Histology FISH Accessory Kit Kod K5599

Transkrypt

1 Histology FISH Accessory Kit Kod K5599 Wydanie 2 Stosować do hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (technika FISH) skrawków utrwalanych w formalinie i zatapianych w parafinie. Zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 20 testów. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 1/20

2 Spis treści Przeznaczenie... 3 Wprowadzenie... 3 Odczynniki... 3 Dostarczane materiały... 3 Materiały wymagane, ale niedostarczane... 4 Środki ostrożności... 5 Przechowywanie... 5 Przygotowanie materiału... 5 Skrawki zatapiane w parafinie... 6 INSTRUKCJA UŻYCIA... 6 A. Przygotowanie odczynników... 6 A.1 Pre-Treatment Solution... 6 A.2 Wash Buffer... 6 A.3 Seria rozcieńczeń etanolu... 6 A.4 Stringency Buffer... 7 B. Wykonanie odczynu... 7 B.1 Uwagi dotyczące procedury... 7 B.2 Przygotowanie tkanek do wykonania odczynu... 7 B.3 Protokół wykonania odczynu... 8 Kontrola jakości Interpretacja wyników Rozwiązywanie problemów Dodatek Dodatek Piśmiennictwo ( ) K5599/PL/SMA/ str. 2/20

3 Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. Zestaw akcesoriów Histology FISH Accessory Kit jest przeznaczony do hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (technika FISH) na utrwalanych w formalinie skrawkach tkankowych zatapianych w parafinie. Wprowadzenie Zestaw Histology FISH Accessory Kit zawiera wszystkie najważniejsze odczynniki, z wyjątkiem sondy, potrzebne do wykonania badania FISH na skrawkach tkankowych utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Po odparafinowaniu i ponownym uwodnieniu próbki ogrzewa się w roztworze Pre-Treatment Solution. Następnym etapem jest trawienie proteolityczne gotowym do użycia enzymem Pepsin w temperaturze 37 C. Po etapach ogrzewania i trawienia proteolitycznego do preparatów dodaje się dostarczone przez użytkownika sondy FISH, uszczelnia się szkiełka środkiem Coverslip Sealant, po czym poddaje się je przez noc denaturacji i hybrydyzacji. Następnego dnia przeprowadza się głębokie płukanie, które gwarantuje usunięcie niezwiązanych i związanych nieswoiście sond FISH przed odwodnieniem przy użyciu etanolu. Na koniec preparaty są zatapiane środkiem Fluorescence Mounting Medium zawierającym niebieski fluorescencyjny barwnik kontrastowy. Wyniki interpretuje się przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w odpowiednie filtry (zob. Dodatek 1). Odczynniki Dostarczane materiały Materiały wymienione poniżej wystarczają na 20 testów (test zdefiniowany jest jako jeden obszar badany o wymiarach 22 mm x 22 mm). Zestaw zawiera materiały wystarczające na wykonanie do 10 serii badań FISH w zależności od zużycia odczynników. Zestaw Histology FISH Accessory Kit jest dostarczany w suchym lodzie. W momencie odbioru w przesyłce nadal powinien znajdować się suchy lód będzie to stanowić potwierdzenie, że składniki nie zostały w trakcie transportu narażone na działanie wysokich temperatur. Niektóre składniki zestawu mogą być rozmrożone nie ma to wpływu na działanie zestawu Histology FISH Accessory Kit. Fiolka 1 Fiolka 2 Fiolka 3 Fiolka 4 Pre-Treatment Solution (20x) 75 ml, 20x stężony Bufor MES (kwas 2-[N-morfolino]etanosulfonowy). Pepsin 5 ml, gotowa do użycia Roztwór pepsyny, ph 2,0; zawiera stabilizator i środek przeciwbakteryjny. Wash Buffer (20x) 500 ml, 20x stężony Bufor Tris/HCl. Stringency Buffer (20x) 150 ml, 20x stężony Bufor SSC (sól i cytrynian sodu) z detergentem. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 3/20

4 Fiolka 5 Fluorescence Mounting Medium 300 µl Gotowy do użycia fluorescencyjny środek do zatapiania z niebieskim barwnikiem kontrastowym. Element 6 Coverslip Sealant 1 tubka Gotowy do użycia roztwór służący do nietrwałego uszczelniania szkiełek nakrywkowych. UWAGA: Wszystkie odczynniki zostały przygotowane specjalnie do użycia z tym zestawem. Materiały wymagane, ale niedostarczane Odczynniki laboratoryjne Woda destylowana lub dejonizowana Etanol, 96% Ksylen lub substytuty ksylenu Sprzęt laboratoryjny Ściereczki wchłaniające Pipety regulowane Kalibrowany termometr częściowo zanurzany (zakres C) Szkiełka nakrywkowe (18 mm x 18 mm lub 22 mm x 22 mm oraz 24 mm x 50 mm lub 24 mm x 60 mm) Szczypczyki Wyciąg Dako Hybridizer (kod S2450/S2451)* Szkiełka, Dako Silanized Slides, kod S3003, szkiełka powlekane poli-l-lizyną lub szkiełka Superfrost Plus Slides Naczynia lub łaźnie do barwienia Metalowe lub plastikowe kosze Minutnik (pomiar czasu w odstępach 0 60 minut) Kuchenka mikrofalowa zapewniająca utrzymanie stałej temperatury ** Pojemnik odporny na działanie mikrofal; na pokrywie powinny znajdować się otwory o średnicy np. 1 cm Naczynie do łaźni wodnej z pokrywką (zapewniające utrzymanie temperatury 65 (±2) C) *Można używać płyty grzejnej do trawienia proteolitycznego (37 (±2) C), pieca hybrydyzacyjnego do denaturacji (82 (±2) C) oraz wilgotnej komory hybrydyzacyjnej do całonocnej hybrydyzacji (45 (±2) C), jednakże zaleca się stosowanie urządzenia Dako Hybridizer, kod S2450/S2451. ** Zamiast kuchenki mikrofalowej można używać łaźni wodnej z pokrywą (zdolnej do utrzymania temperatury 99 (±2) C) lub komory ciśnieniowej kontrolowanej za pomocą mikroprocesora takiej, jak urządzenie Dako Pascal, kod S2800. Mikroskop i akcesoria Filtry do mikroskopu fluorescencyjnego: filtr DAPI i filtry odpowiednie do użytego fluorochromu, np. dla sond Dako FISH: filtr podwójny FITC/Texas Red, filtry pojedyncze FITC i Texas Red. Szczegółowe informacje zawiera Dodatek 1. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 4/20

