Biomineralizacja kontrolowana przez białka precyzja kształtu, struktury i właściwości

Transkrypt

1 Biomineralizacja kontrolowana przez białka precyzja kształtu, struktury i właściwości Rafał Hołubowicz* Aleksandra Porębska* Monika Poznar* Mirosława Różycka* Piotr Dobryszycki * Zakład Biochemii, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska, Wrocław * Zakład Biochemii, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska, Wybrzeże Wyspiańskiego 27, Wrocław; tel.: (71) , piotr.dobryszycki@pwr.edu. pl *Autorzy mają taki sam wkład w napisanie artykułu. Artykuł otrzymano 2 czerwca 2015 r. Artykuł zaakceptowano 31 lipca 2015 r. Słowa kluczowe: biomineralizacja, białka inherentnie nieuporządkowane, hydroksyapatyt, kolagen, nanocząstki, SIBLING, węglan wapnia Wykaz skrótów: ASARM (ang. acidic serine- and aspartate-rich motif) kwaśny motyw bogaty w reszty seryny i asparaginianu; BSP (ang. bone sialoprotein) sjaloproteina kości; DSPP (ang. dentin sialophosphoprotein) sjalofosfoproteina macierzy zębiny; IDPs (ang. intrinsically disordered proteins) białka inherentnie nieuporządkowane; DMP1 (ang. dentin matrix protein) białko macierzy zębiny; MEPE (ang. matrix extracellular phosphoglycoprotein) zewnątrzkomórkowa fosfoglikoproteina macierzy; MMPs (ang. matrix metalloproteinase) metaloproteinaza macierzy zewnątrzkomórkowej; NPP1 (ang. nucleoside pyrophosphohydrolase-1) pirofosfohydrolaza nukleozydów; OMM-64 (ang. otolith matrix macromolecule-64) białko macierzy otolitów-64; PHOSPHO1 kwaśna sieroca fosfataza 1; PILP (ang. polimer-induced liquid precursor) ciekły prekursor zapoczątkowany polimerem; PiT1/2 kotransporter sodowo-fosforanowy typu III; SIBLING (ang. small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein) mały N-glikozylowany ligand wiążący integryny Podziękowania: Praca została sfinansowana z dotacji Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego na działalność statutową Wydziału Chemicznego Politechniki Wrocławskiej. STRESZCZENIE Biomineralizacja jest procesem tworzenia struktur krystalicznych, który jest pod kontrolą biologiczną. Organizmy żywe wytwarzają struktury takie jak kości, zęby, otolity, otokonia czy też muszle. Chociaż skład chemiczny tych tkanek jest zbliżony do odpowiadających im nieorganicznych minerałów, ich struktura i właściwości mechaniczne znacznie się różnią. Może to być spowodowane tym, jak są one przystosowane do pełnionych przez nie funkcji. Precyzyjna kontrola tworzenia biominerałów już od wczesnej fazy nukleacyjnej wpływa na ostateczny charakter tkanek. Kluczowymi czynnikami, które determinują rozmiar, kształt, strukturę wewnętrzną i właściwości biominerału są białka, które kontrolują powstawanie i wzrost kryształu. Biomineralizacja jest wieloetapowym procesem obejmującym oddziaływania białko-białko, jak również oddziaływania pomiędzy białkami i frakcją nieorganiczną. Dzięki swoim specyficznym właściwościom, białka inherentnie nieuporządkowane (IDPs) pełnią szczególnie ważną rolę w kontroli procesu biomineralizacji. Artykuł zawiera przegląd biominerałów występujących naturalnie oraz opisuje struktury i mechanizmy mineralizacji najważniejszych z nich. Główną część artykułu poświęcono roli białek kontrolujących wzrost kryształów. WPROWADZENIE Mineralizacja polega na wychwytywaniu jonów ze środowiska i wprowadzaniu ich w struktury krystaliczne [1]. Proces ten jest rozpowszechniony zarówno w świecie nieożywionym jak i wśród organizmów żywych. Organizmy żywe wytwarzają minerały takie jak muszle, otolity, otokonia, kości i zęby, wprowadzając substancje organiczne w ich struktury. Biomineralizacja jest precyzyjnie kontrolowana już przed rozpoczęciem tworzenia kryształów. Ścisła kontrola polegająca na regulacji ekspresji określonych genów, transportu jonów i makrocząsteczek oraz aktywności poszczególnych białek, pozwala organizmom żywym tworzyć struktury mineralne o pożądanych właściwościach, dostosowanych do funkcji wytwarzanej tkanki twardej (ang. hard tissue) [2]. Do produkcji tkanek twardych organizmy żywe wykorzystują: dwutlenek krzemu, węglan wapnia, fosforan wapnia, szczawian wapnia, tlenki żelaza oraz siarczki i halogenki (Tab. 1). Najpowszechniej występującymi są węglan i fosforan wapnia [1]. Węglan wapnia może występować w odmianach polimorficznych takich jak: kalcyt, wateryt, aragonit, monohydrokalcyt, ikait oraz jako amorficzny węglan wapnia (ang. amorphous calcium carbonate). Kalcyt i aragonit są najbardziej stabilne termodynamicznie i często odkładane jako biominerały, tworząc szkielet wewnętrzny i/lub zewnętrzny bezkręgowców oraz otolity i otokonia. Fosforan wapnia również może występować w wielu odmianach. Hydroksyapatyt, amorficzny fosforan wapnia i fosforan ośmiowapniowy są najczęściej spotykane w organizmach żywych [3]. Hydroksyapatyt jest podstawowym składnikiem mineralnym kości i zębów. Naturalny hydroksyapatyt zawiera znaczną ilość domieszek, głównie jonów węglanowych, magnezowych i sodowych, przez co jest on łatwo wchłaniany [4,5]. Amorficzna postać zarówno węglanu, jak i fosforanu wapnia, została zaobserwowana w układach biologicznych w początkowym etapie procesu biomineralizacji. Pełni ona funkcję fazy prekursorowej, która następnie krystalizuje tworząc właściwy krystaliczny produkt końcowy lub też ulega stabilizacji pełniąc swoją funkcję w postaci amorficznej [1]. Amorficzny fosforan wapnia jest szklistą substancją o niskim stopniu uporządkowania. Uważa się, że bierze on udział w początkowych etapach procesów syntezy kości i zębów. Białka mogą katalizować przekształcenie amorficznego fosforanu wapnia w hydroksyapatyt [1,6,7]. Biominerały różnią się od swoich nieorganicznych odpowiedników obecnością macierzy organicznej (ang. organic matrix). Wśród jej składników możemy wyróżnić substancje nierozpuszczalne, do których należą makrocząsteczki strukturalne, tworzące rusztowanie dla powstającego minerału. Nadają one kształt powstającemu kryształowi i mogą działać jako inicjatory tworzenia za

2 Tabela 1. Przykłady biominerałów wytwarzanych przez organizmy żywe. Na podstawie [1]. Nazwa minerału Organizm Lokalizacja biologiczna Funkcja biologiczna Węglan wapnia Fosforan wapnia Szczawian wapnia Tlenek żelaza rośliny, organizmy morskie, ptaki, ssaki ryby, skorupiaki, kręgowce, ssaki rośliny, grzyby, ssaki bakterie, chitony, tuńczyk/łosoś, ssaki liście, skorupy jaj, muszle, oskórek kraba, otolity, otokonia kości, zęby, skrzela, żołądek mięśniowy liście, strzępki kamienie nerkowe zęby, głowa, filamenty, ferrytyna strukturalna, ochronna, receptor grawitacji, magazyn wapnia strukturalna, ochronna, podporowa, magazyn jonów, rozdrabnianie pokarmów ochronna, magazynowa proces patologiczny wytrzymałość mechaniczna, magnetotaksja, magazyn żelaza Siarczany meduzy, grzyby protista, algi statokonia, statolity receptory grawitacji Fluorek wapnia mięczaki, skorupiaki, ssaki żołądek mięśniowy, statocysty, szkliwo zębów rozdrabnianie pokarmu, receptory grawitacji Krzemionka okrzemki, promienice, rośliny ściana komórkowa szkieletowa, ochronna czątków krystalizacyjnych. Do tych substancji należą między innymi chityna oraz kolagen. Drugą grupę stanowią rozpuszczalne w wodzie, często silnie naładowane białka. Z reguły są to białka kwaśne, zdolne do wiązania dużej ilości jonów wapnia, co może zmniejszać ich stężenie w roztworze i hamować tym samym wzrost kryształów węglanu lub fosforanu wapnia [1]. Dodatkowo, wiążąc się na powierzchni minerału, określają kierunek jego wzrostu. Z drugiej strony, jeżeli oddziaływania tych cząsteczek stabilizują zaczątki kryształów, mogą również ułatwiać dalszą mineralizację [8]. Do tej grupy należą m. in. silnie kwaśne białka zaangażowane w biomineralizację otolitów ryb: Starmaker [9-13], białko macierzy otolitów-64 (ang. otolith matrix macromolecule-64, OMM64) [14] i Starmaker-like [15,16], które badamy w Zakładzie Biochemii. Wiele białek zaangażowanych w biomineralizację jest modyfikowanych potranslacyjnie, co ma istotny wpływ na ich aktywność biomineralizacyjną [17,18]. Chociaż białka pełnią tak ważną rolę w procesie biomineralizacji, to mechanizm ich działania nadal nie został dokładnie wyjaśniony. Ważną grupę białek zaangażowanych w biomineralizację stanowią białka inherentnie nieuporządkowane (IDPs, ang. intrinsically disordered proteins) [17,18]. Są to białka, które w stanie natywnym są częściowo lub całkowicie pozbawione ściśle zdefiniowanej struktury trzeciorzędowej. IDPs są niezwykle