(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 3/74 (06.01) A61K 39/39 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/1 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Aktywacja glikolipidem bakteryjnym komórek NKT podlegających restrykcji CD1d () Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 07/44 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 13/09 (73) Uprawniony z patentu: Brigham Young University, Provo, US THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE, La Jolla, US The University of Chicago, Chicago, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 LUC TEYTON, Del Mar, US ALBERT BENDELAC, Chicago, US PAUL SAVAGE, Mapleton, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis Oświadczenie dotyczące sponsorowanego federalnie badania [0001] Wynalazek ten został wykonany z rządowym wsparciem Stanów Zjednoczonych przyznawanym przez Narodowe Instytuty Zdrowia, Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (Grant nr Al0372). Rząd Stanów Zjednoczonych ma pewne prawa w tym wynalazku. 1 2 WPROWADZENIE [0002] Cząsteczka CD1d jest członkiem rodziny CD1 cząsteczek związanych z mikroglobuliną β2. W przeciwieństwie do cząsteczek klasy I i II głównego układu zgodności tkankowej (MHC), które prezentują odpowiednio antygeny białkowe komórkom T CD8 + i CD4 +, cząsteczki CD1 ewoluowały aby wychwytywać i obrabiać zarówno własne jak i obce antygeny lipidowe do eksponowania komórkom T. Wykazano, że cząsteczki CD1a,-b i-c prezentują obce antygeny drobnoustrojowe ludzkim limfocytom T TCRαβ. Przeciwnie komórki T podlegające restrykcji CD1d lub komórki NKT, są populacją komórek pamięci podobnej do wrodzonej / efektorowych wyrażających zarówno receptory NK jak i konserwowane, semi-inwariant (ang. semiinvariant)- TCR (Vα14-Jα18/Vβ8 u myszy i Vα24-Jα18/Vβ11 u ludzi). Podobnie jak komórki NK, komórki NKT konstytutywnie wyrażają mrna, ale nie białko dla IFN-γ, potwierdzając ich gotowy stan efektorowy. Komórki NKT biorą udział w tłumieniu autoimmunizacji i odrzucaniu przeszczepu, promocji odporności na patogeny i promocji odporności na nowotwory. [0003] Podczas gdy wiadomo, że komórki NKT odpowiadają na α-galaktozyloceramid (αgal-cer), zastępczy ligand pochodzący z morskiej gąbki, brak wiedzy o ich naturalnych antygenach wykluczał uprzednio zrozumienie mechanizmów ich aktywacji obwodowej i rekrutacji, jak również ich rozwoju w grasicy. [0004] Wynalazcy uprzednio zidentyfikowali naturalny endogenny antygen izoglobotriheksozyloceramid (igb3), który jest prezentowany komórkom NKT przez komórki dendrytyczne aktywowane LPS. Praca ta sugeruje, że igb3 jest podstawowym ligandem dla komórek NKT. Jednak, częściowe zróżnicowanie łańcucha β TCR sugeruje, że może być możliwa wielokrotna naturalna swoistość antygenu STRESZCZENIE [000] W niniejszym dokumencie opisane jest nieoczekiwane odkrycie twórców, że glikolipidy pochodzące od członków klasy Alphaproteobacteria również działają jako naturalne ligandy cząsteczek CD1d do aktywacji komórek NKT. [0006] W jednym aspekcie, wynalazek dostarcza sposobu aktywowania komórek NKT obejmującego kontaktowanie komórki NKT z glikolipidem bakterii skompleksowanym z zimną cząsteczką (ang. Cold molekule). W niektórych wykonaniach glikolipid bakteryjny może pochodzić od członka klasy Alphaproteobacteria. [0007] W innym aspekcie, wynalazek dostarcza sposobu indukowania ekspresji cytokin przez komórkę NKT obejmującego kontaktowanie receptora dla komórki T z komórki NKT z glikolipidem bakteryjnym skompleksowanym z cząsteczką CD1d. [0008] W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dotyczy sposobu stymulowania odpowiedzi odpornościowej u osobnika, obejmującego podawanie pacjentowi skutecznej ilości komórek NKT aktywowanych przez skontaktowanie receptora komórek T z komórek NKT z glikolipidem bakteryjnym skompleksowanym z cząsteczką CD1d. 1

3 [0009] W dalszych aspektach, wynalazek dostarcza sposobów poprawy skuteczności szczepionki, promowania odrzucenia nowotworu, modulacji autoimmunizacji, hamowania nadwrażliwości wywołanej alergenem i leczenia zakażenia u pacjenta przez podawanie skutecznej ilości glikolipidu bakteryjnego pochodzącego od członka klasy Alphaproteobacteria. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [00] Fig. 1A przedstawia sekrecję IFN-γ zależną od CD1d przez mysie i ludzkie komórki NKT stymulowane zabitymi termicznie bakteriami lub αgal-cer. Średnia i odchylenie standardowe z 3 doświadczeń. Fig. 1B przedstawia proliferację komórek NKT w hodowli komórek śledziony stymulowanych zabitymi termicznie bakteriami lub αgal-cer. Punkty danych pokazują średnie i odchylenia standardowe z 3 oddzielnych doświadczeń. Fig. 1C przedstawia proliferację komórek NKT w odpowiedzi na bodźce bakteryjne lub αgal-cer. Górny rząd, barwienie komórek śledziony CD1d-αGal-Cer/B2 z bramką komórki NKT i procent jak wskazany. Dolny rząd, profil rozcieńczania CFSE z x 3 bramkowanych komórek NKT. Fig. 2A przedstawia IFN-γ uwolniony przez całe komórki śledziony hodowane z zabitą termicznie Salmonella typhimurium, Sphingomonas capsulata i Ehrlichia muris przez 48 godzin. Lewy panel, dane przedstawiono jako procent kontroli typu dzikiego. Prawy panel dane przedstawiono jako średnią i odchylenie standardowe z dwóch do trzech odrębnych doświadczeń. Fig. 2B przedstawia blokadę odpowiedzi ludzkich komórek NKT na antygen DC plus przez lektynę IB4. Podobne dane uzyskano w dwóch eksperymentach. Fig. 2C przedstawia stymulację odpowiedzi mysich komórek NKT na antygen bakteryjny prezentowany przez DC Hexb + / - lub Hexb -/ -. Podobne dane uzyskano w dwóch doświadczeniach. Fig. 3A przedstawia struktury syntetycznych antygenów ściany komórkowej Sphingomonas. PBS 0 jest kontrolnym β-glukuronozyloceramidem. Fig. 3B przedstawia odpowiedź IFN-γ ludzkiej linii NKT Vα24-Jα18 i świeżych oczyszczonych mysich komórek NKT stymulowanych syntetycznymi antygenami lipidowymi i DC. Przedstawione dane stanowią średnią i odchylenie standardowe z dwóch odrębnych doświadczeń. Fig. 3C przedstawia barwienie tetrametrem CD1d ludzkich NKT (górny rząd) i komórek mysiej śledziony (dolny rząd) z syntetycznymi glikolipidami. Bramka komórki NKT i procenty są, jak wskazane. Fig. 4A przedstawia aktywację in vivo komórek NKT 24 godziny po dożylnym zakażeniu Sphingomonas (1x 7 ), Ehrlichia (1x 8 ) i Salmonella (1x 6 ). Podobne wyniki uzyskano w 2 doświadczeniach. Fig. 4B przedstawia produkcję IFN-γ przez komórki NKT w odpowiedzi na Salmonella. Różnica między Hexb + / + i Hexb -/ - była znacząca dla Salmonella (p = 0,001). Analizowano trzy myszy na grupę i uzyskano podobne wyniki w 2 niezależnych doświadczeniach. Fig. 4C przedstawia obciążenie bakteryjne w płucach myszy CD1d + / - i CD1d -/ - po zakażeniu ze wskazaną CFU Sphingomonas (każdy słupek reprezentuje 4 do myszy). Wskazane są wzrost krotności i wartości p. Przedstawiono dwa reprezentatywne doświadczenia. Fig. 4D przedstawia ostrą śmiertelność u myszy po inokulacji wysoką dawką x 8 Sphingomonas capsulata. Pokazane są oddzielne doświadczenia porównujące CD1d + / - i CD1d -/ - (n = 24 każde, p <0,0001) i Jα18 + / - i Jα18 -/ - (n = 12 każde, p = 0,034). Fig. 4E przedstawia ostre surowicze uwalnianie IFN-γ i IL-12 p40 u heterozygotycznych i homozygotycznych 2