5 Do sond FISH firmy Dako zalecany jest mikroskop fluorescencyjny z lampą rtęciową 100 W. Folder na szkiełka (np. kartonowa taca na 20 szkiełek z odchylaną okładką itp.). Środki ostrożności 1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych Użytkowników. 2. Fiolka 1, Pre-Treatment Solution (20x), zawiera kwas 2-morfolinoetanosulfonowy w stężeniu 1 <20%; fiolka 2, Pepsin, zawiera propan-2-ol w stężeniu 5 10%; fiolka 3, Wash Buffer (20x), zawiera trometamol w stężeniu 1 -<20%. W stężeniach występujących w produkcie substancje te nie muszą być oznaczane jako niebezpieczne. Karty Charakterystyki Substancji Niebezpiecznych są dostępne na żądanie. 3. Fiolka 2, Pepsin, zawiera pepsynę A, która może powodować reakcje alergiczne. 4. Element 6, Coverslip Sealant, zawiera % hydrorafinowanej benzyny ciężkiej (ropy naftowej) i nosi następujące oznaczenia: Skrajnie łatwopalny. Niebezpieczny dla środowiska. R11 Wysoce łatwopalny. R51/53 Toksyczny dla organizmów wodnych, może powodować długoterminowe szkodliwe zmiany w środowisku wodnym. S16 Przechowywać z dala od źródeł zapłonu nie palić tytoniu. S35 Niniejszy materiał wraz z opakowaniem musi być usuwany z zachowaniem zasad bezpieczeństwa. S57 Używać odpowiednich pojemników zapobiegających skażeniu środowiska. S61 Unikać uwalniania do środowiska naturalnego. Przestrzegać instrukcji specjalnych/kart charakterystyki. S9 Przechowywać pojemnik w miejscu z dobrą cyrkulacją powietrza. 5. Dodatkowe informacje zawiera Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej. 6. Użycie innych niż opisane metod utrwalania tkanki oraz skrawków o innej grubości może spowodować zmianę morfologii tkanki i/lub natężenia sygnału. 7. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasu inkubacji, temperatury lub metod może powodować niezadowalające wyniki badania. 8. Dostarczone odczynniki mają optymalne rozcieńczenia. Dalsze rozcieńczanie może pogorszyć ich działanie. Przechowywanie Przechowywać w ciemności, w temperaturze 2 8 C. Wszystkie odczynniki można także przechowywać w postaci zamrożonej. Wysoka temperatura może mieć negatywny wpływ na odczynnik Pepsin (fiolka 2). Nie należy pozostawiać tego składnika w temperaturze pokojowej. Silne oświetlenie może mieć negatywny wpływ na środek Fluorescence Mounting Medium (fiolka 5). Nie należy przechowywać tego składnika w miejscach oświetlonych. Nie należy używać zestawu po upływie daty ważności wydrukowanej na opakowaniu zestawu. Jeżeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane w ulotce dołączonej do opakowania, Użytkownik powinien zweryfikować ich działanie (1). Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego produktu. Dlatego ważne jest, aby w serii testów uwzględnić kontrolę w postaci tkanki prawidłowej, o której wiadomo, że dobrze poddaje się badaniu FISH. W wypadku nieoczekiwanego obrazu fluorescencji, którego nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z zestawem Histology FISH Accessory Kit, należy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Przygotowanie materiału Z materiałami z biopsji, wycięć i resekcji należy postępować w sposób umożliwiający zachowanie tkanki do analizy FISH. Należy postępować wg opisanej poniżej zalecanej metody przygotowania ( ) K5599/PL/SMA/ str. 5/20

6 tkanek do barwienia immunocytochemicznego. W celu uzyskania szczegółowych informacji zob. pozycja piśmiennictwa (2). Nie zaleca się stosowania w technice FISH tkanek poddanych odwapnianiu za pomocą kwasu (3-6). Donoszono, że stosowanie EDTA jako substancji odwapniającej przyczynia się do lepszego utrwalenia DNA (6) dla technik (F)ISH (3, 4, 7). UWAGA: Stosowanie zestawu Dako Histology FISH Accessory Kit nie zostało ocenione podczas stosowania do odwapnionych tkanek. Skrawki zatapiane w parafinie Do użycia z zestawem nadają się tylko tkanki zakonserwowane w obojętnej buforowanej formalinie i zatopione w parafinie. Materiał tkankowy należy pociąć na bloczki o grubości 3 lub 4 mm i utrwalić na godzin w obojętnej buforowanej formalinie. Następnie tkanki poddaje się odwodnieniu, stosując serię kąpieli alkoholowych i ksylenowych o stopniowo zmieniających się stężeniach, po czym przepaja płynną parafiną w temperaturze nieprzekraczającej 60 C. Prawidłowo utrwalone i zatopione tkanki można przed pocięciem na skrawki i zatopieniem na szkiełkach przechowywać dowolnie długo, o ile zachowane zostaną prawidłowe warunki (15 25 C) (2, 8). Nie dopuszcza się stosowania innych środków utrwalających. Wydłużenie czasu utrwalania może spowodować konieczność dłuższej inkubacji na etapie trawienia enzymem Pepsin. Materiał tkankowy należy pociąć na skrawki o grubości 2 6 µm, umieścić na szkiełkach z łaźni wodnej i następnie wysuszyć na powietrzu. Optymalną grubością skrawków tkanki, która doskonale odpowiada użyciu z sondami Dako Split Signal FISH Probes jest 2-3 µm. Skrawki o grubości 4-6 µm mogą być używane do innych zastosowań technik FISH. Parafina powinna być roztapiana w temperaturze 60 C przez minut. Skrawki należy następnie schłodzić do temperatury pokojowej (20 25 C) i przechowywać w temperaturze 2 8 C. Zaleca się zatapianie skrawków tkankowych na szkiełkach Dako Silanized Slides, kod S3003, lub szkiełkach powlekanych poli-l-lizyną lub szkiełkach Superfrost Plus Slides. Co do zasady preparaty przechowywane w temperaturze 2 8 C należy przeanalizować przed upływem 4 6 miesięcy od pocięcia. Jeżeli skrawki tkankowe są przechowywane w warunkach innych niż podane w ulotce dołączonej do opakowania, Użytkownik powinien zweryfikować te warunki. INSTRUKCJA UŻYCIA A. Przygotowanie odczynników Dla wygody zaleca się przygotowanie następujących odczynników przed rozpoczęciem barwienia: A.1 Pre-Treatment Solution W fiolce 1 mogą pojawić się kryształki, które jednak rozpuszczą się w temperaturze pokojowej. Przed przystąpieniem do przygotowywania odczynnika należy upewnić się, że w fiolce nie ma kryształków. Rozcieńczyć odpowiednią ilość koncentratu z fiolki Vial 1 (Pre-Treatment Solution 20x) rozcieńczając koncentrat 1:20 w wodzie destylowanej lub dejonizowanej. Nieużywany rozcieńczony roztwór można przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia rozcieńczony roztwór nie nadaje się do użycia. A.2 Wash Buffer Rozcieńczyć 1:20 odpowiednią ilość koncentratu z fiolki 3 (Wash Buffer 20x) w wodzie destylowanej lub dejonizowanej. Nieużywany rozcieńczony bufor można przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia rozcieńczony bufor nie nadaje się do użycia. A.3 Seria rozcieńczeń etanolu Z 96% roztworu etanolu przygotować 3 naczynia zawierające etanol 70%, 85% i 96%. Zamknięte naczynia należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub 2 8 C, a roztworów używać do nie więcej niż 200 preparatów. W przypadku zmętnienia roztwory nie nadają się do użycia. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 6/20