plastyczne, występują jako heterogenna populacja cząsteczek o dużej dynamice konformacyjnej. Białka z tej rodziny charakteryzują się niską hydrofobowością i obecnością wielu nieskompensowanych ładunków, co może warunkować brak upakowanej struktury. IDPs często wiążą ligandy niskocząsteczkowe i makrocząsteczki takie jak białka. Co ciekawe, podczas takiego oddziaływania białka mogą ulegać lokalnej lub globalnej strukturyzacji, często też spełniają swoje funkcje pozostając całkowicie nieuporządkowanymi [19,20]. Wysoki ładunek wypadkowy, podatność na modyfikacje, elastyczność i w szczególności zdolność oddziaływania z wieloma różnymi partnerami czynią te białka szczególnie przystosowanymi do pełnienia funkcji kontrolnych w procesie biomineralizacji. O właściwościach IDPs można przeczytać między innymi w pracy przeglądowej [20]. Rodzina SIBLING (ang. small integrin-binding ligand N- -linked glycoprotein) obejmuje białka zidentyfikowane w kościach, zębinie i cemencie: sjaloproteinę kości (BSP, ang. bone sialoprotein), osteopontynę (ang. osteopontin), zewnątrzkomórkową fosfoglikoproteinę macierzy (MEPE, ang. matrix extracellular phosphoglycoprotein), sjalofosfoproteinę zębiny (DSPP, ang. dentin sialophosphoprotein) i białko macierzy zębiny (DMP1, ang. dentin matrix protein-1) [21]. Mimo niskiej homologii sekwencji, mają one kilka cech wspólnych. Uważa się, że wszystkie wyewoluowały w wyniku duplikacji genów od zewnątrzkomórkowych fosfoprotein wiążących jony wapnia. Białka SIBLING należą do IDPs, mają charakter silnie kwaśny, często posiadają peptyd RGD (Arg-Gly-Asp) oraz specyficzne motywy bogate w reszty seryny i asparaginianu (ASARM, ang. acidic serine- and aspartate-rich motif) [22]. Peptyd RGD jest sygnałem adhezji komórkowej zachodzącej za pośrednictwem białek międzybłonowych, integryn. Szczególne znaczenie dla ich funkcji biomineralizacyjnej mogą mieć zachowane w toku ewolucji kwaśne fosfopeptydy ASARM, które są również zaangażowane w gospodarkę fosforanową [23,24] Białka SIBLING są syntetyzowane między innymi w kościach i zębinie podczas tworzenia osteoidu i na kolejnych etapach biomineralizacji. Są one fosforylowane i glikozylowane, co ma ogromne znaczenie dla ich funkcji [21]. Zawartość substancji organicznych w strukturach biominerałów może wynosić od około 0,02% wagowych w kolcach jeżowców do 20% w kościach [1]. Frakcja ta pełni kluczową rolę warunkując rozmiar, kształt, odmianę polimorficzną oraz hierarchiczną strukturę i unikatowe właściwości mechaniczne kryształów [25]. Poznanie roli poszczególnych makrocząsteczek kontrolujących powstawanie biominerałów jest niezbędne dla pełnego zrozumienia mechanizmu procesu biomineralizacji i jego patologii. Skomplikowane mechanizmy kontroli biomineralizacji czasami zawodzą, prowadząc do patologicznej biomineralizacji. Może ona polegać na nieprawidłowym wzroście tkanek twardych lub na niepożądanej mineralizacji tkanek miękkich (ang. ectopic mineralization). Wady mineralizacji tkanek twardych przejawiają się w takich schorzeniach jak na przykład wrodzona łamliwość kości (ang. osteogenesis imperfecta), dziedziczne zaburzenia struktury zęba, osteomalacja i krzywica. Do najbardziej znanych przykładów nieprawidłowej mineralizacji tkanek miękkich należą natomiast: płytki miażdżycowe naczyń krwionośnych, kamienie żółciowe i kamienie nerkowe [8]. Postępy Biochemii 61 (4)

3 KOŚCI Kości stanowią podporę dla organizmu i miejsce przyczepu mięśni, umożliwiając poruszanie się i utrzymanie równowagi w polu grawitacyjnym. Stanowią one też magazyn substancji mineralnych, przede wszystkim jonów wapnia i jonów fosforanowych. Kość jest materiałem kompozytowym, której głównym budulcem są włókna kolagenu I zmineralizowane hydroksyapatytem. W jej skład wchodzą również białka niekolagenowe oraz woda. Hydroksyapatyt zapewnia kościom twardość, frakcja organiczna z kolei zapewnia rusztowanie dla biominerału i reguluje proces biomineralizacji [4,26,27]. Włókna kolagenu I tworzą pęczki z wolnymi przestrzeniami, w których osadzone są nanokryształy hydroksyapatytu o szerokości od 15 do 30 nm, długości od 30 do 50 nm i grubości od 2 do 10 nm. Mały rozmiar kryształów oraz domieszka jonów węglanowych (4 6%), sodowych (0,9%) i magnezowych (0,5%) sprawiają, że cząstki naturalnego hydroksyapatytu są łatwo wchłaniane, co ma ogromne znaczenie dla plastyczności tkanki kostnej [4,5]. KOLAGEN I Kolagen I jest heterotrimerycznym białkiem posiadającym charakterystyczną potrójnie helikalną strukturę spowodowaną obecnością powtórzeń Gly-Xzz-Yzz, gdzie Xzz stanowi często reszta proliny, a Yzz reszta hydroksyproliny. Hydroksylacja reszty proliny w kolagenie jest niezbędna dla stabilizacji potrójnej helisy [28]. Łańcuchy kolagenu tworzą oddziaływania prowadzące do organizacji łańcuchów w czterostopniowym szyku [4]. Włókna kolagenu ulegają również sieciowaniu za pośrednictwem reszt lizylowych [29]. Techniki mikroskopii elektronowej pozwalają obserwować następujące po sobie regiony nakładania i przerwy wynikające z wzajemnego ułożenia włókien kolagenu [27]. BIAŁKA NIEKOLAGENOWE Włókno kolagenowe nie ulega spontanicznej mineralizacji w obecności jonów fosforanowych i wapniowych [27,30]. Aby do niej doszło, konieczny jest udział białek niekolagenowych kości. Przeważająca część tych białek należy do rodziny SIBLING [21]. Sjaloproteina kości (BSP) BSP jest zlokalizowana wyłącznie w tkankach ulegających mineralizacji: w kości, zębinie i mineralizującej chrząstce [21]. Stanowi ona około 15% masy białek niekolagenowych kości. Około połowa masy cząsteczkowej tego białka przypada na reszty cukrowe, szczególnie kwas sjalowy. BSP w mniejszym stopniu ulega również fosforylacji i sulfonacji. BSP składa się z trzech domen: domeny N-końcowej, która zawiera fragment wiążący kolagen, fragmentu środkowego i domeny C-końcowej, która jest silnie glikozylowana. Fragmenty N- i C-końcowy zawierają większość reszt aromatycznych. Fragment środkowy zawiera sekwencje bogate w reszty kwasu glutaminowego i fosforylowane reszty seryny. Charakterystyczną cechą BSP jest silne nieuporządkowanie struktury [24]. Szczególnie wysoki poziom syntezy BSP obserwuje się w osteoblastach na początku syntezy kości. Z wiekiem, poziom syntezy tego białka szybko spada. BSP jest wykrywane w pęcherzykach błonowych oraz na mineralizujących krawędziach kości, zębiny i mineralizujących chrząstek. Białko ułatwia powstawanie hydroksyapatytu, a jego potencjał zarodkujący zwiększa się po związaniu z kolagenem. Obecność BSP zwiększa również aktywność fosfatazy zasadowej. Obserwacje te sugerują, że BSP bierze udział w początkowych etapach biomineralizacji hydroksyapatytu. Z drugiej strony, BSP może zapoczątkowywać przebudowę kości przez zwiększenie osteoklastogenezy, co wskazuje na istotną rolę tego białka w utrzymaniu homeostazy kości [21,24]. Osteopontyna Osteopontyna po raz pierwszy została zidentyfikowana w kościach, następnie również w zębinie i cemencie. W toku późniejszych badań odkryto, że jest ona syntetyzowana w całym ciele. Osteopontyna jest silnie kwaśnym białkiem w znacznym stopniu N- i O-glikozylowanym i fosforylowanym, ulega również sulfonacji. Stopień modyfikacji potranslacyjnej osteopontyny różni się w zależności od miejsca sytezy. Dla fosforylacji wynosi od około 30% w kościach i nerkach do 100% w mleku. N-glikozylację osteopontyny zaobserwowano do tej pory wyłącznie dla izoformy z kości [31,32]. Ta heterogenność modyfikacji osteopontyny w różnych tkankach wynika najprawdopodobniej z różnych roli, jakie to białko spełnia w organizmie. W kościach i zębinie, osteopontyna jest zlokalizowana w miejscu syntezy biominerału. Białko to wykryto również w kryształach pojawiających się w tkankach miękkich (kamienie nerkowe, blaszki miażdżycowe), co sugerowało, że osteopontyna może być induktorem biomineralizacji. Dalsze badania wykazały jednak, że zwiększenie poziomu syntezy osteopontyny i wynikająca stąd obecność tego białka w biominerałach jest skutkiem, nie przyczyną precypitacji hydroksyapatytu, i prawdopodobnie jest elementem mechanizmu ochrony przed mineralizacją tkanek miękkich. Myszy z nokautem genu kodującego osteopontynę mają silniej zmineralizowane kości, a przy zastosowaniu diety litogennej (indukującej powstawanie kamieni nerkowych) są bardziej niż myszy typu dzikiego podatne na wytrącanie szczawianu wapnia w nerkach [32]. Wykazano, że osteopontyna wiąże się na powierzchni kryształów hydroksyapatytu w wyniku oddziaływań elektrostatycznych między kryształami a grupami karboksylowymi i fosforanowymi. Ze względu na silnie kwaśny charakter całego białka, osteopontyna nie ma zdefiniowanego miejsca wiążącego hydroksyapatyt. Wykazano jednak, że peptyd ASARM jest odpowiedzialny za hamowanie precypitacji hydroksyapatytu. W hodowli komórkowej w warunkach indukujących biomineralizację, osteopontyna hamuje precypitację hydroksyapatytu zarówno dla komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, jak i dla osteoblastów [21,32,33]

