Warszawa, 25 sierpnia 2016

Transkrypt

1 ul. S. Banacha 2c, Warszawa TEL.: , FAX: , sekretariat@cent.uw.edu.pl Warszawa, 25 sierpnia 2016 Dr hab. Joanna Trylska, prof. UW joanna@cent.uw.edu.pl Rada Naukowa Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk ul. Pawińskiego 5a Warszawa Recenzja rozprawy doktorskiej mgra Mirosława Śmietańskiego pt. "Charakterystyka strukturalna ludzkiej metylotransferazy CMTr1 działającej na koniec 5ʹ produktów syntezy polimerazy RNA II" Przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska pana Mirosława Śmietańskiego została złożona w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN. Praca została wykonana w dwóch laboratoriach w Międzynarodowym Instytucie Biologii Molekularnej i Komórkowej: w Laboratorium Struktury Białka kierowanym przez dra hab. Marcina Nowotnego i w Laboratorium Bioinformatyki i Inżynierii Białka kierowanym przez prof. Janusza Bujnickiego. Promotorem rozprawy jest dr hab. Marcin Nowotny. Głównym celem pracy było określenie struktury kompleksów domeny katalitycznej metylotransferazy CMTr1 w formie wolnej i z różnymi ligandami i na tej podstawie poznanie mechanizmu rozpoznawania tych ligandów. Polimeraza RNA to enzym wytwarzający RNA. Polimeraza RNA II wytwarza pre-mrna. Takie pre-mrna posiada na 5' końcu tzw. cap, czyli czapeczkę lub kap. Jest to guanozyna przyłączona poprzez nietypowe wiązanie 5'-5' trifosforanowe. W komórkach ludzkich występują różne struktury kapu, w szczególności guanozyna jest metylowana w pozycji N7. Występują także modyfikacje rybozy (metylacja w pozycji 2'-OH) kolejnych transkrybowanych w kierunku końca 3' nukleotydów. To jaką czapeczkę ma RNA syntezowane przez polimerazę II zależy m. in. od organizmu oraz od klasy/rodzaju RNA, które polimeraza II syntezuje. Na przykład wirusy chcąc upodobnić swoje mrna do mrna gospodarza także posiadają strukturę kap. Obecność czapeczki na końcu pre-mrna lub dojrzałego mrna powoduje, że jest on rozpoznawany przez różne funkcjonalne białka. Kap działa więc jako znacznik RNA i jest niezbędny do wielu procesów w komórce, w tym translacji. Kap stabilizuje także mrna i

2 zapobiega jego degradacji przez nukleazy. Jednak funkcje różnych kapów są cały czas przedmiotem badań. Rozpoznawanie struktury kap przez różne strukturalnie i sekwencyjnie białka wydaje się działać na podobnej zasadzie. Miejsca wiążące są podobne i zawierają aminokwasy aromatyczne, które zapewniają oddziaływania stakingowe z m 7 -guaniną. Warstwowe ułożenie aminokwasów hydrofobowych umożliwia wejście w taki klaster m 7 G. Modyfikacja końca 5' łańcucha RNA do struktury kap odbywa się przy użyciu enzymów modyfikujących. Szlak takiej syntezy jest kilkuetapowy i na końcowych etapach wymagających metylacji rybozy w pozycji 2'-OH biorą udział metylotransferazy. Reakcja enzymatyczna z udziałem metylotransferazy wymaga kofaktora, czyli donora grupy metylowej i jest nim S-adenozylo-L-metionina (tzw. SAM). Jedna z takich metylotransferaz, ludzka CMTr1, była przedmiotem rozprawy doktorskiej pana Mirosława Śmietańskiego. Metylotransferaza CMTr1 jest białkiem wielodomenowym ale kluczowa dla reakcji enzymatycznej jest domena katalityczna. Celem pracy było scharakteryzowanie strukturalne domeny katalitycznej metylotransferazy CMTr1 oraz wyjaśnienie mechanizmów jej oddziaływania ze strukturą kap, a dokładnie kap0 m 7 -GpppG, którą CMTr1 ma modyfikować w pierwszej transkrybowanej G. W tym celu doktorant zastosował krystalografię roentgenowską i określił strukturę trzeciorzędową tej domeny w formie wolnej oraz w kompleksach z kap0, kap0 z trzeba kolejnymi nukleotydami