7 A.4 Stringency Buffer Rozcieńczyć 1:20 odpowiednią ilość koncentratu z fiolki 4 (Stringency Buffer 20x) w wodzie destylowanej lub dejonizowanej. Nieużywany rozcieńczony bufor można przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia rozcieńczony bufor nie nadaje się do użycia. B. Wykonanie odczynu B.1 Uwagi dotyczące procedury Przed przystąpieniem do wykonania odczynu Użytkownik powinien uważnie przeczytać podane instrukcje i zaznajomić się ze wszystkimi elementami zestawu (zobacz część Środki ostrożności). Jeśli składniki zestawu są zamrożone na czas przechowywania, zaleca się przeniesienie odczynników do temperatury 2 8 C na jeden dzień przed analizą, co pozwoli na prawidłowe wyrównanie temperatury. Wszystkie odczynniki należy przed użyciem doprowadzić do stanu równowagi temperaturowej. Fiolka 1: Rozcieńczony roztwór Pre-Treatment Solution powinien być doprowadzony do stabilnej temperatury C, jeśli stosowana jest łaźnia wodna. Fiolka 2: Enzym Pepsin powinien być utrzymywany w stabilnej temperaturze 2 8 C przez cały czas trwania procedury. Fiolka 3: Rozcieńczony roztwór Wash Buffer powinien być doprowadzony do stabilnej temperatury pokojowej, C. Fiolka 4: Jedno naczynie buforu Stringency Buffer powinno być doprowadzone do stabilnej temperatury pokojowej, a drugie naczynie przed użyciem do 65 (±2) C. Fiolka 5: Środek Fluorescence Mounting Medium może być stosowany w dowolnej temperaturze z przedziału 2 25 C. Element 6: Coverslip Sealant może być stosowany w temperaturze pokojowej. Wszystkie etapy muszą być wykonywane w podanych temperaturach. Procedura przed barwieniem obejmuje uwadnianie preparatów oraz ich suszenie. Przed przejściem do kolejnego etapu należy zawsze sprawdzić, czy preparaty całkowicie wyschły. Nie należy dopuszczać, by preparaty dosychały w trakcie czynności wchodzących w skład procedury. Jeśli zajdzie konieczność przerwania wykonywania odczynu, preparaty można po etapie odparafinowania przechowywać w buforze Wash Buffer, w temperaturze pokojowej (20 25 C), przez maksymalnie 1 godzinę. B.2 Przygotowanie tkanek do wykonania odczynu Odparafinowanie i ponowne uwadnianie: Przed przystąpieniem do wykonania procedury należy odparafinować preparaty w celu usunięcia parafiny i ponownego uwodnienia. Należy unikać niecałkowitego usunięcia parafiny. Pozostałości parafiny powodują nasilenie nieswoistego odczynu. Ten etap powinien być wykonywany w temperaturze pokojowej (20 25 C). 1. Umieścić preparaty w kąpieli ksylenowej i inkubować przez 5 (±1) minut. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć czynność. 2. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w roztworze etanolu o stężeniu 96% na 2 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć czynność. 3. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w roztworze etanolu o stężeniu 70% na 2 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć czynność. 4. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w rozcieńczonym buforze Wash Buffer (zobacz INSTRUKCJA UŻYCIA, sekcja A.2) na co najmniej 2 minuty. Wykonać odczyn zgodnie z opisem w Sekcji B.3, Etap 1, Obróbka wstępna. Po każdych 200 preparatach należy przygotować świeże roztwory ksylenu i alkoholu. Można używać zamienników ksylenu. UWAGA: Odczynniki i instrukcje dostarczane w zestawie opracowano w celu uzyskania optymalnych wyników. Dodatkowe rozcieńczenie odczynników bądź nieprzestrzeganie czasu ( ) K5599/PL/SMA/ str. 7/20