4 Wyniki badań in vitro i in vivo sugerują, że osteopontyna jest inhibitorem biomineralizacji spełniającym swoją funkcję w całym organizmie. W kościach najprawdopodobniej jest ona zaangażowana w regulację procesu biomineralizacji. Zewnątrzkomórkowa fosfoglikoproteina macierzy (MEPE) MEPE jest fosfoglikoproteiną zawierającą peptyd RGD, regiony kwaśne i peptyd ASARM [34]. Przypuszcza się, że główną funkcją MEPE jest regulacja procesu mineralizacji kości. Myszy z nokautem MEPE mają podwyższoną masę kości, jak również większą ilość i grubość beleczek kostnych w tkance kostnej gąbczastej. Obserwuje się też zwiększoną liczbę osteoblastów. Peptyd ASARM jest uwalniany w wyniku trawienia MEPE przez katepsynę B. Wykazano, że jest on bardzo silnym, zależnym od fosforylacji inhibitorem precypitacji hydroksyapatytu [33]. Proponowany mechanizm działania peptydu ASARM obejmuje silne wiązanie jonów wapnia, przez co nie mogą być one wykorzystane do syntezy hydroksyapatytu [24,34]. Fetuina-A Fetuina-A (glikoproteina α-hs) jest białkiem występującym obficie w osoczu. Jest również obok BSP głównym białkiem niekolagenowym kości. Fetuina-A jest systemowym inhibitorem precypitacji fosforanu wapnia. W roztworze, w warunkach przesycenia jonami wapniowymi i fosforanowymi, fetuina-a hamuje precypitację fosforanu wapnia tworząc rozpuszczalne koloidalne nanosfery fosforanu wapnia z otoczką białkową. Nokaut genu kodującego fetuinę-a u myszy przyczynia się do silnego zwapnienia tkanek miękkich. Brak fetuiny-a w podłożu hodowlanym osteoblastów powoduje silne zwapnienie hodowli i śmierć komórek [35]. Fetuinie-A przypisuje się rolę podstawowego czynnika umożliwiającego specyficzne zmineralizowanie włókna kolagenowego [27,36]. Osteokalcyna Osteokalcyna jest małym białkiem IDP obecnym w kościach i w osoczu. Łańcuchy boczne reszt glutaminianu osteokalcyny ulegają karboksylacji zależnej od witaminy K, przy czym w osoczu białko to występuje w formie o niskim poziomie karboksylacji lub jej braku [37]. W obecności jonów wapnia karboksylowana osteokalcyna ulega sfałdowaniu. Co zaskakujące, w formie związanej z jonami wapnia łańcuchy boczne γ-karboksyglutaminianu osteokalcyny są ułożone w przestrzeni zgodnie z pozycją jonów wapnia w sieci krystalicznej hydroksyapatytu [38]. Dzięki temu, karboksylowana osteokalcyna silnie wiąże się z kryształami hydroksyapatytu, co prowadzi do zahamowania jego precypitacji. Mimo to, wyciszenie ekspresji genu kodującego osteokalcynę u myszy nie powoduje widocznych defektów tkanki kostnej. Odkryto jednak zmiany w składzie mineralnym kości: zawierały one mniej domieszek, głównie jonów węglanowych, co zwiększyło ich kruchość [37]. Stężenie osteokalcyny w osoczu jest skorelowane z liczbą osteoblastów w tkance kostnej, przez co uważa się ją za marker aktywności metabolicznej kości [37]. Ostatnie badania sugerują również, że osteokalcyna może być zaangażowana w regulację metabolizmu ustroju, wpływając na gospodarkę cukrową [39]. Metaloproteinazy macierzy W ciągu życia organizmu, kości ulegają ciągłemu przetwarzaniu, które obejmuje również ich macierz organiczną. Rodzina metaloproteinaz macierzy (ang. matrix metalloproteinases, MMPs) obejmuje enzymy proteolityczne zaangażowane w degradację i przetwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej [40,41]. Głównymi MMPs zaangażowanymi w metabolizm kości są MMP-2, -9, -13, -14 i -16. Trawienie macierzy zewnątrzkomórkowej przez MMPs umożliwia przebudowywanie kości i może uwalniać cząsteczki sygnałowe lub odsłaniać ukryte miejsca wiązania receptorów. MMPs biorą też udział w patogenezie chorób kości i chrząstek takich jak: osteoporoza, reumatoidalne zapalenie stawów, choroba zwyrodnieniowa stawów czy choroby kości o podłożu genetycznym [40,42,43]. MMP-9 i MMP-13 są zaangażowane w kostnienie szkieletu chrzęstnego po urodzeniu. MMP-13 trawi kolagen I i II na fragmenty, które z kolei są substratami MMP-9. W przypadku nokautu genu kodującego jedno z tych białek, drugie może częściowo kompensować brak pierwszego, jednak zawsze obserwuje się opóźnienie mineralizacji chrząstek, zaburzenia unaczynienia tkanki kostnej i nieprawidłową budowę tkanki kostnej gąbczastej. W przypadku nokautu mmp-9 zaobserwowano też nieprawidłowości w różnicowaniu chondrocytów. Wyniki badań wskazują, że zaburzenie trawienia kolagenu II, który jest głównym składnikiem macierzy organicznej tkanki chrzęstnej, uniemożliwia jej prawidłowe zmineralizowanie do tkanki kostnej [40,42,43]. MMP-14 (inaczej: MT1-MMP) i MMP-16 (inaczej: MT3- -MMP) są białkami kotwiczonymi po zewnętrznej stronie błony komórkowej. Uważa się, że są one zaangażowane w przetwarzanie kolagenu I i II. Spośród wszystkich MMPs, najcięższe zaburzenia w budowie szkieletu u myszy są obserwowane przy nokaucie genu mmp-14. Bezpośrednio po urodzeniu, myszy z nokautem genu mmp14 nie różnią się od myszy typu dzikiego, jednak od 5 dnia życia pojawiają się postępujące nieprawidłowości szkieletu: krótki pysk, brak szwów czaszkowych, opóźniona mineralizacja czaszki, krótkie kończyny i silnie obniżona masa kości (osteopenia). W stawach obserwuje się silne unaczynienie tkanki maziowej i zniszczenie chrząstek prowadzące do ankylozy (zesztywnienia stawów). Inne tkanki ulegają postępującemu zwłóknieniu. Większość myszy nie dożywa 90 dni [40,44]. Rola MMP-16 w metabolizmie kości jest słabiej poznana. Prawdopodobnie uzupełnia ona działanie MMP-14, ponieważ myszy z podwójnym nokautem genów mmp-14 i mmp- 16 giną krótko po urodzeniu [40,45]. MECHANIZM BIOMINERALIZACJI KOŚCI Niezwykle ważnymi dla przebiegu biomineralizacji kości są procesy zachodzące w pęcherzykach błonowych wydzielanych przez hipertroficzne chondrocyty oraz osteoblasty (Ryc. 1A). W pęcherzykach zachodzi synteza zaczątków Postępy Biochemii 61 (4)

5 hydroksyapatytu. Ich błona jest wzbogacona w fosfatydyloserynę, która ma zdolność wiązania jonów wapnia. Białka występujące w pęcherzykach błonowych można podzielić na: enzymy, białka wiążące jony wapnia i białka błonowe zaangażowane w transport składników mineralnych. Do enzymów należą: kwaśna sieroca fosfataza I (PHOSPHO1, nr EC ) oraz związane z błoną zewnętrzną: tkankowo niespecyficzna fosfataza zasadowa (TNAP, ang. tissue non-specific alkaline phosphatase, nr EC ) i pirofosfohydrolaza nukleozydów (NPP1, ang. nucleoside pyrophosphohydrolase-1, nr EC ). Do białek wiążących jony wapnia należą między innymi kalbindyna 9k i BSP. Z kolei kotransporter sodowo-fosforanowy typu III (PiT1/2) bierze udział w transporcie jonów fosforanowych, który dostarcza je do pęcherzyków błonowych. Dodatkowym źródłem jonów fosforanowych jest PHOSPHO1 uwalniająca fosforan z fosfocholiny i fosfoetanoloaminy. Aneksyny, w szczególności aneksyna A5, tworzą w obecności fosfatydyloseryny heksameryczny kanał błonowy specyficzny dla jonów wapnia [41,46-48]. Jony wapnia są dostarczane z macierzy zewnątrzkomórkowej kanałem utworzonym przez aneksyny. Uważa się, że w obecności jonów fosforanowych kompleks aneksyn z fosfatydyloseryną staje się miejscem powstawania zaczątków hydroksyapatytu, które następnie są wydzielane do macierzy zewnątrzkomórkowej. Tam, fosfataza TNAP związana z błoną pęcherzyków, katalizuje tworzenie jonów fosforanowych z polifosforanów, co umożliwia wzrost nanocząstek hydroksyapatytu. Regulacja wzrostu nanocząstek hydroksyapatytu zachodzi przy udziale hydrolazy NPP1, która katalizuje hydrolizę zewnątrzkomórkowego ATP do AMP i pirofosforanu, który z kolei hamuje wzrost kryształów hydroksyapatytu. Pirofosforan jest również dostarczany przez osteoblasty przy udziale kanału ANK (ang. ankylosis protein). Utrzymywana przez przeciwstawne funkcje TNAP i NPP1 równowaga pirofosforan/ fosforan jest jednym z czynników regulujących proces biomineralizacji kości [46-50]. Istnieją dwa modele próbujące opisać szczegółowo mechanizm biomineralizacji włókna kolagenowego: model ciekłego prekursora zapoczątkowanego polimerem (PILP, ang. polimer-induced liquid precursor) (Ryc. 1B) [4] i model wykluczenia inhibitora (Ryc. 1C) [36]. Oba mechanizmy zostały podsumowane w obszernej pracy przeglądowej [27]. PILP jest amorficzną fazą ciekłą zawierającą jony wapniowe i fosforanowe, polielektrolit oraz wodę. Jako modelowy polimer indukujący powstawanie PILP wykorzystuje się poli- -asparaginian (poli-asp). Początkowo PILP obserwowano dla węglanu wapnia, lecz niedawno udało się go zaobser- Rycina 1. Model biomineralizacji kości. (A) Udział pęcherzyków błonowych w biomineralizacji. Pęcherzyki błonowe wydzielane przez osteoblasty zawierają fosfatydyloserynę i białka niekolagenowe umożliwiające syntezę zaczątków hydroksyapatytu, które następnie są wydzielane do macierzy zewnątrzkomórkowej. (B) Model biomineralizacji przy udziale PILP. (1) tworzenie PILP z fosforanu i jonów wapnia w obecności białek niekolagenowych, (2) wnikanie PILP w sieć włókien kolagenu I, (3) mineralizacja włókien. (C) Model wykluczenia inhibitora. (1) wydzielanie zaczątków hydroksyapatytu z pęcherzyków błonowych, (2) wnikanie zaczątków w sieć włókien, (3) przekształcenie zaczątków w nanokryształy hydroksyapatytu. Końcowym produktem przedstawionych procesów jest zmineralizowane włókno kolagenowe. ANK ang. ankylosis protein, ANX kompleks aneksyna-fosfatydyloseryna, ASARM kwaśny motyw bogaty w serynę i asparaginian, BSP sjaloproteina kości, C cholina, EA etanoloamina, OPN osteopontyna, MEPE zewnątrzkomórkowa fosfoglikoproteina macierzy, NPP1 pirofosfohydrolaza nukleozydów, PC fosfocholina, PEA fosfoetanoloamina, PHOSPHO1 kwaśna sieroca fosfataza I, Pi fosforan, PILP ciekły prekursor zapoczątkowany polimerem, PiT1/2 kotransporter sodowo-fosforanowy typu III, PPi pirofosforan, TNAP tkankowo niespecyficzna fosfataza zasadowa. Rycinę przygotowano na podstawie [4,27,36,41,46] 368

6 wować również dla fosforanu wapnia. Zaproponowano mechanizm, według którego kropelki PILP miałyby wnikać w sieć włókien kolagenowych i ulegać zestaleniu do fazy amorficznej, która w wyniku starzenia ulegałaby przekształceniu w hydroksyapatyt (Ryc. 1B) [1,4]. Model wykluczenia inhibitora jako mechanizmu indukującego biomineralizację został zaproponowany po zaobserwowaniu selektywności sieci włókien kolagenowych względem cząsteczek o różnej masie. Przy zastosowaniu filtracji żelowej wykazano, że makrocząsteczki o masie cząsteczkowej wyższej niż 40 kda nie mogą wnikać w sieć włókien kolagenowych [51]. Oznacza to, że białka SIBLING i fetuina-a nie powinny mieć dostępu do przestrzeni między włóknami kolagenowymi. Dostęp ten miałby być możliwy jedynie dla zaczątków kryształów hydroksyapatytu, które dzięki lokalnemu zagęszczeniu utworzyłyby fazę krystaliczną (Ryc. 1C). Badania wpływu fetuiny-a na biomineralizację kolagenu I w roztworze przesyconym względem hydroksyapatytu zdają się potwierdzać ten model [36]. Jak już wspomniano, fetuina-a hamuje precypitację hydroksyapatytu. Kiedy w badanym układzie były obecne włókna kolagenowe, obserwowano powstawanie kryształów hydroksyapatytu w sieci kolagenu bez precypitacji w objętości roztworu. W roztworach bez dodatku fetuiny-a hydroksyapatyt precypitował w objętości roztworu, włókna kolagenowe zaś pozostawały niezmineralizowane. Oba modele mogą przynajmniej częściowo opisywać stan rzeczywisty. Wydaje się również prawdopodobny model hybrydowy, w którym inhibitory biomineralizacji jak np. fetuina-a, osteopontyna lub MEPE hamowałyby precypitację hydroksyapatytu w przestrzeni międzykomórkowej, a mineralizacja sieci kolagenowej zachodziłaby przy udziale PILP. Proces ten mógłby być dodatkowo regulowany przez pirofosforany lub peptydy ASARM. ZĘBY innych zmineralizowanych tkanek, szkliwo traci prawie całą macierz organiczną, która jest degradowana i zastępowana przez kryształy hydroksyapatytu pod koniec krystalizacji. Pozostałości, małe peptydy i aminokwasy, stanowią zaledwie 1% szkliwa i nie przypominają oryginalnej macierzy [53,54]. Amelogeniny Amelogeniny to termin określający grupę heterogennych białek zidentyfikowanych w szkliwie dojrzewających zębów oraz obecnych w odontoblastach. Amelogeniny obecne w macierzy międzykomórkowej szkliwa są wynikiem składania różnicowego genu amelogeniny oraz przetwarzania rodzimych cząsteczek. Amelogeniny są zaangażowane w biomineralizację oraz w procesy różnicowania komórek [55]. Są to główne białka macierzy organicznej szkliwa, stanowiące ponad 90% puli białek wydzielanych przez ameloblasty do macierzy międzykomórkowej podczas formowania się szkliwa. Są to białka hydrofobowe, bogate w reszty proliny, glutaminy, leucyny oraz histydyny. Amelogeniny izolowane z różnych organizmów charakteryzują się dużą homologią [56,57]. Analizując wyniki badań nad uwarunkowanymi genetycznie zaburzeniami rozwoju szkliwa, Amelogenesis imperfecta, przypuszcza się, że funkcją amelogeniny jest regulowanie ukierunkowania, kształtu oraz długości kryształów szkliwa [58]. W początkowej fazie mineralizacji, bipolarne cząsteczki amelogenin tworzą skupiska mające części hydrofilowe skierowane na zewnątrz. Te nanosfery oddziałują elektrostatycznie z powierzchnią dopiero powstających kryształów, zapobiegając ich fuzji. W kolejnych etapach odcinki hydrofilowe są trawione przez MMP-20, co zmienia charakter nanosfer na hydrofobowy ułatwiając agregację. Agregacja ta stabilizuje macierz i zawarte w niej kryształy, które wzrastają przez odkładanie się jonów wapniowych i Zęby człowieka zbudowane są z: korony, szyjki oraz korzenia. Koronę zęba pokrywa szkliwo, natomiast korzeń pokryty jest cementem. Szyjka jest miejscem, w którym szkliwo korony styka się z cementem korzenia. W budowie histologicznej zęba wyróżniamy także miazgę, bogato unerwioną i unaczynioną tkankę, która wypełnia komorę zęba (Ryc. 2) [52]. SZKLIWO Podczas rozrostu korony zębów, dwie zmineralizowane macierze szkliwo i zębina formowane są naprzeciw siebie. Są one tworzone przez dwie warstwy komórek, odpowiednio odontoblasty i ameloblasty. Zębina charakteryzuje się dużą zawartością kolagenu, szkliwo natomiast nie posiada tego białka w swojej strukturze. Organiczna część szkliwa składa się głównie z białek hydrofobowych, znanych jako amelogeniny oraz białek anionowych do których należą ameloblastyna, enamelina i tuftelina. Szkliwo zawiera również sjalofosfoproteiny i proteazy szkliwa takie jak metaloproteinaza macierzy-20 (MMP-20, ang. matrix metalloproteinase-20, znana również jako metaloproteinaza szkliwa-20 lub enamelizyna) i kalikreina 4 (KLK4). W odróżnieniu od Rycina 2. Schemat budowy zęba. Na podstawie [52]. Postępy Biochemii 61 (4)

7 fosforanowych. Gdy odpowiednia grubość szkliwa zostaje osiągnięta, hydrofobowe nanosfery są trawione na mniejsze peptydy, które ulegają fagocytozie przez ameloblasty w fazie dojrzewania szkliwa. Na tym etapie promowane jest pogrubianie kryształów i formowanie się pryzmatów szkliwnych [59,60]. Widma CD oraz NMR ujawniły, że amelogenina, w swojej monomerycznej cząsteczce jest wysoce nieustrukturyzowana, posiada jednak niewielką ilość struktur drugorzędowych. Może ona występować w kilku konformacjach [61-63] i oddziaływać z innymi białkami zaangażowanymi w organizację szkliwa [64-66]. Ameloblastyna Ameloblastyna, znana także jako amelina, jest glikoproteiną specyficzną dla zębów. W odróżnieniu do amelogeniny, ameloblastyna zlokalizowana jest w pobliżu powierzchni komórek [67]. Ameloblastyna stanowi ok. 5 10% wszystkich białek obecnych w szkliwie, będąc zarazem najobficiej występującą w międzykomórkowej macierzy szkliwa, spośród grupy białek o typie nieamelogeninowym [68]. Ameloblastyna jest syntetyzowana także w zębinie i cemencie, jednak jej rola w wymienionych tkankach nie jest ustalona. Ameloblastyna jest cząsteczką adhezji komórkowej wymaganą do utrzymania zróżnicowanego stanu ameloblastów [69]. Analizy bioinformatyczne i modelowanie molekularne struktury białka sugerują, że może ono należeć do IDPs [70], co potwierdziły widma CD rekombinowanego mysiego białka [71]. Tuftelina Tuftelina jest pierwszym scharakteryzowanym w szkliwie białkiem o typie nieamelogeninowym [72]. Synteza tego białka na wczesnym etapie rozwoju zęba sugeruje, że może ono być zaczątkiem kryształów, jednak synteza tego białka w nerkach, płucach, wątrobie i jądrach podważa tę hipotezę. Funkcja tego białka podczas mineralizacji szkliwa pozostaje nadal nieznana, jak również jego funkcje w innych tkankach. Niektóre doniesienia bazujące na badaniach oddziaływań