4 zmutowanych myszy CD1d i Jα18 i kontroli miotu po zakażeniu 1x 7 Sphingomonas capsulata. Podobne wyniki otrzymano w 2 niezależnych doświadczeniach. Fig. 4F przedstawia zliczenia PCR Ehrlichia w płucach, wątrobach i śledzionach myszy CD1d + /- i CD1d -/ - odzyskane w dniu 2 i dniu 7 po zakażeniu (każdy słupek reprezentuje 3 myszy). Wskazane są wzrost krotności i wartości p. Przedstawiono jedno reprezentatywne doświadczenie. Fig.. przedstawia kilka syntetycznych glikolipidów pochodzących z bakterii klasy Alphaproteobacteria. Fig. 6 przedstawia przykładowy schemat syntezy dla glikolipidu 61 PBS SZCZEGÓŁOWY OPIS RÓŻNYCH WYKONAŃ [0011] Komórki T ograniczone do CD1 wykonują funkcje zarówno efektorowe jak i pomocnicze i oddziałują z różnymi typami komórek, w tym makrofagami, komórkami dendrytycznymi, komórkami NK, komórkami T i komórkami B, w ten sposób przyczyniając się do zarówno wrodzonej jak i nabytej odpowiedzi odpornościowej. Podzbiór tych komórek T, komórki NKT, znane również jako komórki T podlegające restrykcji CD1d- lub komórek T CD1d tetramer +, cechują się niezmiennymi łańcuchami TCRα, reaktywnością z własnym lipidem i szybkimi odpowiedziami efektorowymi. Komórki te odgrywają ważną rolę w wielu funkcjach odpornościowych, w tym odpowiedziach przeciwdrobnoustrojowych, odporności przeciwnowotworowej i w regulacji równowagi między tolerancją a autoimmunizacją. [0012] Pod nieobecność obcych antygenów komórki, NKT są stymulowane przez ekspozycję na komórki CD1 + prezentujące antygen, takie jak monocyty, komórki dendrytyczne (DC) i makrofagi. Klasy własnych antygenów, które mogą być prezentowane komórkom NKT i przez nie rozpoznawane obejmują fosfolipidy, takie jak fosfatydyloinozytol, fosfatydyloetanoloamina i fosfatydyloglicerol, jak również sfingolipidy. Jednak nie wszystkie klasy wywołują odpowiedź w komórkach NKT pod względem uwalniania cytokin. [0013] Wiadomo, że komórki NKT rozpoznają α-galaktozyloceramid (αgal-cer), glikosfingolipid znaleziony w gąbkach morskich. Cząsteczka ta nie ma znanego działania immunologicznego i innego fizjologicznego u ssaków, ale jest szeroko stosowana przez badaczy do badania aktywacji NKT. Przed niniejszym wynalazkiem nie była znana aktywacja NKT przez bezpośrednią prezentację drobnoustrojowych glikolipidów. [0014] Komórki NKT są szybko aktywowane po stymulacji przez polarne antygeny lipidowe prezentowane przez CD1d. Termin "aktywacja," jak tu stosowany i w dziedzinie dotyczy sekrecji przez komórki NKT IFNγ, IL-4, IL-2, IL-, IL-13, GM-CSF lub TNF-α, lub kombinacji tych cytokin po kontakcie z CD1d prezentującymi antygeny stymulujące. Alternatywnie, "aktywacja" może dotyczyć zwiększonej ekspresji markerów powierzchniowych komórki dla aktywowanych komórek T, na przykład CD69. [001] Aktywacja komórek NKT obejmuje kontaktowanie komórki NKT lub bardziej konkretnie, receptora komórki T (TCR) z komórki NKT z bakteryjnym polarnym lipidem skompleksowanym z CD1d. Glikolipidy są odpowiednimi rodzajami polarnych lipidów. Zatem w pewnych wykonaniach aktywacja komórek NKT obejmuje kontaktowanie komórki NKT z glikolipidem bakteryjnym pochodzącym od członka klasy Alphaproteobacteria. Termin "Receptor komórki T z komórki NKT," jak tu stosowany, odnosi się do konserwatywnych, semi-inwariant TCR z komórek NKT obejmujących np. Vα14-Jα18/Vβ8 u myszy i Vα24-Jα18/Vβ11 u ludzi. "Kontaktowanie", jak tu stosowane, odnosi się do dodania in vitro glikolipidu bakteryjnego w roztworze do immobilizowanych, rozpuszczalnych lub nierozpuszczalnych cząsteczek CD1d lub do podawania in vivo bakteryjnego glikolipidu osobnikowi mającemu komórki prezentujące antygen, które wyrażają cząsteczki powierzchniowe komórki CD1d. 3