8 lub temperatury inkubacji może spowodować uzyskanie błędnych lub sprzecznych wyników. Stosowanie w laboratorium użytkownika innych niż opisane technik obróbki tkanek i procedur technicznych może spowodować unieważnienie wyników badania. Opcjonalna dodatkowa inkubacja preparatów: Przed odparafinowaniem i uwodnieniem preparaty należy inkubować, np. przez 1 godzinę w temperaturze 60 C na płycie grzejnej, płycie w piecu hybrydyzacyjnym lub w urządzeniu Dako Hybridizer. Zamiast tego można inkubować preparaty przez 1 2 dni w temperaturze 37 C, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze 60 C. Przejść do etapu odparafinowania i uwodnienia. UWAGA: Ten etap jest opcjonalny. Preparaty poddawane wydłużonej inkubacji mogą zapewnić ograniczenie ewentualnego szumu tła. B.3 Protokół wykonania odczynu DZIEŃ 1 Etap 1: Obróbka wstępna (kuchenka mikrofalowa, kąpiel wodna, aparat Pascal) Kuchenka mikrofalowa: Napełnić pojemnik rozcieńczonym roztworem Pre-Treatment Solution. Zanurzyć odparafinowane skrawki w roztworze i zamknąć pokrywę. Pokrywa powinna zawierać otwory pozwalające na zrównoważenie podwyższonego ciśnienia. Umieścić pojemnik ze szkiełkami w kuchence mikrofalowej i ogrzać. Przed ogrzaniem należy upewnić się, że zewnętrzne powierzchnie pojemnika oraz wnętrze kuchenki mikrofalowej są suche. Inkubować w temperaturze minimalnie niższej niż punkt wrzenia (nie mniej niż 95 C) przez 10 minut. Po przeprowadzeniu inkubacji zdjąć pokrywę (nie wyjmować szkiełek). Pozostawić szkiełka do schłodzenia w Pre-Treatment Solution przez 15 minut w temperaturze pokojowej (20 25 C). W czasie całej procedury przed barwieniem szkiełka powinny być pokryte buforem. Przenieść preparaty do naczynia zawierającego rozcieńczony bufor Wash Buffer (zob. INSTRUKCJA UŻYCIA, sekcja A.2) na 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wymienić bufor Wash Buffer i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. Kontynuować aż do etapu 2. UWAGA: Roztwór Pre-Treatment Solution jest przeznaczony tylko do jednorazowego użycia. Nie używać ponownie. Kuchenki mikrofalowej nie należy używać do podgrzewania substancji znajdujących się w uszczelnionych pojemnikach. Wzrost ciśnienia może spowodować szkody podczas otwierania lub może doprowadzić do wybuchu. Stosowanie metalowego kosza w kuchence mikrofalowej jest dopuszczalne, jeśli w czasie całej procedury odbywającej się w kuchence mikrofalowej kosz jest zanurzony w buforze. W przeciwnym razie NIE NALEŻY używać metalowych przedmiotów w kuchence mikrofalowej. Należy postępować zgodnie z instrukcją obsługi sporządzoną przez producenta kuchenki mikrofalowej. Unikać ciągłego gotowania się roztworu Pre-Treatment Solution podczas trwającej 10 minut inkubacji. W celu oceny prawidłowości temperatury użytkownik powinien przeprowadzać regularne kontrolne pomiary temperatury dokonywane za pomocą skalibrowanego termometru. Do przeprowadzenia etapu procedury Pre-Treatment zaleca się stosowanie kuchenki mikrofalowej. Alternatywnie można zastosować łaźnię wodną lub komorę Dako s Pascal Pressure Chamber (kod S2800), patrz niżej. Łaźnia wodna: Wypełnić naczynia do barwienia rozcieńczonym roztworem Pre-Treatment Solution (zob. INSTRUKCJA UŻYCIA, sekcja A.1). Umieścić naczynia do barwienia zawierające Pre-Treatment Solution w łaźni wodnej. Podgrzać wodę i Pre-Treatment Solution do temperatury C. Aby zapewnić prawidłową temperaturę, należy dokonywać pomiarów temperatury wewnątrz naczynia za pomocą skalibrowanego termometru. Zakryć naczynia pokrywami (bez otworów) tak, aby ustabilizować temperaturę i przeciwdziałać parowaniu. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 8/20

9 Zanurzyć odparafinowane skrawki w uprzednio podgrzanym roztworze Pre-Treatment Solution. Ponownie skontrolować temperaturę, zamknąć pokrywę łaźni wodnej i inkubować przez 10 (±1) minut w temperaturze C. Z łaźni wodnej wyjąć całe naczynie zawierające szkiełka. Zdjąć pokrywę (nie wyjmować szkiełek). Pozostawić szkiełka do schłodzenia w Pre-Treatment Solution przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie postępować według etapów płukania opisanych powyżej. Aparat Pascal (kod S2800): Inkubować w temperaturze 121 C przez 1 min. Zmniejszenie ciśnienia następuje po schłodzeniu do 90 C. Szczegółowe informacje zawarte są w podręczniku Pascal Handbook. Po zmniejszeniu się ciśnienia wyjąc pojemnik. Zdjąć pokrywy i pozostawić szkiełka do schłodzenia w roztworze Pre-Treatment Solution przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie postępować według etapów płukania opisanych powyżej. Etap 2: Pepsin, gotowy do użycia Strząsnąć nadmiar buforu. Posługując się chusteczką niepozostawiającą nitek (np. ściereczką wchłaniającą lub gazikiem) ostrożnie otrzeć szkiełko wokół preparatu tak, by usunąć pozostałości płynu i utrzymywać odczynniki w obszarze zawierającym materiał. Nakapać 5 8 kropli (250 µl) zimnego (2 8 C) enzymu Pepsin (fiolka 2) w sposób zapewniający pokrycie preparatu. Enzym Pepsin należy zawsze przechowywać w temperaturze 2 8 C. Umieścić szkiełka w temperaturze 37 C w urządzeniu Dako Hybridizer lub na wstępnie podgrzanej płycie grzejnej. Inkubować przez 2 6 minut w 37 C. Inkubacja będzie odpowiednia dla większości preparatów przygotowanych zgodnie z opisem w sekcji Przygotowanie materiału. Użytkownik powinien ustalić optymalny czas inkubacji, który zależy od typu tkanki, sposobu utrwalenia tkanki, grubości preparatu i czasu wstępnej inkubacji preparatu. Czynniki te mogą spowodować zwiększenie wymaganego czasu trawienia do 7 15 minut lub nawet więcej. Użytkownicy stosujący metodę po raz pierwszy powinni określić optymalny czas trawienia poprzez testowanie przykładowej tkanki przez 1, 3, 6, 12 i 18 minut. Strząsnąć enzym Pepsin i namaczać skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer (zob. INSTRUKCJA UŻYCIA, sekcja A.2) przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (20 25 C). Wymienić rozcieńczony bufor Wash Buffer i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. Przejść do Etapu 3, Sonda FISH, lub (opcjonalnie) dobrać optymalny czas trawienia wg opisu zamieszczonego w Dodatku 2. UWAGA: Zaleca się postępowanie wg procedury opisanej w sekcji Przygotowanie materiału. Poddanie tkanki zbyt krótkiemu trawieniu może doprowadzić do otrzymania braku sygnału lub jedynie słabego sygnału ze znacznym zielonym sygnałem cytozolu tła. Trawienie enzymem Pepsin może być także przeprowadzane w temperaturze (20 25 C) przez 5 50 minut minutowa inkubacja w temperaturze pokojowej będzie odpowiednia dla większości preparatów, jednak użytkownik powinien ustalić optymalny czas inkubacji. Etap 3: Sonda FISH (dostarczona przez użytkownika) Ten etap należy przeprowadzać pod wyciągiem. W przypadku ekspozycji na silne światło jakość sond znakowanych fluorochromem może pogorszyć się. Nie należy wykonywać pozostałej części tej procedury w miejscu silnie oświetlonym, np. bezpośrednio nasłonecznionym. Odwodnić skrawki tkankowe, zanurzając kolejno w roztworach etanolu o coraz większych stężeniach: na 2 minuty w 70% etanolu, 2 na minuty w 85% etanolu i 2 minuty w 96% etanolu (zob. INSTRUKCJA UŻYCIA, Sekcja A.3). Poczekać, aż skrawki tkankowe całkowicie wyschną na powietrzu. Nałożyć odpowiednią ilość sondy znakowanej fluorochromem, np. 10 µl sondy Dako FISH, pośrodku skrawka tkankowego. Natychmiast nakryć sondę szkiełkiem 18 mm x 18 mm (lub np. 22 mm x 22 mm) i pozwolić, by sonda rozlała się równomiernie pod szkiełkiem. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza. W razie zaobserwowania pęcherzyków usunąć je, delikatnie pukając szczypczykami. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 9/20