pomiędzy białkami wskazują, jakoby tuftelina mogła pełnić funkcje na poziomie różnicowania się ameloblastów oraz/lub wydzielania macierzy organicznej [73]. Enamelina Enamelina jest największym z białek macierzy szkliwa (186 kda), stanowiącym mniej niż 5% wszystkich białek szkliwa. Jest absolutnie konieczna do poprawnego formowania się szkliwa [74]. W porównaniu do wysoce hydrofobowej amelogeniny, enamelina wykazuje hydrofilowy charakter. Podobnie jak inne białka macierzy, enamelina jest trawiona na mniejsze fragmenty, wobec których najbardziej konserwatywnym jest fragment 32 kda. Duża homologia w obrębie różnych gatunków wskazuje, że jest on ważny dla wypełniania funkcji biomineralizacyjnej [75]. Metaloproteinaza macierzy 20 (MMP-20) Wraz z białkami ameloblasty eksportują również metaloproteinazę macierzy 20 (MMP-20), która szybko tnie nowo wydzielane do macierzy białka na mniejsze fragmenty. Cienkie wstążki hydroksyapatytu, prawdopodobnie powstałego z prekursorowego amorficznego fosforanu wapnia, widoczne są w bliskości błony ameloblastów, gdzie wydzielane są białka macierzy i MMP-20. Te mineralne twory nie są rozmieszczone przypadkowo w nowo tworzonej warstwie szkliwa, ale są ukierunkowane tworząc przestrzenny, kompleksowy, trójwymiarowy wzorzec. W przypadku braku MMP-20 szkliwo jest cieńsze, części nieorganicznej jest mniej, za to więcej jest białek i wody [54,76]. Kalikreina 4 (KLK4) Główną funkcją kalikreiny 4 jest trawienie produktów proteolizy amelogeniny, ameloblastyny i innych białek, będących wynikiem aktywności MMP-20. Dzięki temu białka są łatwiej usuwane, a szkliwo staje się twardsze. W przypadku braku kalikreiny szkliwo zachowuje swą grubość oraz typową pryzmatyczną strukturę, ale obserwuje się opóźnienie w jego tworzeniu oraz defekty w mineralizacji na styku szkliwa i zębiny [76]. ZĘBINA Zębina dominuje ilościowo i tworzy oparcie dla pozostałych tkanek twardych zęba. Buduje większą część korony i korzenia zęba oraz odpowiada za jego kształt. Zębina jest podobna do kości. Odnosi się to głównie do składu macierzy organicznej. Mechanizmy regulujące mineralizację zębiny i kości są podobne. Różni je organizacja tkanek oraz charakter substancji inicjujących mineralizację. W odróżnieniu do kości, zębina nie jest przebudowywana i nie bierze udziału w regulacji metabolizmu wapnia i fosforanów. Tworzenie zęba zachodzi przez całą długość życia zęba [52]. Część organiczna tworzona jest w dużej mierze z kolagenu I, który stanowi około 92% składników organicznych. Poza kolagenem, obecna jest także grupa białek niekolagenowych, do których należą specyficzne dla zębiny fosfoforyny (DPP, ang. dentin phosphophoryn) oraz sjaloproteiny zębiny (DSP, ang. dentin sialoprotein). Ponadto w zębinie występują: bogata w kwas sjalowy osteopontyna, białka macierzy zębiny (DMP1, DMP2, DMP3, ang. dentin matrix protein), BSP, kwaśna glikoproteina kości-75, osteonektyna oraz białka bogate w kwas γ-karboksyglutaminowy. Wśród składników organicznych należy wymienić także proteoglikany, czynniki wzrostu, fosfolipidy oraz enzymy [77,78]. Nieorganiczne składniki zębiny stanowią około 70% masy tkanki, dzięki czemu zębina jest twardsza od kości. Masa pojedynczego kryształu hydroksyapatytu jest około 10 razy większa niż w kości, ale wielokrotnie mniejsza niż w szkliwie, a jego rozmiar to około 35x10x100 nm [79,80]. DPP oraz DSP DPP i DSP to białka, które są pochodną prekursorowej zębinowej sjalofosfoproteiny (DSPP). 75% sekwencji DSPP stanowią reszt Ser i Asp, a około 90% reszt Ser jest fosforylowanych. Ufosforylowane cząsteczki mają większą zdolność do wiązania jonów Ca 2+ i indukują wytwarzanie fosforanu wapnia o kształcie płytki (ang. plate-like), podczas gdy nieufosforylowane formy białka promują powstawanie postaci amorficznej [81]

8 DMP1 DMP1 było pierwszym białkiem wyizolowanym z macierzy zębiny, czemu zawdzięcza swoją nazwę [82]. W trakcie procesu mineralizacji zębiny podlega regulacji negatywnej i zupełnie zanika w momencie, gdy mineralizacja jest zakończona [83]. DMP1 zawiera wiele reszt serylowych, aspartylowych i glutamylowych. In vivo DMP1 ulega trawieniu na dwa peptydy, N-końcowy 37K oraz C-końcowy 57K. Co interesujące, ich nazwy biorą się nie z mas cząsteczkowych wynoszących odpowiednio 22,7 kda oraz 34 kda, ale obniżonej ruchliwości elektroforetycznej, co jest typowe dla IDPs [84]. Wydaje się, że fragment 57K odgrywa kluczową rolę w procesie biomineralizacji. Jego sekwencja zawiera dwie domeny wiążące kolagen, motyw RGD [22], sygnał lokalizacji jądrowej [85] oraz peptyd pełniący funkcję zaczątku kryształu [86]. Badania in vitro wykazały, że DMP1 jest zdolne do wiązania jonów wapnia oraz może zapoczątkowywać proces formowania się hydroksyapatytu. Proces ten jest wieloetapowy, a DMP1 może go zapoczątkować przez wiązanie jonów wapnia oraz inicjowanie odkładania się minerału. W pierwszym etapie pojawia się amorficzna postać fosforanu wapnia, który dojrzewając tworzy nanokryształy. Następnie kryształy te powiększają się i łączą w kryształy w skali mikro [7]. Podobnie jak większości innych białek obecnych w zębinie, DMP1 może również pełnić inne funkcje. Oprócz obecności w zmineralizowanej tkance, DMP1 jest syntetyzowane także w tkankach niezmineralizowanych, takich jak nerki, mózg, trzustka, ślinianki [87,88]. Badania dotyczące struktury białka DMP1 i jego fragmentów wykazały, że białko to wykazuje charakter IDPs, które pod wpływem jonów wapnia może ulegać delikatnej zmianie ku bardziej zorganizowanej strukturze, co może prowadzić do oligomeryzacji [7,89]. Proteoglikany Główne proteoglikany zębiny to dekoryna i biglikan, należące do rodziny małych proteoglikanów bogatych w leucynę, SLRP (ang. small leucine-reach proteoglycans). Dekoryna i biglikan zawierają w łańcuchu bocznym siarczan chondroityny natomiast lumikan i fibromodulina są bogate w keratosiarczan. Dowiedziono, że białkowy rdzeń proteoglikanów przyjmuje zwiniętą helikalnie konfigurację i wiąże się do mikrofibryli kolagenu. Ujemnie naładowane łańcuchy boczne i glikozaminoglikany oddziałują między sobą tworząc mostki wewnątrzfibrylarne, które wiążą wodę, zwiększając przestrzeń pomiędzy włóknami i regulując mechaniczne właściwości macierzy kolagenowej [77,90]. CEMENT Cement jest kolejnym rodzajem tkanki zmineralizowanej, chroniącej zębinę korzenia zęba bardzo cienką warstwą. Pod wieloma względami jest bardzo wyjątkowy: nie jest unaczyniony i nie jest unerwiony, nie ulega ciągłemu przemodelowywaniu jak kość, ale przez cały czas przyrasta. W odróżnieniu od szkliwa i zębiny, gdzie widoczne są różnice w obecności białek charakterystycznych dla obu tkanek oraz czynników regulujących ich funkcje, w porównaniu do kości w cemencie nie są syntetyzowane charakterystyczne dla tej tkanki białka. Wydaje się, że posiada on składniki wspólne z kością, a jego rozwój może być kontrolowany przez podobne czynniki. Według klasycznego podziału wyróżnia się cement komórkowy i bezkomórkowy, z uwagi na obecność cementocytów w jego strukturze. Budową i składem cement w dużym stopniu przypomina tkankę kostną. Składniki nieorganiczne stanowią ok. 65% masy tkanki i składają się głównie z kryształów hydroksyapatytu [91-93]. Cement jest tkanką mniej zmineralizowaną niż zębina pochodząca z tego samego zęba. Ma przez to większą zdolność wiązania fluorków oraz dużo łatwiej może ulegać odwapnieniu przez obecność czynników chelatujących [92]. Zawartość fluorków w cemencie jest nieco wyższa niż w innych zmineralizowanych tkankach (do około 0,9%). Natomiast zawartość magnezu wynosi od 0,5 do 0,9%, około połowę mniej niż w zębinie. Macierz organiczna cementu zbudowana jest głównie z kolagenu. Kolagen typu I pełni rolę strukturalną i morfogeniczną oraz zapewnia rusztowanie dla kryształów. Stanowi on około 90% wszystkich kolagenów [92,93]. Cement zawiera również białka niekolagenowe: sjaloproteinę kości oraz osteopontynę. Uznaje się, że te dwa białka biorą udział w różnicowaniu cementoblastów. Sjaloproteina kości może przylegać do powierzchni komórek korzenia i inicjować mineralizację. Osteopontyna reguluje migrację komórek, różnicowanie się oraz przetrwanie przez łączenie z integrynami, a także uczestniczy w reakcji zapalnej poprzez regulację aktywacji monocytów do makrofagów, fagocytozy oraz produkcji tlenku azotu [94]. Fibronektyna, osteonektyna, osteokalcyna i laminina są kolejnymi składnikami macierzy cementu. Proteoglikany, małe peptydy szeroko rozpowszechnione