5 [0016] Aktywacja komórek NKT może być zmierzona dowolnym odpowiednim sposobem in vitro lub ex vivo. Przykładem testu in vitro umożliwiającego ocenę aktywacji komórki NKT jest współhodowanie komórek NKT z komórkami prezentującymi antygen (APC), takimi jak komórki dendrytyczne (DC), w obecności aktywatora glikolipidu bakteryjnego lub domniemanego aktywatora, a następnie oznaczanie na IFN-γ lub inne wydzielane cytokiny w supernatancie. Alternatywnie, aktywacja komórek NKT może być zmierzona ex vivo przez podanie osobnikowi bakteryjnego antygenu glikolipidowego lub przez podawanie osobnikowi CD1d + komórek prezentujących antygen po kontakcie ex vivo z glikolipidami bakteryjnymi. Komórki NKT od tych osobników mogą być izolowane przez np. barwienie tetramerem-cd1d i bramkowane przez cytomerię przepływową, a następnie oznaczane odpowiednimi sposobami na powierzchniowy CD69 (antygen wczesnej aktywacji komórki-t) i /lub wewnatrzkomórkowy IFN-γ. [0017] Alphaproteobacteria jest klasą w typie Proteobacteria składającą się głownie z bakterii mających dwa główne fenotypy: purpurowe niesiarkowe bakterie i tlenowe bakterie zawierające bakteryjny chlorofil. Członkowie bakterii klasy Alphaproteobacteriaare są głownie wyizolowani z gleby, jezior lub stawów. Wiadomo, że kilku członków jest patogenami bakteryjnymi. [0018] Klasa Alphaproteobacteria obejmuje sześć rzędów: Rhodospirillales, Rickettsiales, Rhodobacterales, Sphingomonadales, Caulobacterales i Rhizobiales (Garrity, GM et al., Taxonomic Outline of the Procaryotic Genera, BERGEY'S MANUAL of Systematic Bacteriology, wyd. 2nd, kwiecień 01). Glikolipidy bakteryjne, które mogą być przydatne w aktywowaniu komórek NKT mogą pochodzić od członków dowolnych z tych rzędów. Jednak członkowie rzędów Rickettsiales, Sphingomonadales i Rhizobiales są rozpatrywani jako szczególnie odpowiedni. [0019] Rząd Rickettsiales obejmuje trzy rodziny: Rickettsiaceae, Ehrlichiaceae i Holosporaceae. Lipidy polarne pochodzące od członków Ehrlichiaceae w rodzaju Ehrlichia są rozpatrywane jako odpowiednie. Na przykład, mogą być odpowiednie glikolipidy pochodzące z E. muris. [00] Rząd Sphingomonadales obejmuje rodzinę Sphingomonadaceae. Glikolipidy pochodzące od członków tej rodziny w rodzaju Sphingomonas, na przykład, od S.capsulata, są rozpatrywane jako odpowiednie. [0021] Rząd Rhizobiales obejmuje dziesięć rodzin: Rhizobiaceae, Bartonellaceae, Brucellaceae, Phyllobacteriaceae, Methylocystaceae, Beijerinckiaceae, Bradyrhizobiaceae,Hyphomicrobiacea, Methylobacteriaceae i Rhodobiaceae. Glikolipidy pochodzące od członków Brucellaceae w rodzaju Brucella są rozpatrywane jako odpowiednie do stosowania w powyżej wymienionych sposobach. [0022] Sphingomonas capsulata jest patogenem z klasy Alphaproteobacteria, który jest gram-ujemną, lipopolisacharydo(lps)-ujemną bakterią, której lipidy ściany komórkowej zostały dokładnie scharakteryzowane. Glikolipidy pochodzące ze ścian komórkowych tych bakterii mogą być stosowane do aktywacji komórek NKT. [0023] Podobnie, członkowie rodzaju Ehrlichia są gram-ujemnymi, LPS-ujemnymi bakteriami, których lipidy ścian komórkowych mogą być stosowane do aktywacji komórek NKT. Chociaż lipidy ściany komórkowej Ehrlichia nie są tak dobrze scharakteryzowane, jak te z Sphingomonas capsulata, planuje się, że członkowie tego rodzaju będą działać, aby aktywować komórki NKT w odpowiednich oznaczeniach aktywacji, jak również in vivo. [0024] Brucella jest innym rodzajem w klasie, o którym wiadomo, że jest patogenny. Cztery gatunki tego rodzaju, które mogą zakażać ludzi obejmują B. abortus, B. suis, B. melitensis i B. canis. Choroba brucelloza u ludzi jest charakteryzowana albo jako ostra choroba gorączkowa albo uporczywa choroba z szeroką gamą 4