10 Uszczelnić szkiełko nakrywkowe, nakładając na jego brzegi środek Coverslip Sealant. Środek Coverslip Sealant powinien zachodzić na szkiełko nakrywkowe i szkiełko podstawowe, tworząc uszczelnienie wokół szkiełka nakrywkowego. Środek Coverslip Sealant powinien uszczelniać szkiełko nakrywkowe na całym jego obwodzie. Umieścić szkiełka w urządzeniu Dako Hybridizer (kod S2450/S2451) i podczas używania sond Dako FISH ustawić trwanie denaturacji na 82 C przez 5 min. oraz hybrydyzacji na 45 C przez całą noc (14-20 h). Kontynuować do Dnia 2, Etapu 4, Stringent Wash. Szczegółowe informacje zawarte są w podręczniku Hybridizer Handbook. UWAGA: Alternatywnie można stosować płytę grzejną, piec hybrydyzacyjny i komorę hybrydyzacyjną. Patrz niżej. Umieścić szkiełko na płaskiej metalowej lub kamiennej powierzchni (płycie grzejnej lub na płycie w piecu hybrydyzacyjnym) wstępnie ogrzanej do temperatury 82 (±2) C. Denaturować przez 5 minut, upewniając się, że temperatura płyty nie obniża się poniżej 80 C. Umieścić szkiełka we wstępnie ogrzanej nawilżonej komorze hybrydyzacyjnej. Zamknąć komorę pokrywką i inkubować do następnego dnia (14 20 godzin) w temperaturze 45 (±2) C (w przypadku zastosowania sond Dako FISH). DZIEŃ 2 Etap 4: Głębokie płukanie Napełnić dwa naczynia do barwienia rozcieńczonym buforem Stringency Buffer (zob. INSTRUKCJA UŻYCIA, sekcja A.4). Potrzebna jest co najmniej objętość 100 ml rozcieńczonego buforu Stringency Buffer do 1 6 preparatów w naczyniu. Jeśli w naczyniu znajduje się więcej niż 6 preparatów, należy użyć co najmniej 15 ml buforu na jeden preparat. Umieścić jedno z naczyń do barwienia zawierających rozcieńczony bufor Stringency Buffer w temperaturze pokojowej pod wyciągiem, a drugie w łaźni wodnej. Ogrzać łaźnię wodną z rozcieńczonym buforem Stringency Buffer do 65 (±2) C. Upewnić się, że temperatura ustabilizowała się. Przykryć naczynie w celu uzyskania stabilnej temperatury i uniknięcia parowania. Mierzyć temperaturę w naczyniu za pomocą skalibrowanego termometru, aby zapewnić uzyskanie prawidłowej temperatury. Wyjąć preparaty z komory hybrydyzacyjnej. Za pomocą szczypczyków delikatnie usunąć środek Coverslip Sealant i zdjąć szkiełko nakrywkowe, a następnie przenieść preparat do naczynia tymczasowego o temperaturze pokojowej. Niezwłocznie po zdjęciu wszystkich szkiełek nakrywkowych przenieść preparaty z naczynia tymczasowego do naczynia w łaźni wodnej o temperaturze 65 (±2) C. Przeprowadzać głębokie płukanie dokładnie przez 10 minut w temperaturze 65 (±2) C. Zamknąć pokrywę naczynia, a następnie pokrywę łaźni wodnej. Wyjąć preparaty z rozcieńczonego buforu Stringency Buffer i przez 3 minuty namaczać skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer w temperaturze pokojowej (20 25 C). Wymienić rozcieńczony bufor Wash Buffer i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. Odwodnić skrawki tkankowe, zanurzając kolejno w roztworach etanolu o coraz większych stężeniach: na 2 minuty w 70% etanolu, 2 na minuty w 85% etanolu i 2 minuty w 96% etanolu (zob. INSTRUKCJA UŻYCIA, Sekcja A.3). Poczekać, aż preparaty całkowicie wyschną na powietrzu. Etap 5: Zatapianie preparatu Nałożyć 15 µl środka Fluorescence Mounting Medium (fiolka 5) zawierającego niebieski fluorescencyjny barwnik kontrastowy na preparat na szkiełku podstawowym i nakryć szklanym szkiełkiem nakrywkowym (np. 24 mm x 50 mm lub 24 mm x 60 mm). Pozwolić środkowi na równomierne rozłożenie się na skrawku. UWAGA: Odczyt odczynu można przeprowadzić po 15 minutach od zatopienia lub później (przed upływem 7 dni). Pod wpływem światła lub wysokich temperatur preparaty blakną. Należy je przechowywać w ciemności, w temperaturze 2 8 C. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 10/20