u ssaków, również są obecne w cemencie. Analiza biochemiczna ekstraktu cementu ludzkich zębów zidentyfikowała siarczan chondroityny, siarczan dermatanu, kwas hialuronowy, których rozmieszczenie jest inne od tego w tkankach miękkich. Zawartość proteoglikanów w tkance zmineralizowanej jest niska. Różnice te mogą wynikać z funkcji pełnionej przez nie w tkankach miękkich, gdzie hamują mineralizację kolagenu, wypełniając przestrzenie, które w tkance zmineralizowanej zostałyby wypełnione przez hydroksyapatyt. W cemencie obecna jest także fosfataza zasadowa i kilka białkowych czynników wzrostu, przede wszystkim czynnik wzrostu pochodzenia cementowego (ang. cementum-derived growth factor). Skład cementu jest bardziej zbliżony do składu kości niż zębiny [92,93]. Więcej informacji o roli białek w procesie biomineralizacji cementu można znaleźć w pracy Arzate i wsp. [95]. OTOLITY I OTOKONIA Otolity ryb i otokonia wyższych kręgowców nazywane popularnie kamyczkami usznymi są minerałami węglanu wapnia służącymi jako czujnik grawitacji. Stanowią one część narządu otolitowego (ang. otolithic end organ), który jest błoniastym workiem usytuowanym u podstawy kanałów półkolistych, w przedsionku błędnika kostnego (Ryc. 3A). W zależności od organizmu, w przedsionku mogą znajdo- Postępy Biochemii 61 (4)

9 Rycina 3. Schemat budowy ucha wewnętrznego. (A) Ucho wewnętrzne ssaków. Na podstawie [98]. (B) Przekrój poprzeczny narządu otolitowego ryby. Na podstawie [131]. wać się 2 narządy otolitowe (woreczek i łagiewka u ssaków) lub 3 narządy otolitowe (woreczek, łagiewka i buteleczka u pozostałych kręgowców). Każdy narząd otolitowy zbudowany jest z nabłonka czuciowego (ang. sensory epithelium), wyposażonego w mechanoreceptorowe komórki rzęskowe (ang. hair cells), błony otolitycznej (ang. otolithic membrane), utrzymującej otolit w pobliżu nabłonka oraz otolitu (lub otokonii w przypadku wyższych kręgowców) (Ryc. 3B). Narząd otolitowy wypełniony jest endolimfą, do której wydzielane są jony i makrocząsteczki niezbędne do wzrostu i funkcjonowania otolitu. Zasada działania narządu otolitowego jest podobna do działania kanałów półkolistych. Zmiana pozycji głowy względem siły grawitacji powoduje przesunięcie kryształów i uciskanie nabłonka czuciowego. Ugięcie rzęsek znajdujących się w apikalnej części komórek rzęskowych powoduje otwarcie kanałów wapniowych i uruchomienie kaskady przekazywania sygnałów. U ryb otolity są dodatkowo zaangażowane w odbieranie bodźców dźwiękowych, na podobnej zasadzie [96-98]. Otolity i otokonia są analogami funkcjonalnymi, różnią się jednak pod względem morfologii, struktury i składu makrocząsteczkowego. Otolit jest pojedynczym kryształem węglanu wapnia, występującym najczęściej w formie aragonitu, rzadziej waterytu. Jego morfologia zależy od gatunku ryby i rodzaju narządu otolitowego. Struktury te rosną przez całe życie, tworząc charakterystyczne strefy (ang. ring-like structures) nazywane przyrostami dobowymi lub pierścieniami dobowymi (Ryc. 2B) [97]. Otokonia natomiast przyjmują postać małych, kalcytowych (czasem hydroksyapatytowych) kryształów o beczkowatym kształcie z trójściennymi zakończeniami (ang. barrel-shaped with triplanar facets at each end), zanurzonych w galeretowatej sieci substancji organicznych. Otokonia powstają w fazie embrionalnej, nie tworzą przyrostów dobowych i pozostają niezmienione przez całe życie organizmu. Z wiekiem otokonia i macierz, w której są zanurzone mogą ulegać degeneracji. W stanach patologicznych otokonia mogą przemieszczać się do kanałów półkolistych wywołując zawroty głowy, które są klasyfikowane jako jednostka chorobowa (ang. benign paroxysmal positional vertigo). U człowieka otokonia są jedynymi minerałami zbudowanymi z węglanu wapnia i nie uczestniczą w procesie słyszenia [8]. Przyczyny różnic w budowie tych narządów do teraz nie zostały poznane, sugeruje się, że częściowo wynikają one z ich funkcji [97]. Wydaje się, że różnice w morfologii i odmianie polimorficznej otolitów i otokonii różnych organizmów oraz różnych organów otolitowych mają związek z różnicami w składzie makrocząsteczkowym macierzy [99]. STARMAKER Jednym ze składników macierzy zewnątrzkomórkowej otolitu jest białko Starmaker, zidentyfikowane u rybki akwariowej danio pręgowanego (Danio rerio). Söllner i wsp. [9] pokazali, że obecność tego białka jest konieczna w morfogenezie otolitu. Nokaut genu białka Starmaker powoduje zmiany sieci krystalicznej i morfologii otolitu. Starmaker jest kwaśnym, hydrofilowym białkiem kontrolującym rozmiar, kształt i odmianę polimorficzną powstających kryształów [9], posiada wiele potencjalnych miejsc fosforylacji, która jest istotna dla jego aktywności biomineralizacyjnej [13]. Badania strukturalne pokazały, że Starmaker ma wydłużony kształt (ang. rod-shaped) i należy do IDPs, co potwierdzono między innymi przy pomocy dichroizmu kołowego i ultrawirowania analitycznego [10,11]. Pokazano też, że Starmaker może posiadać szczątkowe struktury drugorzędowe [10]. Pod wpływem kationów Na +, Ca 2+ i Mg 2+ Starmaker kurczy się, prawdopodobnie dzięki zmniejszeniu odpychania wewnątrzcząsteczkowego, wynikającego z wysokiego ładunku ujemnego cząsteczki. Efekt ten jest najsilniejszy dla jonów Ca 2+, które są przypuszczalnie naturalnym ligandem tego białka [11]. Podczas eksperymentów biomineralizacji in vitro prowadzonych w obecności białka Starmaker zaobserwowano obecność amorficznej formy węglanu wapnia i/lub PILP. Sugeruje się, że nieuporządkowana struktura białka Starmaker, w szczególności wydłużenie łańcucha głównego i lepszy dostęp naładowanych grup łańcuchów bocznych, ułatwia tworzenie amorficznych form, które następnie przechodzą w uporządkowaną formę krystaliczną [13]. STARMAKER-LIKE Domniemanym homologiem białka Starmaker jest zidentyfikowane u ryżanki japońskiej (Oryzias latipes) mniejsze białko Starmaker-like [100]. Podobnie jak Starmaker, białko to jest silnie kwaśne, a badania strukturalne pokazują, że należy ono do klasy IDPs. Pokazano, że Starmaker-like po

10 siada aktywność biomineralizacyjną [16]. Wpływ tego białka na mineralizację węglanu wapnia in vitro przedstawia rycina 4. W nieobecności białka powstają romboedryczne kryształy (Ryc. 4A), natomiast te uzyskiwane w obecności białka wyróżniają się schodkową strukturą oraz posiadają charakterystyczne zaokrąglenia (Ryc. 4B). Kryształy otrzymywane w obecności białka są mniejsze, co widać na rycinie 4B, a ich liczba jest znacząco większa. Oznacza to, że Starmaker-like wpływa na rozmiar, kształt i ilość powstających kryształów węglanu wapnia. Ponadto działa hamująco na wzrost kryształów. Podejrzewa się, że może stanowić matrycę dla odkładających się jonów [16]. proteoglikany siarczanu keratanu, α-tektorynę, fetuinę A, osteopontynę, sparc, sparc-like 1 i DMP1[98]. Otokonina 90 Otokonina 90 jest niezbędna w tworzeniu macierzy otokonii i otolitów, dzięki zdolności rekrutacji jonów wapnia i białek, w tym otoliny 1. Otokonina 90 jest głównym białkiem macierzy otokonii ptaków i ssaków, stanowi 90% wszystkich białek otokonii [8,102]. Otokonina 90 jest białkiem ekstremalnie kwaśnym, a także glikozylowanym. Jest ona bogata w reszty Cys, dzięki którym jest zdolna do tworzenia wielu mostków dwusiarczkowych i rusztowania dla kryształu. Otokonina 90 ułatwia nukleację i wzrost kryształów, a obniżenie poziomu translacji mrna tego białka u danio pręgowanego skutkuje powstaniem anomalnych otolitów lub całkowitym brakiem wykształcenia tych struktur, co sugeruje, że białko to jest kluczowe w początkowych etapach tworzenia otolitu [8,98,102,103] Rycina 4. Wpływ białka Starmaker-like na mineralizację węglanu wapnia in vitro. (A) Kryształy kontrolne, otrzymane w nieobecności białka (B) Kryształy uzyskane w obecności 50 μg/ml białka Starmaker-like. Testy krystalizacyjne wykonano w obecności 10 mm CaCl 2 zgodnie z procedurą opisaną przez Różycką i wsp. [16]. Kryształy obserwowane przy pomocy skaningowego mikroskopu elektronowego, zaznaczona na zdjęciach skala odpowiada 10 μm. Zdjęcia wykonano za pomocą mikroskopu skaningowego JEOL JSM-7500F (JEOL Ltd.). Zdjęcia niepublikowane. Sparc-like 1 BIAŁKO MACIERZY OTOLITÓW-64 Przypuszczalnym ortologiem białka Starmaker jest również białko macierzy otolitów-64 (OMM-64, ang. otolith matrix macromolecule-64) z pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss). Budowa genu obu białek jest podobna, a identyczność sekwencji wynosi 25%. Podobnie jak