6 1 objawów. Jest prawdziwą chorobą odzwierzęcą, ponieważ rzeczywiście wszystkie ludzkie infekcje są nabyte od zwierząt. Powszechna jest infekcja podkliniczna. W przeciwieństwie do Ehrlichia I Sphingomonas spp., zewnętrzna błona komórkowa obejmuje dominujący składnik LPS i trzy główne grupy białek. Planuje się, że konkretne funkcje lub składniki tych bakteryjnych ścian komórkowych mogą być stosowane do bezpośredniej aktywacji komórek NKT. [002] Jak zauważono, odpowiednie glikolipidy bakteryjne pochodzą z bakterii z klasy Alphaproteobacteria. "Pochodzący z", odnosi się do wyodrębniania i / lub oczyszczania ze źródeł bakteryjnych, a także odnosi się do syntezy de novo bakteryjnych związków, lub związków racjonalnie zaprojektowanych w oparciu o bakteryjne związki, z zastosowaniem odpowiednich sposobów syntezy znanych w dziedzinie. Jak zostanie docenione przez specjalistów w tej dziedzinie, "glikolipidy bakteryjne" mogą również obejmować zabite termicznie lub atenuowane bakterie. Na przykład, kontaktowanie komórki NKT z glikolipidem bakteryjnym odpowiednio obejmuje kontaktowanie komórki NKT z zabitymi termicznie lub atenuowanymi bakteriami, jak również wyizolowanymi lub syntetycznymi glikolipidami bakteryjnymi. [0026] Termin "glikolipid" oznacza każdy związek zawierający jedną lub więcej resztę monosacharydową związaną wiązaniem glikozydowym z hydrofobową jednostką, taką jak, acyloglicerol, sfingoid, ceramid (Nacylosfingoid) lub fosforanu prenylu. W szczególności, jeden lub więcej polisacharydów związanych z jednostką ceramidową może być szczególnie przydatnych w aktywowaniu komórek NKT. [0027] Glikolipidy bakteryjne odpowiednie do zastosowania w sposobach aktywowania komórek NKT mogą być na ogól o wzorze strukturalnym (I): 2 w którym wskazuje albo pojedyncze wiązanie, w którym X oznacza H lub niższą grupę alkilową, lub wiązanie jonowe, w którym X oznacza przeciwjon, R1 i R2 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z-h, - OH, monosacharydu i oligosacharydu; R 3 oznacza -H lub-oh, R 4 oznacza -H lub-oh, lub razem z R 7 tworzą wiązanie podwójne, R i R 6 oznaczają niezależnie alkil C1-C, przy czym C1-C alkil jest nasycony lub nienasycony i zawiera jedną lub więcej grup cyklopropylowych; a R7 oznacza -H, lub razem z R 4 tworzy wiązanie podwójne. Stosowane tu określenie "niższy alkil" ma odnosić się do prostego lub rozgałęzionego, nasyconego lub nienasyconego rodnika węglowodorowego mającego 1 do 4 atomów węgla. Konkretnymi przykładami takich rodników węglowodorowych są metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, t-butyl, etenyl, propenyl, butenyl, izobutenyl, izopropenyl, formyl, acetyl, propionyl, butyryl lub cyklopropyl. Również, jak tu stosowane "przeciwjon" jest dowolnym dodatnio naładowaną jednostką, która może łączyć się przez wiązanie jonowe z ujemnie naładowanym karboksylanem na glikolipidzie. [0028] Niektóre reprezentatywne przykłady odpowiednich bakteryjnych glikolipidów do tworzenia kompleksów z cząsteczkami CD1d i aktywacji komórek NKT przedstawiono na FIG.. [0029] W szczególności niniejszy wynalazek odnosi się do następujących glikolipidów bakteryjnych:

7 PBS-49, w którym X oznacza metyl; R 1 oznacza -H: R 2 oznacza -OH: R 3 oznacza -OH: R 4 oznacza - H: R oznacza alkil C 11 ; R 6 oznacza alkil C 13 ; a R 7 oznacza -H; PBS-4, w którym X oznacza H: R 1 oznacza -H; R 2 oznacza -OH; R 3 oznacza -OH; R 4 oznacza -H, R oznacza alkil C 11 ; R 6 oznacza alkil C 13 ; a R 7 oznacza -H; PBS-, w którym X oznacza H; R 1 oznacza -H: R 2 oznacza -OH; R 3 oznacza -OH; R 4 oznacza - H; R oznacza alkil C 16 : R 6 oznacza alkil C 1 ; a R 7 oznacza -H; PBS-29, w którym X oznacza H; R 1 oznacza -H: R 2 oznacza -OH; R 3 oznacza -H; R 4 oznacza -OH; Rs oznacza alkil C 23 ; R 6 oznacza alkil C 13 ; a R 7 oznacza -H: PBS-62, w którym X oznacza H; R 1 oznacza -H; R 2 oznacza -OH; R 3 oznacza -OH; R 4 oznacza _-H; R oznacza alkil C 23 ; R 6 oznacza alkil C 1 zawierający jedno podwójne wiązanie; a R 7 oznacza -H; i PBS-6, w którym X oznacza H; R 1 oznacza -H; R 2 oznacza -OH; R 3 oznacza -OH; R 4 oznacza H; R oznacza alkil C 11 ; R 6 oznacza alkil zawierający jedną grupę cyklopropylową; a R 7 oznacza -H. PBS, PBS 4 i PBS 9 zostały zsyntetyzowane w oparciu o znane cząsteczki błony komórkowej Sphingomonas i stwierdzono, że aktywują komórki NKT in vitro. Odwrotnie, PBS 0 i PBS 60 nie aktywują komórek NKT. Pozostałe związki przedstawione na FIG. zostały racjonalnie zaprojektowane w oparciu o następujące cechy, które określono jako powszechne wśród glikolipidów zdolnych do aktywacji komórek NKT: 1) wiązanie glikozydowe typu- alfa i 2) utlenianie w pozycji 6 w węglowodanowej reszcie glikolipidu. [00] W niektórych wykonaniach, aktywacja komórek NKT przez podawanie glikolipidu bakteryjnego zgodnie z wynalazkiem, może dostarczyć środków za pomocą, których można stymulować odpowiedź odpornościową u osobnika. "Odpowiedź odpornościowa", jak tu stosowano, odnosi się do dowolnego podwyższonego poziomu odpowiedzi humoralnej lub komórkowej, który jest mierzalny u osobnika w porównaniu do osobnika z linii podstawowej lub stanu niestymulowanego. Sposoby pomiaru zarówno humoralnej jak i komórkowej odpowiedzi odpornościowej są dobrze znane w tej dziedzinie. Jak można zauważyć, w warunkach in vivo na odpowiedź komórek NKT wpływa, w części, środowisko komórkowe podczas aktywacji. Odpowiedzi odpornościowe T H 1 charakteryzują się przede wszystkim uwalnianiem, np. IL-2, IFN-γ, IL-12 i TNF-α. W przeciwieństwie do tego, cytokiny T H 2 głównie obejmują IL-4, IL-, IL-6, IL- i IL-13. Odpowiedź in vivo komórek NKT może również zależeć od stężenia antygenu lub pierwotnej lub wtórnej ekspozycji na antygen. Na aktywację mogą wpływać interakcje z cząsteczkami ko-stymulującymi komórki NKT i APC np. np. interakcje CD40/CD40L. [0031] Oprócz sekrecji cytokin, aktywowane komórki NKT są silnie cytolityczne przez uwalnianie perforyny i granzymów, jak również granulizyn, i mogą bezpośrednio przyczyniać się do zabicia komórki bakteryjnej i / lub komórki nowotworowej przez sekrecję tych cząsteczek. [0032] Zatem, aktywując komórki NKT u osobnika przez podawanie osobnikowi skutecznej ilości glikolipidu bakteryjnego można wygenerować przeciwdrobnoustrojową odpowiedź odpornościową, a tym samym dostarczyć sposobów leczenia zakażenia u osobnika. Niniejszy wynalazek dotyczy więc glikolipidów wybranych z PBS-49, w PBS-4 PBS-, PBS-29, PBS-62 i PBS-6, do zastosowania w leczeniu chorób zakaźnych. Zakażenie może być wirusowe, bakteryjne lub pasożytnicze, a przeciwdrobnoustrojowa odpowiedź odpornościowa może być wystarczająca do zahamowania wzrostu lub zabicia mikroorganizmu, w tym, np. wirusów, bakterii lub pasożytów. Podawanie można prowadzić dowolnym sposobem zwykle stosowanym w tej dziedzinie, obejmującym, miedzy innymi, podawanie dożylne, dootrzewnowe, domięśniowe, podskórne, przezskórne, doustne, do jamy nosowo-gardłowej lub absorpcję śluzówkową. 6