11 Kontrola jakości 1. Sygnały muszą być jasne, wyraźne i łatwe do oceny. 2. Do kontroli serii testów należy użyć tkanki prawidłowej, o której wiadomo, że dobrze poddaje się badaniu FISH. 3. W tkankach prawidłowych sygnały fluorescencyjne powinny być wyraźnie widoczne, co stanowić będzie potwierdzenie hybrydyzacji sond FISH w obszarach docelowych. 4. Brak sygnałów w komórkach tkanki prawidłowej wskazuje na nieprawidłowy przebieg testu w takiej sytuacji wyniki należy uznać za nieważne. 5. W wyniku pocięcia tkanki w niektórych komórkach prawidłowych liczba sygnałów będzie niższa od oczekiwanej. 6. Ocena morfologii jąder dokonywana przy użyciu filtru DAPI nie powinna wykazywać jakichkolwiek nieprawidłowości oraz wykazywać jednorodne barwienie. Duża liczba komórek-duchów, komórek pierścieniowych i ogólnie zaburzona morfologia jąder świadczy o zbyt długim trawieniu lub denaturacji preparatu, co może być przyczyną utraty lub fragmentacji sygnałów. Zaobserwowanie przy użyciu podwójnego filtra Texas Red/FITC barwienia obwodowego, otworów w obrębie komórek (filtr DAPI) i/lub silnego zielonego barwienia cytozolu tła może wskazywać na niedostateczne strawienie mogące doprowadzić do utraty sygnału. Nie należy brać pod uwagę wyników z takich preparatów. 7. Różnice w metodach utrwalania, przetwarzania i zatapiania tkanek stosowanych w laboratorium Użytkownika mogą powodować istotne różnice wyników, wymagające regularnego wykonywania wewnętrznej kontroli jakości. Interpretacja wyników Należy przeanalizować kilka obszarów preparatu, aby uwzględnić ewentualną niejednorodność. Wybrać obszar z równomiernym rozkładem jąder. Rozpocząć analizę w lewej górnej ćwiartce wybranego obszaru i postępując od lewej do prawej, zliczać sygnały na granicach poszczególnych jąder, przestrzegając poniższych wskazówek. Zmieniać ostrość, aby móc zauważyć wszystkie sygnały w każdym jądrze. Nie brać pod uwagę jąder bez sygnałów. Nie uwzględniać jąder wymagających oceny subiektywnej. Pomijać jądra z sygnałami o słabym natężeniu i z nieswoistym lub silnym odczynem tła. Użytkownik musi ustalić liczbę jąder, jakie należy zliczyć dla każdej sondy. Unikać obszarów z niewyraźnie zaznaczonymi granicami jąder. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 11/20

12 Rozwiązywanie problemów Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 1. Brak sygnałów lub słabe sygnały 1a. Nieprawidłowy czas trawienia. 1b. Podczas transportu lub przechowywania zestaw był narażony na wysokie temperatury. 1c. Nieodpowiednie warunki obróbki wstępnej. 1d. Nieodpowiednie warunki denaturacji. 1e. Nieodpowiednia temperatura hybrydyzacji. 1f. Odparowanie buforu sondy w trakcie hybrydyzacji. 1a. Używać skrawków tkankowych utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Wskazane może być wydłużenie czasu inkubacji, np. do 7-15 minut lub nawet więcej w temperaturze 37 C. Zob. sekcja B.3, Etap 2, Rozwiązywanie problemów, punkt 4d, 4e i Dodatek 2. 1b. Sprawdzić warunki przechowywania. Upewnić się, że w dostarczonym opakowaniu był suchy lód. Upewnić się, że fiolki 2 i 5 były przechowywane w temperaturze 2 8 C, a fiolka 5 była przechowywana w ciemności. 1c. Upewnić się, że przestrzegano zalecanej temperatury i czasu obróbki wstępnej. Ponadto w razie potrzeby zoptymalizować czas inkubacji, zob. sekcja B.3, Etap 2. Im temperatura obróbki wstępnej jest bliższa punktowi wrzenia, tym silniejsze są otrzymywane sygnały. Upewnić się, że enzym Pepsin jest utrzymywany w odpowiedniej temperaturze. Zob. sekcja B.1. 1d. Upewnić się, że denaturacja przeprowadzana jest w temperaturze 82 (±2) C. 1e. Gdy używane są sondy Dako FISH, należy przeprowadzać hybrydyzację w temperaturze 45 (±2) C. 1f. Zapewnić wystarczającą wilgotność w komorze hybrydyzacyjnej. Użyć urządzenia Dako Hybridizer (kod S2450/S2451) i Hybridizer Humidity Control Strips (S2452). Użyć Coverslip Sealant. Zob. Rozwiązywanie problemów, punkt 5a i 5b. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 12/20

13 Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 2. Obszary bez sygnału 1g. Nieodpowiednie warunki głębokiego płukania 1h. Mikroskop nie działa prawidłowo - Nieodpowiedni zestaw filtrów - Nieodpowiednia lampa - Zużyta lampa rtęciowa - Spalone filtry - Zabrudzone i/lub popękane soczewki zbierające - Nieodpowiedni olejek imersyjny 1i. Stłumione (wyblakłe) sygnały. 2a. Za mała ilość sondy. 2b. W trakcie nakładania sondy lub zatapiania pod szkiełko dostały się pęcherzyki powietrza. 2c. Niedostateczne odparafinowanie. 3. Silny odczyn tła 3a. Nieprawidłowy czas trawienia. Silny zielony sygnał cytozolu tła może wskazywać na niedostateczne trawienie. 3b. Skrawki zostały osuszone w sekcji B.3. 3c. Niecałkowicie usunięta parafina. 1g. Przestrzegać zalecanej temperatury i czasu głębokiego płukania i koniecznie zdjąć szkiełka nakrywkowe przed głębokim płukaniem. 1h. Sprawdzić mikroskop i upewnić się, że używane są filtry odpowiednie dla stosowanych fluorochromów, że nie są one zużyte i że lampa rtęciowa jest odpowiedniego typu i nie była eksploatowana dłużej, niż wynosi jej oczekiwana żywotność (zob. Dodatek 1). Podczas fluorescencji używać odpowiedniego olejku imersyjnego. W razie wątpliwości skontaktować się z dostawcą mikroskopu. 1i. Unikać zbyt długiego badania pod mikroskopem i minimalizować kontakt ze światłem. 2a. Stosować sondę w ilości wystarczającej do pokrycia całej powierzchni pod szkiełkiem nakrywkowym. 2b. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza. W razie zaobserwowania pęcherzyków usunąć je, delikatnie pukając szczypczykami. 2c. Upewnić się, ze parafina została całkowicie usunięta ze skrawków. Zob. sekcja B.2. 3a. Używać skrawków tkankowych utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Wskazane może być wydłużenie czasu inkubacji, np. do 7 15 minut w temperaturze 37 C. Zob. sekcja B.3, Etap 2, Rozwiązywanie problemów punkt 4e i Dodatek 2. 3b. Postępować zgodnie z instrukcjami i unikać wysuszenia szkiełek, jeśli nie jest to wskazane. 3c. Przestrzegać procedur odparafinowania i uwodnienia opisanych w sekcji B.2. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 13/20