oraz z kofaktorem SAM. Wyznaczenie tych struktur umożliwiło także porównanie sposobów oddziaływania CMTr1 z jej wirusowymi odpowiednikami. Rozprawa doktorska zawiera 147 stron i 95 odnośników literaturowych. Składa się ze Streszczenia, pięciu rozdziałów, Podsumowania i Spisu Literatury. W rozdziale 1 autor opisuje szczegółowo strukturę i funkcję końca 5'-RNA czyli kapu, a także proces biosyntezy tego końca oraz strukturę znanych metylotransferaz 2'-O-rybozy modyfikujących struktury kapu. W jednostronicowym rozdziale 2 wypunktowany jest cel pracy. Rozdział 3 zawiera opis materiałów oraz metod. W rozdziale 4 opisane są wyniki pracy: uzyskanie białka CMTr1 oraz krystalizacja i opis struktury domeny katalitycznej CMTr1 w formie wolnej i z różnymi analogami kapu. W rozdziale 5 autor dyskutuje uzyskane wyniki. Rozprawę kończy krótkie podsumowanie najważniejszych zagadnień. Jeśli chodzi o opis wyników to jest on jasny, można prześledzić kolejność przeprowadzonych eksperymentów i cel każdego z nich. Aby osiągnąć pierwotnie postawiony cel pracy, czyli ustalenie mechanizmu działania białka CMTr1 poprzez jego charakterystykę strukturalną w kompleksie z analogiem substratu, w pierwszym etapie autor pracował nad uzyskaniem nadprodukcji i oczyszczaniem całego białka CMTr1. Dla białka pełnej długości nie powiodło się to, gdyż nie udało się uzyskać nadprodukcji rozpuszczalnej formy CMTr1, nawet pomimo fuzji z innym rozpuszczalnym białkiem. Z tego powodu autor pokusił się o predykcje domen w białku i przeanalizował strukturę drugorzędową. Wytypował domenę katalityczną i w kolejnych doświadczeniach wybrał tylko ten fragment białka, który miał aktywność metylotransferazy. Ten fragment to ciąg aminokwasów od 126 do 550 i nadprodukcja oraz oczyszczanie tej katalitycznej domeny powiodły się. Udało się także otrzymać kryształy, które jednak nie nadawały się do rozwiązania struktury. Po

3 wielu kolejnych próbach optymalizacji warunków krystalizacji autor uzyskał dobrze rozpraszające kryształy. Dobrał także warunki i uzyskał dobrze rozpraszające kryształy domeny CMTr1 w kompleksie z analogiem kapu m 7 GpppG i kofaktorem SAM. Aby rozwiązać strukturę krystalograficzną wolnego białka CMTr1 autor rozprawy zastosował metodę dyfrakcji anomalnej na selenometioninowych pochodnych białka. Aby rozwiązać strukturę białka w kompleksie z analogiem kapu i SAM - metodę podstawienia cząsteczkowego wykorzystując jako odniesienie model białka wolnego. Rozwiązane i udokładnione struktury porównał następnie ze strukturą odpowiadających im białek wirusowych. Aby w pełni zrozumieć mechanizm przeniesienia grupy metylowej z SAM na pierwszy transkrybowany nukleotyd określił jeszcze strukturę domeny katalitycznej białka CMTr1 z oligonukleotydem posiadającym kap. Wszystkie uzyskane struktury są dostępne w Protein Data Bank pod kodami: 4N4A, 4N48, 4N49 i zostały opublikowane w Nat. Commun. w 2014 roku. Analiza struktur krystalograficznych pod kątem oddziaływania substratów z CMTr1 pozwoliła ustalić, które aminokwasy są kluczowe dla stabilizacji kompleksu. Co ważne i ciekawe potwierdzono potem wpływ kilkunastu (wybranych na podstawie struktur krystalograficznych) polarnych aminokwasów w miejscu aktywnym na funkcję katalityczną metylotransferazy. Pojedyncze aminokwasy mutowano na alaninę i sprawdzano jak te mutacje wpływają na działanie CMTr1. W ten sposób pośrednio sprawdzano destabilizację określonych wiązań wodorowych w miejscu wiążącym substraty reakcji. Dla wielu mutantów skuteczność metylacji spadła kilkukrotnie ale, co ciekawe, można było zaobserwować różnice aktywności w zależności od