8 1 2 [0033] Glikolipidy bakteryjne według wynalazku mogą być również stosowane w leczeniu raka, albo w promowaniu odrzucania nowotworu, przez indukowanie przeciwhiperproliferacyjnej odpowiedzi odpornościowej u ssaka. "Leczenie" lub "terapia" nowotworu u ssaka obejmuje jedno lub więcej: (1) hamowanie wzrostu nowotworu, to znaczy, zatrzymanie jego rozwoju, (2) zapobieganie rozprzestrzenianiu się raka, tj. zapobiegania przerzutom, (3) złagodzenie raka, tj., wywołanie regresji nowotworu, (4) zapobieganiu nawrotowi nowotworu, () łagodzenie objawów raka i (6) promowanie odrzucenia jednego lub większej liczby guzów litych. [0034] W konkretnym wykonaniu, glikolipidy bakteryjne według wynalazku można podawać jako adiuwant w celu poprawy skuteczności szczepionki, gdy są współpodawane ze szczepionką. Stosowany tu termin "współpodawanie" lub "współpodawane" odnosi się do podawania co najmniej dwóch składników równolegle, to znaczy jednocześnie w czasie, lub po kolei, tj., podawanie jednego składnika, a następnie podaniu innego składnika. [003] Metody adoptywnego transferu są oparte na podawaniu komórek, które zostały skontaktowane ex vivo z glikolipidami bakteryjnymi w celu stymulowania odpowiedzi odpornościowej u osobnika. W niektórych wykonaniach, komórkami mogą być komórki NKT, które są aktywowane ex vivo i wstrzykiwane osobnikowi w celu zapewnienia lub wzmocnienia odpowiedzi odpornościowej, np. w stosunku do komórek nowotworowych lub drobnoustrojów. W niektórych wykonaniach, podawanie aktywowanych komórek NKT może indukować przeciwhiperproliferacyjną odpowiedź odpornościową w celu promowania odrzucania guzów litych. W innych wykonaniach, komórkami mogą być komórki prezentujące antygen, które zostały skontaktowane ex vivo z glikolipidami bakteryjnymi, aby umożliwić tworzenie się kompleksów glikolipidów bakteryjnych z cząsteczkami CD1d wyrażanymi przez komórkę prezentującą antygen, np. komórkę dendrytyczną. Następnie komórki prezentujące antygen, mogą być podawane, np. przez wstrzyknięcie osobnikowi w celu zapewnienia odpowiedniej odpowiedzi odpornościowej. Ten sposób podawania pozwala na stymulację odpowiedzi odpornościowej z minimalną ekspozycją osobnika lub komórek osobnika na glikolipidy bakteryjne. [0036] Aktywację komórek NKT można również stosować w sposobach modulowania autoodporności lub zahamowaniu indukowanej alergenem nadwrażliwości. Zarówno bezpośrednie podawanie glikolipidów bakteryjnych jak również metody adoptywnego transportu są rozważane dla tych konkretnych traktowań. [0037] Poniższe przykłady są dostarczone w celu dalszego zrozumienia wynalazku. Konkretne materiały i warunki, jakie mają być zastosowane, są przeznaczone do dalszego zilustrowania wynalazku i nie ograniczają go w rozsądnym zakresie Przykład 1. Stymulacja in vitro komórek NKT zabitymi termicznie bakteriami [0038] Szczepy bakteryjne Sphingomonas capsulata (ATCC 14666) i Salmonella typhimurium R71 rosły na agarze Mueller-Hintona. Ehrlichia muris przygotowano jak opisali Ismail N et al., J. Immunol. 172, (04). Bakterie zabito termicznie 2-godzinną ekspozycją na 74 C i zastosowano równoważnik 2, - x 6 cfu /studzienkę do stymulacji in vitro. [0039] Oznaczenia stymulacji wykonano z całymi komórkami śledziony (x na 0 µl/ studzienkę) lub z oczyszczonymi komórkami T i komórkami prezentującymi antygen. Populacje komórek T stosowane w próbach obejmowały sortowane komórki mysiej śledziony CD1d-αGal-Cer + (x 4 na 0 μl studzienkę), ludzkie limfocyty krwi obwodowej (PBL) (x na 0 μl studzienkę) (otrzymane po wirowaniu heparynizowanej krwi z Ficollem) lub ludzkie linie komórkowe NKT (2,x na 0 μl studzienkę). Ludzkie komórki NKT Vα24 pochodziły z PBL stymulowanych αgal-cer i były utrzymywane przez powtarzane rundy stymulacji PHA i IL- 7