14 Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 3d. Za niska temperatura podczas głębokiego płukania. 3e. Długotrwałe działanie światła na skrawek tkanki poddany hybrydyzacji. 3f. Przedatowane szkiełka lub nieodpowiednie szkiełka mogą spowodować nadmierne czerwone barwienie typu rozgwieżdżonego nieba. 3d. Upewnić się, że głębokie płukanie przeprowadzane jest w temperaturze 65 (±2) C. 3e. Unikać zbyt długiego badania pod mikroskopem i minimalizować kontakt ze światłem. 3f. Używać zalecanych rodzajów szkiełek i upewnić się, że nie upłynął ich termin ważności. Zob. Skrawki zatapiane w parafinie. 4. Zaburzona morfologia jąder lub słaby odczyn jądrowy 3g. Zmieszanie niefluorescencyjnego olejku imersyjnego ze środkiem do zatapiania Fluorescence Mounting Medium. 4a. Nieodpowiednie warunki obróbki wstępnej mogą być przyczyną zmętnienia lub zamazania. 4b. Wrzenie podczas wstępnej obróbki może doprowadzić do uszkodzenia budowy tkanki i braku sygnału. 4c. Nieprawidłowe trawienie enzymem Pepsin. 4d. Za długie trawienie enzymem Pepsin doprowadza do rozpuszczenia tkanki i powoduje brak sygnału. Nadmierne trawienie może powodować pojawianie się komórekduchów lub jąder pierścieniowych i jąder z 3g. Podczas zatapiania używać dużych szkiełek nakrywkowych, zgodnie z zaleceniami. Zob. sekcja B.3, Etap 5. Zapobiega to zmieszaniu się olejku imersyjnego ze środkiem do zatapiania i pozwala uniknąć autofluorescencji i przypadkowego usunięcia szkiełek nakrywkowych przez obiektyw mikroskopu. 4a. Upewnić się, że przestrzegano zalecanej temperatury i czasu obróbki wstępnej. Zob. także Rozwiązywanie problemów, punkty 4b-e. 4b. Unikać wrzenia. Zob. sekcja B.3, Etap 1. Zob. również Rozwiązywanie problemów, punkt 4d. 4c. Przestrzegać zalecanych czasów inkubacji z enzymem Pepsin. Zob. sekcja B.3, Etap 2, i Dodatek 2. Zob. także punkty 1a,1c, 3a, 4d i 4e w tabeli Rozwiązywanie problemów. 4d. Skrócić czas inkubacji z enzymem Pepsin. Zob. sekcja B.3, Etap 2, i Dodatek 2. Używać skrawków o grubości 2 6 µm. Zob. Rozwiązywanie problemów, punkty 1a, 1c, 4b i 4e. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 14/20

15 Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie ogólnie uszkodzoną strukturą. 4e. Zbyt krótkie trawienie enzymem Pepsin może spowodować brak sygnału. Niedostatecznie strawiona tkanka może doprowadzić do obwodowego barwienia jąder i tworzenia się w ich obrębie otworów (filtr DAPI); wystąpienia silnego zielonego sygnału cytozolu tła (podwójny filtr Texas Red/FITIC). Należy zauważyć, że jądra w obrębie niedostatecznie strawionej tkanki mogą mieć prawidłową morfologię w odróżnieniu od jąder w obrębie nadmierne strawionej tkanki 4f. Za wysoka temperatura denaturacji. 4g. Nieprawidłowe warunki hybrydyzacji. 4e. Wydłużyć czas inkubacji Pepsin do np. 2-3-krotności czasu stosowanego do trawienia. Zob. także punkty 1a, 1c, 3a i 4d w Rozwiązywanie problemów. 4f. Upewnić się, że denaturacja przeprowadzana jest w temperaturze 82 (±2) C. 4g. Zob. punkty 1f i 5b w Rozwiązywanie problemów. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 15/20

16 5. Po przeprowadzeniu hybrydyzacji szkiełko nakrywkowe mocno przylega do szkiełka podstawowego i jest zatem trudne do usunięcia 5a. Szkiełko nakrywkowe nieodpowiednio szczelnie przylega do szkiełka podstawowego. 5b. Nieodpowiednie warunki hybrydyzacji. Mogą doprowadzić do zredukowania lub zaniku sygnałów, uszkodzenia tkanki i barwienia tła. 5a. Nie należy stosować siły w celu odłączenia szkiełka nakrywkowego, jeśli przylega ono zbyt mocno do szkiełka podstawowego. Należy zanurzyć szkiełko w naczyniu zawierającym rozcieńczony bufor Stringency Buffer o temperaturze pokojowej na pięć minut, a następnie usunąć szkiełko nakrywkowe. Postępować zgodnie z zaleceniami dotyczącymi uszczelniania szkiełek nakrywkowych zawartymi w sekcji B.3, Etap 3. Zob. Również Rozwiązywanie problemów, punkty 1f i 5b. 5b. Zapewnić odpowiednią wilgotność w komorze hybrydyzacyjnej. Stosować Dako Hybridizer (kod S2450/S2451) i Hybridizer Humidity Control Strips (S2452). Postępować zgodnie z instrukcjami zawartymi w Package Insert dołączonymi do Hybridizer Humidity Control Strips. Zob. zalecenia dotyczące warunków hybrydyzacji zawarte w sekcji B.3, Etap 3. Zob. również Rozwiązywanie problemów, punkty 1f i 5a. UWAGA: Jeśli problemu nie daje się przypisać żadnej z powyższych przyczyn, bądź jeśli zalecane postępowanie jest nieskuteczne, należy się skontaktować z naszym działem wsparcia technicznego w celu uzyskania dalszej pomocy. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 16/20