wprowadzonej mutacji. Można by się pewnie pokusić o sprawdzenie czy istnieje korelacja między aktywnością mutantów a ilością czy długością wiązań wodorowych, które są tworzone przez zmutowany aminokwas. Należy podkreślić, że struktura krystalograficzna nie była końcowym etapem badań ale posłużyła do zaplanowania i przeprowadzenia kolejnych badań biochemicznych. W Dyskusji autor bardziej szczegółowo opisał oddziaływania poszczególnych fragmentów substratów z miejscem aktywnym metylotransferazy CMTr1. Porównał sieć i sposoby tych oddziaływań z metylotransferazami wirusowymi oraz innymi białkami wiążącymi kap. W większości przypadków m 7 G jest stabilizowana oddziaływaniem stackingowym od góry i od dołu przez hydrofobowe aminokwasy. W przypadku CMTr1 autor twierdzi, że tak nie jest i że kluczowe są wiązania wodorowe między Glu373 oraz atomami N7 i O6 pierścienia m 7 G (na przykład rysunek 5.2). Jednak w takiej wzajemnej konformacji Glu373 oraz m 7 G nie widzę możliwości utworzenia wiązania wodorowego ze względu na kąt, który wygląda mi na 90 stopni. Jest to w sumie istotne z punktu widzenia różnic między sposobami wiązania substratów w różnych enzymach, tak więc stwierdzenie na stronie 125 jest nieuzasadnione. Żeby możliwe było utworzenie wiązania wodorowego ten kwas Glu373 i m 7 G musiałyby się przekręcić. Odległość w strukturze 4N48.pdb między O6 czy N7 tej guaniny i tlenami Glu373 jest minimum 4.2 Å. Dodatkowo, nie uwzględniono w dyskusji reszty aminokwasowej pod m 7 G (wygląda, że jest to Phe206 z rysunku 4.24). Są też oddziaływania anion-π, więc może to jest ten właśnie przypadek oddziaływań stackingowych a nie wodorowych? Może też warto porównać ułożenie tego kwasu w wolnym enzymie.

4 Po przeczytaniu rozprawy mam kilka drobnych uwag i pytań dotyczących jej zawartości: - Z punktu widzenia czytelnika rozdział dotyczący materiałów i metod jest bardzo techniczny i opisany raczej w formie suplementu publikacji, a nie rozprawy doktorskiej. Są opisy procedur bez wyjaśnienia do czego i po co zostały użyte. Dopiero w rozdziale wyniki dowiadujemy się jak autor planował badania i co po kolei zostało zrobione. Tak więc z punktu widzenia czytelnika rozdział ten nie nadaje się do czytania i według mnie większa część tego rozdziału powinna być umieszczona jako załącznik, do którego autor mógłby się odwołać. Dużo metod jest też w wynikach, na przykład strona Zamiast tego rozdziału z opisem procedur przydałby się opis teoretyczny metodologii, na przykład na czym polega krystalografia roentgenowska biomolekuł i jak się rozwiązuje strukturę. Może niesłusznie ale w rozprawie, w której głównym wynikiem jest uzyskanie mapy gęstości elektronowej i następnie wpasowanie w tę mapę aminokwasów spodziewałabym się choć w skrócie opisu teorii krystalografii (problemu fazowego) i metod stosowanych do rozwiązania struktury. Pojawia się na temat problemu fazowego w zasadzie jedno zdanie na stronie 91. Metody pomocne w rozwiązaniu problemu fazowego są tylko wymienione a nie opisane. Jak na rozprawę doktorską brakuje mi nieco części teoretycznej opisującej od podstaw stosowane metody. Brakuje mi też jakiegoś przykładowego rysunku gęstości elektronowej, na którym widać byłoby jak wpasowano reszty aminokwasowe. - Niektóre wyniki autor uzyskał przy użyciu różnych programów. Nie jest wyjaśnione jednak jakimi metodami te programy wyniki "wyprodukowały". Na przykład na stronie 78 jest napisane, że analiza struktury drugorzędowej oraz trzeciorzędowej została przeprowadzona z wykorzystaniem metod bioinformatycznych ale nie wiadomo jakich, jest to bardzo lakoniczne stwierdzenie. Na