9 1 2 2 w obecności napromieniowanych PBMC i transformowanych in vitro EBV komórek B. Komórki prezentujące antygen były komórkami dendrytycznymi, które pochodziły ze szpiku kostnego, były stymulowane GM- CSF/IL-4 (2 ng / ml i ng / ml, Biosource) i hodowane w 2,x na 0 µl studzienkę dla oznaczeń mysich i napromieniowane alogenicznymi ludzkimi PBMC świeżymi lub hodowlanymi przez dni z rekombinowaną ludzką GMCSF/IL-4, (0 µg / ml każdej cytokiny, R & D Systems) (2x na 0 µl studzienkę) dla oznaczeń ludzkich. Komórki przemyto dwukrotnie i głodzono się przez 6 godzin w pożywce same przed dodaniem do eksperymentów stymulacji. [0040] Komórki NKT stymulowano zabitymi termicznie bakteriami, jak wskazano powyżej, przez 48 godzin w 96 studzienkowych okrągłodennych płytkach w pożywce RPMI 1640 (Biofluids) z dodatkiem glutaminy, antybiotyków, x - M 2-ME i % FCS (badania myszy) lub % surowicy AB (badania na ludziach). Stężenia mysiego i ludzkiego IFN-γ w supernatancie mierzono po 48 godzinach stosując odpowiednie zestawy ELISA (BD Bioscience, dolna granica wykrywalności 12, µg / ml). [0041] Całe komórki śledziony stymulowano przez 6 dni x 6 bakterii zabitych termicznie lub 0 ng / ml αgal-cer, a częstotliwość komórek NKT CD1d-αGal-Cer+ mierzono przy stymulacji i 2, 4 i 6 dni po stymulacji. [0042] W 6 dni po stymulacji CD1d-αGal-Cer, CFSE i αb2 (BD Pharmingen) przeprowadzono procedury znakowania i barwienia i analizowano komórki przez FACS. W celu wytworzenia tetramerów CD1d-αGal- Cer mieszaninę µl αgal-cer (z 1mg/ml roztworu podstawowego w DMSO), µl PBS 0,% Tween, µl biotynylowanych CD1d (1 mg/ml) i 7 µl PBS inkubowano w 37 C przez 1 godzinę, i i obciążone lipidem CD1d oczyszczono przez odwirowanie, dializę i skompleksowano ze streptoawidyną-apc. (Benlagha K. et al., J. Exp. Med. 191, (00).) Komórki analizowano na FACSCalibur (BD Biosciences) programem CellQuest. [0043] Wyniki przedstawiono na FIG. 1A-C. Mysie komórki NKT sortowane na tertramer CD1d współhodowano z IFN-γ wydzielanym przez CD CD1 + / - lub CD1 - / - pochodzącymi ze świeżego szpiku kostnego w sposób zależny od CD1d po stymulacji zabitymi termicznie Sphingomonas i Erlichia, jak również kontrolną Salmonella i αgal-cer. (Figura 1A, po lewej) Podobnie, ludzkie komórki NKT współhodowano z IFN-γ wydzielanym przez DC pochodzącymi z PBMC w sposób zależny od CD1d po stymulacji, gdzie zależność od CD1d została zilustrowana za pomocą blokowania 1 µg / ml przeciwciał anty-cd1d lub kontrolnymi IgG1. (Fig. 1A, po prawej). Zawiesiny całych komórek śledziony hodowane w obecności bakterii zabitych termicznie przez 6 dni, wykazały znaczny rozwój i proliferację komórek NKT, tylko nieznacznie mniejsze niż w przypadku czystego αgal-cer. (Fig. 1B-C.) 3 40 Przykład 2. Różne wymagania dla odpowiedzi IFN-γ w stosunku do Sphingomonas i Ehrlichia versus Salmonella [0044] Całe komórki śledziony współhodowane z DC genotypu MyD88-/ -, Triflps2/ips2 i MyD88 -/-Trif lps2/lps2 (brakuje jednego lub dwóch adaptorów MyD88 i TRIF dla sygnalizacji TLR) lub CD1 -/ - były stymulowane przez 48 godzin x 6 Salmonella, Sphingomonas lub Ehrlicha zabitymi termicznie. Stężenia mysiego i ludzkiego IFN-γ w supernatancie mierzono po 48 godzinach za pomocą odpowiedniego zestawów ELISA (BD Bioscience, dolna granica wykrywalności 12, pg / ml). [004] DC poddane impulsom zabitymi termicznie bakteriami, wytworzono w sposób opisany w Przykładzie 1 i dodano do preparatów ludzkich komórek NKT w obecności IB4 (izolektyna B4 Griffonia Simplicifolia) (Vector Laboratories), który wiąże się z końcowym disacharydem igb3, ale nie wiąże się z αgal-cer. Wytwa- 8

10 1 2 rzanie IFN-γ było mierzone przez 48 godzin [0046] DC Hexb -/ -, które nie wytwarzają igb3 w lizosomie, ponieważ brakuje im b-heksozoaminidazy potrzebnej do usunięcia końcowej GalNAc igb4, prekursora igb3, poddano impulsom zabitymi termicznie bakteriami, jak opisano powyżej i dodano do hodowli komórek NKT. Wytwarzanie IFN-γ mierzono przez 48 godzin. Hexb -/- DC. [0047] Wyniki przedstawiono na FIG. 2A-C. W próbie hodowlanej całych komórek śledziony, IFN-γ indukowany Salmonella był drastycznie zmniejszony do 2-1% wartości kontrolnej, średnio, pod nieobecność albo jednego albo dwóch adaptorów TLR (FIG. 2A). W ostrym kontraście, odpowiedź IFN-γ ze śledziony na LPSujemne Ehrlichia i Sphingomonas była w dużej mierze niezależna od MyD88 i TRIF. Komórki NKT pozbawione komórek CD1d -/- ze śledziony nie odpowiedziały na Sphingomonas i Ehrlichia, natomiast odpowiedź na Salmonella była tylko nieznacznie zmniejszona (FIG. 2A, po lewej). Podobnie, komórki NKT typu dzikiego współhodowane z DC z niedoborem MyD88 odpowiedziały na Sphingomonas i Ehrlichia, ale nie na Salmonella (FIG. 2A, po prawej). Chociaż wyniki te sugerują, że we wszystkich śledzionach eksponowanych na zabitą termicznie Salmonella, wytwarzanie IFN-γ było zainicjowane po sygnalizacji TLR komórek prezentujących antygen, a następnie rekrutacji komórek NKT, jak również komórek innych typów, takich jak komórki NK. W przeciwieństwie do tego, stymulacja IFN-γ przez Ehrlichia i Sphingomonas zależała głównie od komórek NKT i CD1d przy minimalnym udziale TLR. [0048] Podobnie, wiązanie lektyny IB4 nie upośledza stymulacji komórek NKT przez DC poddawane impulsom zabitymi termicznie Ehrlichia lub Sphingomonas, zgodnie z bezpośrednim rozpoznaniem odrębnego antygenu bakteryjnego. Jednakże, lektyny łatwo blokowały stymulację Salmonella (FIG. 2B), co sugeruje, że dla odpowiedzi NKT na Salmonella, endogenny igb3 jest prawdopodobnym ligandem. [0049] DC Hexb -l- pulsowane zabitymi termicznie Ehrlichia or Sphingomonas stymulowały komórki NKT jak również DC typu dzikiego (FIG. 2C) Przeciwnie, pulsowane Salmonella DC Hexb -l- nie stymulowały komórek NKT. [000] Podsumowując, wyniki raczej identyfikują endogenny ligand igb3, zamiast antygenu mikroorganizmu, jako cel dla komórek NKT w ich odpowiedzi na zakażenie Salmonella, Przykład 3. Stymulująca komórki NKT odpowiedź na syntetyczne antygeny glikolipidowe [001] α-glukuronozyloceramid (PBS ) i α-galakturanozyloceramid (PBS 9), pochodzące ze znanych antygenów błony komórkowej Sphingomonadaceae były syntetyzowane jak opisano w Przykładzie. PBS 0, β-glukuranozyloceramid, służył jako związek kontrolny. Struktury tych związków są pokazane na FIG. 3A. [002] Mierzono właściwości immunologiczne powyższych związków w komórkach NKT. Ludzkie komórki NKT Vα24-Jα18 NKT i świeże oczyszczone mysie komórki NKT współhodowano z DC traktowanymi pulsowo-αgalcer lub syntetycznym glikolipidem w stężeniach w zakresie od 0,001 do 00 ng / ml. Wytwarzanie IFN-γ mierzono po 48 godzinach, jak opisano powyżej [003] Tetramery CD1d wytworzono jak opisano w Przykładzie 1, przy użyciu syntetycznych glikolipidów PBS, PBS 9 i PBS 0 i αgal-cer, i były stosowane do barwienia ludzkich komórek NKT i mysich komórek śledziony. [004] Wyniki są pokazane na FIG. 3 B-C. Zarówno α-glukuronozyloceramid (PBS ) i w mniejszym stopniu, α-galakturanozyloceramid (PBS, 9) silnie aktywowały proliferację ludzkich i mysich komórek NKT jak również sekrecje IFN-γ, podczas gdy kontrolny β-glukuronozyloceramid (PBS, 0) nie (FIG. 3B). Tetramery 9

