe ograniczenia wybranej metody oczyszczania. Sprawozdanie powinno zawierać: - krótko sformułowany cel ćwiczenia; - odpowiedzi na zagadnienia odnoszące się do danego ćwiczenia. Proszę nie umieszczać w sprawozdaniu: wstępu teoretycznego; opisu wykonania ćwiczenia. Sprawozdanie można oddać w wersji papierowej (pokój C020) lub przesłać w formie elektronicznej: ewelina.fic@uj.edu.pl. Ostateczny termin oddawania sprawozdania to 7 dni od daty wykonania ćwiczenia nr 10. 5