17 Dodatek 1 Histology FISH Accessory Kit, kod K5599 Specyfikacja mikroskopu fluorescencyjnego Firma Dako zaleca stosowanie z zestawem Histology FISH Accessory Kit wymienionego niżej wyposażenia, gdy używane są sondy Dako FISH: 1. Typ mikroskopu Mikroskop epifluorescencyjny. 2. Lampa Lampa rtęciowa o mocy 100 W (z reguły należy wymieniać ją co 200 godzin). 3. Obiektywy Do masowego przeglądania preparatów nadaje się suchy obiektyw fluorescencyjny 10x lub fluorescencyjny obiektyw imersyjny 16x. Do dużych powiększeń i zliczania sygnałów zaleca się stosowanie wyłącznie fluorescencyjnego obiektywu imersyjnego, np. 63x lub 100x. 4. Filtry Filtry są projektowane indywidualnie pod kątem konkretnych fluorochromów i muszą być właściwie dobrane. Firma Dako zaleca używanie z sondami Dako FISH konkretnego filtru DAPI razem z wysokiej jakości filtrem podwójnym Texas Red/FITC. Filtr DAPI, np. filtr Omega Optical #XF06 lub filtr Chroma nr Filtr podwójny Texas Red/FITC, np. Omega Optical nr XF53 lub Chroma nr Do weryfikacji można używać filtrów pojedynczych Texas Red i FITC, np. odpowiednio filtr Omega Optical #XF102-2 i XF202. Fluorochrom Długość fali wzbudzającej Długość fali emitowanej FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtry są przeznaczone do konkretnych typów mikroskopów i użycie odpowiednich filtrów ma kluczowe znaczenie dla poprawności interpretacji. Bardziej szczegółowe informacje można uzyskać od producenta mikroskopu lub przedstawiciela firmy Dako lub na stronie internetowej firmy Dako. 5. Olejek Niefluoryzujący olejek imersyjny. Środki ostrożności Poszczególne fluorochromy wymagają różnego osprzętu. W przypadku sond Dako FISH nie jest zalecana lampa rtęciowa 50 W, nie można używać filtrów rodaminowych i nie zaleca się generalnie używania filtrów potrójnych. Nieoptymalnie dobrany i skonfigurowany mikroskop może być przyczyną problemów z odczytem sygnałów fluorescencyjnych. Źródło światła nie może być nadmiernie zużyte, musi być prawidłowo ustawione i zogniskowane. Klienci powinni monitorować stopień zużycia lampy rtęciowej i parametry mikroskopu oraz przestrzegać zaleceń producenta dotyczących konserwacji tych urządzeń. Należy w miarę możliwości unikać wystawiania preparatów na działanie światła wzbudzającego, aby zminimalizować zanik fluorescencji. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 17/20

18 Zalecamy, by przed rozpoczęciem hybrydyzacji FISH omówić konfigurację konkretnego mikroskopu z przedstawicielem jego producenta lub sięgnąć do odpowiedniej literatury. Dodatek 2 Etap opcjonalny optymalizacja czasu trawienia enzymem Pepsin Ten opcjonalny etap umożliwia ocenę wpływu trawienia pepsyną na preparat i pomaga w optymalizacji czasu trawienia w Etapie 2, Pepsin. Aby sprawdzić, czy przyjęty czas trawienia pepsyną jest wystarczający, należy wybarwić wypłukany skrawek tkankowy wytrawiony pepsyną 10 µl jodku jodkiem propidyny (400 ng/ml, barwnik dostarczany przez użytkownika). Umieścić szklane szkiełko nakrywkowe 22 mm x 22 mm na jodku propidyny i pozwolić, by barwnik równomiernie rozlał się pod szkiełkiem. Inkubować przez 1 minutę. Korzystając z mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem podwójnym Texas Red/FITC (zob. Dodatek 1), ocenić czerwony odczyn jądrowy wywołany przez jodek propidyny. Jeśli trawienie trwało wystarczająco długo, powinny być widoczne czerwone jądra z dobrze zaznaczonymi brzegami. Usunąć jodek propidyny, mocząc skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer dwa razy po 3 minuty w temperaturze pokojowej (20 25 C) i przejść do sekcji B.3, Protokół wykonania odczynu, Etap 3, Sonda FISH. Jeśli jądra nadal samoistnie fluoryzują na zielono i nie zostały wybarwione na czerwono w reakcji z jodkiem propidyny, konieczne jest powtórzenie cyklu trawienia: Moczyć skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer dwa razy po 3 minuty w temperaturze pokojowej (20 25 C), aby usunąć jodek propidyny. Nakapać 5 8 kropli (250 µl) zimnego (2 8 C) enzymu Pepsin (fiolka 2) w sposób zapewniający pokrycie preparatu. Fiolkę z enzymem Pepsin należy zawsze przechowywać w temperaturze 2 8 C. Umieścić szkiełka w temperaturze 37 C na wstępnie podgrzanej płycie grzejnej lub w urządzeniu Dako Hybridizer. Inkubować przez 10 minut, jeśli trawienie było zupełnie lub częściowo nieskuteczne. Czas 10 minut jest jedynie orientacyjny użytkownik powinien sam określić optymalny czas. Znów moczyć skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer dwa razy po 3 minuty w temperaturze pokojowej (20 25 C), aby usunąć enzym Pepsin. Ponownie nałożyć 10 µl jodku propidyny (400 ng/ml) na 1 minutę. Ocenić odczyn i moczyć skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer dwa razy po 3 minuty w temperaturze pokojowej (20 25 C). W razie potrzeby powtórzyć cykl lub przejść do sekcji B.3, Protokół wykonania odczynu, Krok 4, Sonda FISH. UWAGA: Zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 20 testów. Zastosowanie buforu Wash Buffer i enzymu Pepsin w tym opcjonalnym etapie spowoduje zmniejszenie liczby testów, jaką można wykonać przy użyciu jednego zestawu. ( ) K5599/PL/SMA/ str. 18/20

19 Piśmiennictwo 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 CFR 7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; Brown RSD, Edwards J, Bartlet JW, Jones C, Dogan A. Routine acid decalcification of bone marrow samples can preserve DNA for FISH and CGH studies in metastatic prostate cancer. J Histochem Cytochem : Alers JC, Krijtenberg P-J, Visser KJ, van Dekken H. Effect of bone decalcification procedures on DNA in situ hybridization and comparative genomic hybridization: EDTA is highly preferable to a routinely used acid decalcifier. J Histochem Cytochem : Provan AB, Hodges E, Smith AG, Smith JL. Use of paraffin wax embedded bone marrow trepine biopsy specimens as a source of archival DNA. J Clin Pathol : Sarsfield P, Wickham CL, Joyner MV, Ellard S, Jones DB, Wilkins BS. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol : Reineke T, Jenni B, Abdou MT, Frigerio S, Zubler P, Moch H, Tinguely M. Ultrasonic decalcification offers new perspectives for rapid FISH, DNA, and RT-PCR analysis in bone marrow trephines. Am J Surg Pathol : Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; Objaśnienie symboli Numer katalogowy Temperatura przechowywania Numer serii Skrajnie łatwopalny Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Chronić przed słońcem (patrz sekcja nt. przechowywania) Zużyć przed Niebezpieczny dla środowiska Sprawdzić w instrukcji stosowania Zawartość wystarcza na <n> testów Producent ( ) K5599/PL/SMA/ str. 19/20

20 Producent: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 Tel DK-2600 Glostrup Fax Denmark ( ) K5599/PL/SMA/ str. 20/20