11 CD1d o-α-glukuronozyloceramid (PBS, ) barwiły wszystkie ludzkie komórki NKT i ~ 2% mysich komórek NKT (FIG. 3C). Zatem, wyniki te ujawniły, że lipidy zastępując LPS w ścianie komórkowej niektórych gatunków bakterii Gram-ujemnych mogą być bezpośrednio rozpoznane przez konserwowany TCR wrodzonych komórek NKT. Przykład 4. Rola komórek NKT in vivo podczas zakażenia drobnoustrojowego [00] Myszy CD1d -/ - myszy wyhodowano na Uniwersytecie w Chicago, Myszy Jα18 -/ - myszy otrzymano od dr Taniguchi, Uniwersytet Chiba (Japonia), a myszy Hexb -/ - uzyskano z R. Proia, National Institutes of Health. Wszystkie myszy były C7/BL6 w tle. We wszystkich przypadkach, mioty otrzymane z heterozygotycznych kojarzeń genotypowano przez PCR i wykorzystano do analizy porównawczej. Wszystkie myszy wzrastały w środowisku wolnym od patogenów na Uniwersytecie w Chicago według wytycznych Institutional Animal Care and Use Committee. [006] Sześcio- do siedmiotygodniowe myszy C7/BL6 zaszczepiono dożylnie 0 μl Sphingomonas (1x 7 ), Ehrlichia (1x 8 ) lub Salmonella (1x 6 ) zawieszonych w PBS. Dwadzieścia cztery godziny po zakażeniu, wyizolowane komórki NKT bramkowane jako tetramer + /B2 - przeanalizowano metodą FACS dla powierzchniowego CD69 (antygen wczesnej aktywacji komórki T) i wewnątrzkomórkowego IFN-γ. Wyniki, przedstawione na FIG. 4A, potwierdzają, że komórki NKT są aktywowane i wydzielają IFN-γ w ciągu 24 godzin po infekcji in vivo. [007] W celu określenia czy dla obróbki antygenu w odpowiedzi na zakażenie in vivo Salmonella i Sphingomonas wymagany jest hexb, sprowokowano dootrzewnowo mioty Hexb +/- i Hexb +/- x 6 Sphingomonas lub Salmonella. Dwie godziny po prowokacji x 6 transgenicznych tymocytów Vα14 znakowanych CFSE zostało wewnątrzśledzionowo wstrzyknięte w objętości 0µl (Bendelac A. et al., J. Exp. Med. 184, (1996). Po 24 godzinach po prowokacji przeprowadzono, wewnątrzkomórkowe barwienie na IFN-γ. Wyniki przedstawiono na FIG. 4B. Różnica między Hexb + / -... i Hexb + / - była istotna statystycznie tylko dla myszy prowokowanych Salmonella, demonstrując, że produkcja IFN-γ i przez komórki NKT w odpowiedzi na zakażenie Salmonella wymaga lizosomalnej igb3, natomiast odpowiedź komórek NKT na Sphingomonas nie wymaga lizosomalnej igb3. [008] W celu scharakteryzowania roli komórek NKT w kontrolowaniu zakażenia in vivo, myszom CD1 -/- i Jα18 -/- i ich kontrolami miotu wstrzyknięto dożylnie albo x 6 albo 1x 6 Sphingomonas. Obciążenie bakteryjne w płucach oszacowano w odstępach wskazanych na FIG. 4C. Zliczania bakterii przeprowadzono po homogenizacji tkanki w 0,% Triton X-0 i hodowano w celu wytworzenia kolonii. Wyniki wskazują, że myszy zarówno Jα18 -/ - jak i i CD1 - / - miały opóźniony klirens bakterii w porównaniu z heterozygotycznymi kontrolami miotu z razy wyższym obciążeniem bakteryjnym w płucach we wczesnych punktach czasowych. [009] Do eksperymentów przetrwania myszom Jα18 -/ - i CD1 -/ - i ich kontrolom miotu wstrzyknięto dożylnie Sphingomonas w dużej dawce x 8. Co 2-4 godziny po zakażeniu odnotowywano martwe lub umierające (eutanazja) myszy. Wyniki, przedstawione na FIG. 4D, demonstrują, że zakażenie wysoką dawką Sphingomonas było szybko śmiertelne u myszy typu dzikiego, podczas gdy większość myszy z niedoborem NKT przeżyło. [0060] Aby zbadać, czy śmiertelność była związana z uwalnianiem cytokin, Sphingomonas (1x 7 ) wstrzyknięto dożylnie myszom Jα18 -/ - i CD1 -/ - i ich kontrolom miotu. W odstępach określonych na FIG. 4E, mierzono poziomy surowicze IFN-γ i IL-12 p40. Wyniki wskazują, że zejście u myszy typu dzikiego było