Starmaker, OMM-64 jest białkiem kwaśnym, posiadającym wiele potencjalnych miejsc fosforylacji. Chociaż w sekwencji OMM-64 nie znaleziono żadnego klasycznego motywu wiążącego jony wapnia, pokazano, że obszar bogaty w reszty kwasu glutaminowego ma taką aktywność, co może być kluczowe dla jego aktywność biomineralizacyjnej [14]. OMM-64 występuje w otolicie jako część wysokocząsteczkowych agregatów białkowych, które wpływają na morfologię i odmianę polimorficzną węglanu wapnia in vitro. W skład agregatów wchodzi również białko kolagenowe, otolina-1 oraz glikozaminoglikany siarczanu heparanu, jednakże rola poszczególnych składników, ich właściwości strukturalne oraz interakcje między nimi nie zostały dotychczas poznane [101]. Przypuszcza się, że OMM- 64 również wykazuje cechy białek IDPs. OTOKONINY Białka otokonii określane są wspólnie, jako otokoniny. Część z nich występuje zarówno w otokoniach jak i w otolitach. Wiele z nich posiada zdolność wiązania jonów wapnia i jest kluczowa dla krystalizacji CaCO 3. Do tej pory u myszy zidentyfikowano kilka otokonin: otokoninę 90, otolinę-1, Białko sparc like 1 (ang. secreted protein acidic and rich in cysteine), podobnie jak otokonina 90, jest kwaśną glikoproteiną bogatą w reszty Cys, tworzącą prawdopodobnie rusztowanie dla odkładanego minerału. Sparc-like 1 posiada klasyczny motyw EF wiązania jonów wapnia a także region sparc, który składa się z domeny podobnej do folistatyny (ang. folistatin-like), domeny wiążącej kolagen i dwóch domen EF [104]. Ponadto N-końcowy elastyczny fragment tego białka najprawdopodobniej również wiąże jony Ca 2+. W nieobecności otokoniny 90 powstają otokonia o znacząco wyższej zawartości białka sparc-like 1, co wskazuje na efekt kompensujący. Sugeruje się, że oba białka pomimo braku znaczącego podobieństwa sekwencji, mogą służyć jako macierz otokonii promująca zwapnianie [105]. Dokładna rola sparc-like 1 nie została jednak wciąż poznana [98]. Otolina-1 Otolina-1 jest glikoproteiną należącą do rodziny kolagenu X oraz nadrodziny C1q. Posiada ona trzy domeny podobne do kolagenu i globularną domenę C1q, prawdopodobnie odpowiadającą za oddziaływania z różnymi białkami. Oba typy domen oddziałują z otokoniną 90 tworząc macierz otokonii i wiążąc jony wapnia. Obecność otoliny-1 ryb jest konieczna dla prawidłowego umocowania otolitu w pobliżu nabłonka czuciowego (Ryc. 3B) [106]. Ponadto dzięki kolagenowej domenie otolina-1 tworzy prawdopodobnie rusztowanie dla tworzącego się kryształu. Badania in vitro wykazały, że otokonina 90 wymaga obecności otoliny-1, Postępy Biochemii 61 (4)

11 aby formować kryształy o morfologii zbliżonej do otokonii [107]. PROTEOGLIKANY SIARCZANU KERATANU W macierzy zewnątrzkomórkowej i na powierzchni komórek często obecne są proteoglikany siarczanu keratanu. Składają się one z rdzenia białkowego i kowalencyjnie przyłączonego łańcucha glikozaminoglikanów. Proteoglikany mogą tworzyć większe kompleksy oddziałując z innymi proteoglikanami i kolagenem; mają one wysoki ładunek ujemny i mogą przyciągać przeciwnie naładowane jony, w tym Ca 2+. Pokazano, że oddziałują one z otokoniną 90 i otoliną 1, jednak ich rola w formowaniu otolitów i otokonii nie została poznana [98,108]. Wzrost otolitów i otokonii jest również kontrolowany przez szereg białek i czynników niewbudowujących się w kryształ. Te czynniki są kluczowe dla zapewnienia odpowiedniego środowiska nukleacji i wzrostu kryształów. Wpływają one na wydzielanie i modyfikacje otokonin i innych makrocząsteczek oraz tworzenie odpowiednich gradientów jonowych. Do tych białek należą między innymi: oksydaza Nox3, otopetryna-1, PMCA2, pendryna, anhydraza węglanowa. Kilka białek, których syntezę zaobserwowano w uchu wewnętrznym ryb bierze również udział w tworzeniu kości i zębów u myszy. Wśród nich są białka należące do rodziny SIBLING takie jak osteopontyna oraz kwaśna fosfoproteina macierzy zębiny 1 (ang. dentin matrix acidic phosphoprotein 1). Nieobecność wspomnianej fosfoproteiny u myszy skutkuje zarówno defektami kości, jak i zaburzeniami równowagi [8,98,108]. HIERARCHICZNA STRUKTURA OTOLITU Kryształy powstające pod kontrolą biologiczną charakteryzują się precyzją kształtu i formy, co przejawia się w szczególności w ich hierarchicznej budowie. Chociaż obecność przyrostów dobowych w strukturze otolitu jest intensywnie badana od lat 70-tych, to ich budowa w skali nano nie została jeszcze dokładnie poznana. Li i wsp. [109] badali strukturę otolitów karpia w skali nanometrowej. Podstawową jednostką strukturalną są nanokryształy aragonitu, które rosną wzdłuż osi c tworząc nanowłókna aragonitowe. Włókna te łączą się w określonym porządku, tworząc strukturę warstwową (ang. fibril arrays). Nagromadzenie i wzrost kolejnych warstw tworzy trójwymiarową strukturę, stanowiącą kolejny poziom organizacji 3D (ang. three dimensional stick). Setki takich struktur ustawia się w jednakowej orientacji, aby stworzyć domenę. Domeny tworzą określony wzór (ang. domain arrays), który w całości znajduje się w strefie jednego przyrostu dobowego. Ostatnim poziomem organizacji są obserwowane w mikroskopie strefy przyrostu, ich szerokość wynosi 1 2 μm. W zależności od otolitu, poziom organizacji struktury może być mniej złożony, na przykład w woreczku (ang. sagitta) karpia włókna aragonitowe tworzą bezpośrednio dzienne strefy przyrostu [25]. Obecność przyrostów dobowych przypisywana jest różnicom w proporcji frakcji nieorganicznej i organicznej w poszczególnych obszarach kryształu, co jest związane z cykliczną zmianą aktywności metabolicznej komórek narządu otolitycznego. Analiza ilości i szerokości przyrostów daje informację na temat wieku ryby, tempa jej wzrostu, środowiska życia czy też wędrówek [25]. SZKIELETY ZEWNĘTRZNE BEZKRĘGOWCÓW Mięczaki oraz stawonogi (głównie skorupiaki) są przedstawicielami bezkręgowców, których szkielety zewnętrzne (muszle oraz pancerze) są zbudowane ze zmineralizowanego węglanu wapnia. Komórki ektodermy skorupiaków oraz larw mięczaków, a także wykształcony nabłonek form dorosłych odpowiedzialne są za wydzielanie składników tworzących macierz organiczną oraz mineralizację twardego szkieletu zewnętrznego [110]. MUSZLE MIĘCZAKÓW Muszlowce, czyli mięczaki charakteryzujące się obecnością szkieletu zewnętrznego w postaci muszli, stanowią jeden z najlepiej poznanych systemów wytwarzania biominerałów. Faza mineralna w postaci węglanu wapnia stanowi aż 95 99% całkowitej masy muszli, podczas gdy pozostałe 1 5% pochodzi od macierzy organicznej. Muszle wykazują strukturę warstwową, złożoną zazwyczaj z dwóch lub trzech wewnętrznych warstw węglanu wapnia oraz tzw. mikrostruktur i zewnętrznej warstwy organicznej składającej się głównie z białek i polisacharydów. Warstwy wewnętrzne, nazwane odpowiednio warstwą perłową (ang. nacre) oraz porcelanową lub pryzmatyczną (ang. prismatic), są zbudowane z węglanu wapnia w formie kalcytu lub aragonitu, w zależności od gatunku [111]. Co ciekawe, obie odmiany polimorficzne mogą występować jednocześnie, tak jak ma to miejsce w muszli omułka jadalnego (Mytilus edulis), gdzie warstwę perłową tworzy aragonit, a warstwę porcelanową kalcyt [112]. Masa perłowa, zawierająca niewielką ilość frakcji organicznej, wykazuje znacznie większą odporność na pękanie w porównaniu do otrzymanego w wyniku chemicznego strącania aragonitu, dlatego też stanowi ona interesujący obiekt badawczy dla naukowców z dziedziny inżynierii materiałowej, stomatologii, ortopedii oraz nanotechnologii. Coraz więcej wiadomo na temat biał- Rycina 5. Zależność masy cząsteczkowej białek muszli mięczaków oraz ich punktów izoelektrycznych. Teoretyczne masy białek od ich wartości pi zostały obliczone z wykorzystaniem programu ProtParam dostępnego na stronie Czarne romby odpowiadają białkom znajdującym się we frakcji kalcytowej muszli, otwarte kółka białkom z frakcji aragonitowej, natomiast gwiazdka odpowiada białku N66, które znajduje się zarówno we frakcji kalcytowej jak i aragonitowej. Strzałkami wskazano opisane w niniejszym artykule białka: aspeinę, perlucynę oraz lustrynę A. Wykres zbudowano w oparciu o dane z pracy [111]