stronie 93 wymienione są głównie liczne programy i funkcje użyte do rozwiązania struktury ale nie wiadomo jakich metod te programy używają. - Nie jest dla mnie jasne dlaczego całe białko CMTr1 jest nierozpuszczalne skoro w komórce kompletne białko pełni swoją funkcję? Rozumiem wyjaśnienia autora dotyczące fragmentów nieustrukturyzowanych, które mogą wpływać na tę rozpuszczalność ale w komórkach również te fragmenty występują. W takiej sytuacji jedynym powodem była pewnie niewystarczająca czystość uzyskanego białka? - na rysunku 4.13 na mapie Ramachandrana jest kilka aminokwasów nie mieszczących się w normie jeśli chodzi o kąty psi i phi. Czy sprawdzono dlaczego tak jest i co się dzieje w strukturze, że takie kąty są wymuszone? - rysunek przydałaby się jakaś lista tych wiązań wodorowych wraz z długościami. - na wykresie 4.25 błędy są dosyć duże a nie widzę analizy istotności statystycznej tych wyników? Autor nie uniknął kilku bardzo drobnych literówek i błędów. Nie obniżają one jednak w żadnym stopniu wartości rozprawy ani nie utrudniały jej zrozumienia ale wyszczególnienie ich wynika z mojej roli recenzenta. Na przykład: strona 14:.."obecne są również dwie grupy metylowe przyłączane są do atomu azotu".. są trzeba wykreślić z tego zdania

5 strona 33: "tą domenę" powinno być "tę domenę" strona 34: "zapewnia wysoką wydajnością transformacji." powinno być "wydajność" strona 70: "zestaw danych o rozdzielczość do 2,35 Å" powinno być "rozdzielczości" ten sam błąd w następnej linii. strona 77: "jeststabilna" powinno być "jest stabilna" brakuje też kropek na końcu niektórych zdań na przykład na stronach 78, 83. strona 115: nie rozumiem stwierdzenia "Przygotowała również reakcję metylacji" strona 122: "decyduje występowania oddziaływania" powinno być "występowanie" strona 125: "m7g" powinno być "m 7 G" Te drobne uchybienia nie podważają jednak w żaden sposób wysokiej jakości przeprowadzonych badań i co ważne przeprowadzonych cierpliwie oraz z sukcesem, gdyż udało się rozwiązać strukturę ważnej katalitycznej domeny ludzkiego białka CMTr1. Mimo, że białko to zostało odkryte wiele lat temu to nie było na jego temat żadnych informacji strukturalnych. Poprzednie dane strukturalne dotyczyły jedynie białek wirusowych. Wiele protokołów wymagało nie tylko trudnej ale i żmudnej pracy, systematyczności i stanowczości autora w dążeniu do celu. Imponuje także różnorodność technik, które jak rozumiem autor sam zastosował: od nadprodukcji i oczyszczania białka poprzez krystalizację do rozwiązania i udokładnienia struktury trójwymiarowej oraz wyciągnięcia wniosków na temat mechanizmów oddziaływania tego białka ze strukturami kap. Dodatkowo, określenie różnic na poziomie atomowym pomiędzy ludzką i wirusową metylotransferazą 2'-OH rybozy pozwoli na projektowanie inhibitorów tego enzymu celujących specyficznie w jeden tylko enzym. Podsumowując stwierdzam, że rozprawa doktorska magistra Mirosława Śmietańskiego stanowi oryginalne rozwiązanie zagadnienia/problemu naukowego, potwierdza ogólną wiedzę teoretyczną w dyscyplinie naukowej oraz umiejętność samodzielnego prowadzenia pracy naukowej przez autora. Tym samym recenzowana przeze mnie rozprawa doktorska spełnia wszystkie warunki ustawy o tytule naukowym i stopniach naukowych. W związku z tym wnoszę o dopuszczenie mgra Mirosława Śmietańskiego do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Ze względu na nakład pracy nad produkcją i krystalizacją białka oraz rozwiązaniem struktury, ilość zarówno trudnej jak i żmudnej pracy oraz solidne opanowanie wielu technik doświadczalnych, wnoszę także o wyróżnienie rozprawy.