12 związane z wybuchem uwalniania IFN-γ i IL-12 w surowicy, podczas gdy myszy pozbawione NKT produkowały znacznie mniej cytokin. [0061] Do doświadczeń z zakażaniem Ehrlichia, myszy zakażono dootrzewnowo 00 μl z -1 rozcieńczenia roztworu podstawowego Ehrlichia muris. Obciążenie Ehrlichia w płucach, wątrobie i śledzionach miotów CD1d -/ - i kontrolnych określono metodą PCR w czasie rzeczywistym genu dsb z Ehrlichia (Ismail, N. i wsp., J. Immunol 172, 1786/00 (04.. )) w 2 i 7 dni po zakażeniu. Wyniki, odnotowano na FIG. 4F. pokazują, że myszy pozbawione NKT wykazują niezdolność do oczyszczenia z Ehrlichia. Zastrzeżenia 1. Glikolipid o wzorze (I): który jest wybrany z następujących związków: PBS-49, w którym X oznacza metyl; R 1 oznacza -H; R 2 oznacza -OH; R 3 oznacza -OH; R 4 oznacza -H; R oznacza alkil C 11 ; R 6 oznacza alkil C 13 ; a R 7 oznacza -H; - PBS-4, w którym X oznacza H; R 1 oznacza -H; R 2 oznacza -OH; R 3 oznacza -OH; R 4 oznacza -H; R oznacza alkil C 11 ; R 6 oznacza alkil C 13 i R 7 oznacza -H; - PBS-, w którym X oznacza H; R 1 oznacza -H; R 2 oznacza-oh; R 3 oznacza -OH; R 4 oznacza -H; R oznacza alkil C 16 ; R 6 oznacza alkil C 1 ; a R 7 oznacza -H; - PBS-29, w którym X oznacza H; R 1 oznacza -H; R 2 oznacza -OH; R 3 oznacza -H; R 4 oznacza -OH; R oznacza alkil C 23 ; R 6 oznacza alkil C 13 ; a R 7 oznacza -H; - PBS-62, w którym X oznacza H; R 1 oznacza -H; R 2 oznacza -OH; R 3 oznacza -OH; R 4 oznacza -H; R oznacza alkil C 23 ; R 6 oznacza alkil C 1 zawierający jedno wiązanie podwójne, a R 7 oznacza -H; i - PBS-6, w którym X oznacza H; R 1 oznacza -H; R 2 i oznacza -OH; R 3 oznacza -OH; R 4 oznacza -H; R oznacza alkil C 11 ; R 6 oznacza alkil C 13 zawierający jedną grupę cyklopropylową; a R 7 i oznacza -H, do zastosowania w leczeniu chorób zakaźnych. 2. Glikolipid do zastosowania według zastrzeżenia 1 przez aktywację komórki NKT przez skontaktowanie komórki NKT z tym glikolipidem skompleksowanym z cząsteczką CD1d. 3. Glikolipid do zastosowania według zastrzeżenia 2, gdzie cząsteczka CD1d jest wyrażana przez komórkę. 4. Glikolipid do zastosowania według zastrzeżenia 3, gdzie komórką jest komórka prezentująca antygen.. Glikolipid do zastosowania według zastrzeżenia 4, gdzie komórką prezentującą antygen jest komórka dendrytyczna. 6. Glikolipid do zastosowania według zastrzeżenia 2, gdzie komórka CD1d stanowi tetramer. 7. Glikolipid do zastosowania według zastrzeżenia 1, przez stymulowanie odpowiedzi odpornościowej. 8. Glikolipid do zastosowania według zastrzeżenia 1, przez stymulowanie odpowiedzi odpornościowej przez 11

13 komórki NKT aktywowane tym glikolipidem według zastrzeżenia Glikolipid do zastosowania według zastrzeżenia 1, przez stymulowanie odpowiedzi odpornościowej przez komórki CD1d+ prezentujące antygen, z którymi skontaktowano ten glikolipid.. Glikolipid do zastosowania według zastrzeżeń 7 do 9, gdzie odpowiedź odpornościowa jest przeciwdrobnoustrojową odpowiedzią odpornościową. 11. Glikolipid do zastosowania według zastrzeżenia, gdzie przeciwdrobnoustrojowa odpowiedź jest skuteczna do zahamowania wzrostu drobnoustroju. 12. Glikolipid do zastosowania według zastrzeżenia 11, gdzie drobnoustrój jest wybrany z grupy składającej się z wirusa, bakterii i pasożyta. 13. Kompozycja szczepionkowa obejmująca szczepionkę i adiuwant, w której adiuwant stanowi glikolipid o wzorze (I) jak określony w zastrzeżeniu 1 lub kombinację glikolipidu o wzorze (I) jak określony w zastrzeżeniu 1 i skuteczną ilość komórek NKT aktywowanych według zastrzeżenia 2. 12

14 13

15 14

16 1

17 Niezakażone 16

18 17

19 18

20 Reagenty( wydajności w nawiasach) a) 1) dioctan jodobenzenu (BAIB), rodnik 2,2,6,6-tetrametylo-1- piperydynyloksylowy (TEMPO), CH2Cl2, H 2) CH2Cl2 (39%); (b) Ac2O, Et3N, dimetyloaminopirydyna (DAMP), CH2Cl2 (87%); (c) sulfonian dimetylo(metylotio)sulfononiowytrifluorometanu (DMTST), 2,6-ditert-butylo-4-metylopirydyna, toluen (%); (d) 1) H2S, pirydyna, H2O, 2), dicykloheksykarodiimid(dcc), DMAP, CH2CL2 (28%); (e) kwas trifluorooctowy (TFA), tetrahydroksyfuran (THF), H2O (6% wydajności); (f) NaOMe, THF, MeOH, H(67%) Skróty : PMB= p metoksybenzoesan, Piv= piwaloil, Bz= benzoil 19

21 ODNIESIENIA CYTOWANE W OPISIE Lista przytoczonych przez zgłaszającego odnośników ma na uwadze jedynie wygodę czytelnika. Nie stanowi ona części Europejskiego dokumentu patentowego. Mimo, że zestawienie było wykonane z dużą starannością, nie można wykluczyć błędów lub pominięć i EUP nie bierze za nie żadnej odpowiedzialności. Literatura niepatentowa cytowana w opisie