12 kowych składników macierzy organicznej, które odpowiedzialne są za tak ważne funkcje jak formowanie przejściowych postaci amorficznych, a następnie ich krystalizację, wybór odpowiedniej formy polimorficznej (kalcytu bądź aragonitu), a także organizację fazy krystalicznej w złożone mikrostruktury [111]. Wykres korelujący teoretyczną masę (bez peptydu sygnałowego) wszystkich poznanych białek z muszli mięczaków oraz ich teoretyczną wartość punktu izoelektrycznego (Ryc. 5) pozwala zwrócić uwagę na fakt, iż występujące w warstwach kalcytowych muszli białka charakteryzują się skrajnymi wartościami pi (bardzo kwaśnymi lub bardzo zasadowymi), podczas gdy białka wyizolowane z warstw aragonitu posiadają pi bardziej neutralne. Takie rozmieszczenie makrocząsteczek w odpowiednich warstwach muszli wydaje się bardzo intrygujące, jednak jego przyczyny do dziś pozostają nieznane [111]. Aspeina Aspeina wyizolowana z kalcytowej warstwy pryzmatycznej ostrygi z gatunku Pinctada fucata jest najbardziej kwaśnym białkiem ze wszystkich dotąd poznanych białek zaangażowanych w proces biomineralizacji muszli mięczaków. Sekwencja tego białka charakteryzuje się obecnością aż 58 bloków poli-asp o długości od 2 do 10 reszt aminokwasowych przeplatanych motywami Ser-Gly. Przeprowadzone analizy bioinformatyczne oraz niezwykle kwaśny charakter aspeiny sugerują, że białko to należy do grupy IDPs [18]. Badania ekspresji genu kodującego aspeinę wykazały, że białko to ulega produkcji tylko w obrębie zewnętrznej krawędzi płaszcza muszli, która odpowiada pryzmatycznej warstwie kalcytowej. We wczesnych etapach rozwoju, gdy powstająca muszla zbudowana jest jeszcze z węglanu wapnia w postaci amorficznej, synteza aspeiny jest zahamowana [113]. Najwyższy poziom syntezy obserwuje się natomiast w początkowych etapach mineralizacji kalcytu. Eksperymenty przeprowadzone in vitro wykazały, że aspeina potrafi zapoczątkowywać mineralizację kalcytu w roztworze o wysokiej zawartości jonów magnezu. Wyniki te wyraźnie wskazują na zaangażowanie aspeiny w mineralizację fazy kalcytowej nawet w warunkach promujących powstawanie aragonitu, przypominających warunki panujące w płynie zewnątrzpłaszczowym mięczaków morskich [114]. Perlucyna Perlucyna jest przykładem białka o obojętnym charakterze wyizolowanym z aragonitowej warstwy perłowej słuchotka z gatunku Haliotis laevigata. Białko to, ulegające N-glikozylacji na jednej reszcie Asn, należy do rodziny lektyn typu C. Struktura tego białka jak dotąd nie została scharakteryzowana. Dzięki obecności domeny rozpoznającej węglowodany, perlucyna wykazuje zależną od jonów wapnia aktywność wiązania cukrów, przede wszystkim galaktozy oraz mannozy [115]. Badania przeprowadzone in vitro wykazały, że białko zaangażowane jest w promowanie powstawania kryształów węglanu wapnia, a analizy z wykorzystaniem techniki AFM potwierdziły przyspieszające działanie perlucyny podczas tworzenia warstw CaCO 3 na powierzchni kryształów kalcytu [116]. Wysokorozdzielcza rentgenowska dyfraktometria proszkowa ujawniła ponadto zdolność rekombinowanej perlucyny do wnikania do wnętrza kryształów węglanu wapnia otrzymanych in vitro [117]. Lustryna A Spośród wszystkich białek wyizolowanych z muszli mięczaków, lustryna A jest jedynym przykładem, dla którego udało się ustalić wyraźny związek pomiędzy sekwencją aminokwasową, a właściwościami mechanicznymi biominerału. Lustryna A jest nierozpuszczalnym białkiem zasadowym zidentyfikowanym w aragonitowej warstwie perłowej słuchotka Haliotis rufescens. Sekwencja tego białka zawiera kolejno 9 podjednostek bogatych w reszty Cys przeplatanych podjednostkami bogatymi w reszty Pro, po których następuje długa podjednostka bogata w reszty Gly i Ser, krótka domena bogata w reszty Asp, ponownie podjednostka bogata w reszty Cys, krótka domena zasadowa i wreszcie C-końcowa domena zawierająca 4 mostki dwusiarczkowe. Badania AFM własności mechanicznych warstwy perłowej pokazały, że blaszkowata macierz wewnętrzna zawierająca lustrynę A wykazuje piłokształtny odwracalny przebieg krzywej zależności opisującej odporność mechaniczną od przyłożonej siły, co można wyjaśnić domenową budową białka. Takie zachowanie może być wyjaśnione stopniowym rozciąganiem sprężystych modułów białka bogatych w reszty Cys, oddzielonych od siebie przekładkami podjednostek bogatych w reszty Pro, w miarę wzrastającej siły rozciągającej [118]. Co więcej, mimo, że lustryna A przyjmuje dobrze zdefiniowaną strukturę drugorzędową, analiza NMR ujawniła obecność pętli zawierającej reszty Gly-Ser, co dodatkowo zwiększa jej elastyczność. Z kolei, znajdująca się na końcu karboksylowym zasadowa domena może oddziaływać z innymi cząsteczkami, a krótka kwaśna domena bogata w reszty Asp może być odpowiedzialna za oddziaływania lustryny A z powierzchnią kryształu [119]. SZKIELETY ZEWNĘTRZNE SKORUPIAKÓW Większość skorupiaków posiada wapienny szkielet zewnętrzny, który wraz ze wzrostem organizmu ulega okresowej wymianie. Dlatego też metabolizm wapnia u skorupiaków jest ściśle powiązany z sezonowymi cyklami linienia. Wodni przedstawiciele tej grupy czerpią wapń z wody, podczas gdy skorupiaki lądowe opracowały kilka strategii umożliwiających przechowywanie nagromadzonego wapnia. W zależności od gatunku wapń może być magazynowany w hemolimfie, gruczole wątrobowo-trzustkowym, płytkach brzusznych, gastrolitach lub tylnej części jelita. Po wylince, zmagazynowany wapń jest wchłaniany i wykorzystywany do utwardzenia nowo powstałego szkieletu zewnętrznego. Pancerze skorupiaków zbudowane są z węglanu wapnia oraz rusztowania złożonego z chityny oraz białek [120]. Związany z mineralizacją peptyd 1 Analizując skład szkieletu zewnętrznego raka luizjańskiego (Procambrus clarkii), naukowcy natknęli się na krótkie białko złożone z 78 reszt aminokwasowych, które nazwano związanym z mineralizacją peptydem 1 (CAP-1, ang. calcification associated peptide 1) [121]. Jest to białko o silnie kwa- Postępy Biochemii 61 (4)

13 śnym charakterze zawierające w sekwencji resztę fosfoseryny niezbędną do hamowania precypitacji węglanu wapnia oraz wiązania jonów wapnia. CAP-1 można podzielić na dwa regiony: uporządkowany N-końcowy oraz C-końcowy przyjmujący postać nieuporządkowaną. Badania in vitro pokazały, że region C-końcowy wykazywał większą aktywność hamującą wzrost kryształów CaCO 3 niż region N-końcowy, prawdopodobnie spowodowaną większą elastycznością C-końca CAP-1 [121]. Białko macierzy gastrolitów Kolejnym białkiem wyizolowanym tym razem z gastrolitów raka luizjańskiego jest nierozpuszczalne białko nazwane białkiem macierzy gastrolitów. Białko to, silnie związane z chityną gastrolitu, bogate jest w reszty Gln, Asp oraz Ala, a występujące w nim powtórzenia sekwencji 10 aminokwasów przypominają inwolukrynę, białko występujące w keratynocytach kręgowców [110]. Białko macierzy gastrolitów nie wiąże jonów wapnia, ale w znaczny sposób obniża precypitację węglanu wapnia in vitro. Badania ekspresji genu kodującego białko macierzy gastrolitów wykazały, że gen ten ulega ekspresji tylko w fazie przed linieniem, a dodanie hormonu 20-hydroksyekdyzonu znacznie zwiększa jego ekspresję [120]. SZKIELETY WEWNĘTRZNE BEZKRĘGOWCÓW Szkarłupnie posiadają sztywny szkielet wewnętrzny zbudowany z węglanu wapnia w postaci kalcytu oraz niewielkiej ilości białek macierzy organicznej. Badania prowadzone na szkarłupniach, w szczególności synteza szkieletu wewnętrznego spikuli embrionów jeżowców, dostarczyły wielu cennych informacji dotyczących molekularnego mechanizmu leżącego u podstaw biomineralizacji u bezkręgowców [110]. Czynniki środowiskowe takie jak temperatura i ph wody wywierają istotny wpływ na szkielety bezkręgowców [122]. Jeżowce Możliwość obserwacji mikroskopowej formowania szkieletu wewnętrznego larwy jeżowców w czasie rzeczywistym uczyniła z nich organizm modelowy do badania mechanizmu procesu biomineralizacji. Badania prowadzone nad charakterystyką spikuli embrionów jeżowców pokazały, że struktury te zawierają białek oraz że zbudowane są z uwodnionego amorficznego węglanu wapnia, który następnie przekształcany jest do bezwodnej formy amorficznej i ostatecznie do kalcytu [123]. Białka macierzy spikuli są syntetyzowane i wydzielane przez komórki mezenchymy pierwotnej, odpowiedzialne również za gromadzenie jonów wapnia oraz wydzielanie węglanu wapnia podczas tworzenia igieł [124]. Białko macierzy spikuli SM50 SM50, zidentyfikowane u jeżowca z gatunku Strongylocentrotus purpuratus, zaangażowane jest w odkładanie kryształów kalcytu oraz wydłużanie spikuli. Jak większość białek macierzy spikuli, posiada domenę lektyny typu C [110]. Na końcu karboksylowym białka obecne są dwa regiony nieuporządkowane. Pierwszy zawiera sekwencje powtarzane Gly-Val-Gly-Gly-Arg oraz Gly-Met- -Gly-Gly-Gln, które wykazują homologię do sekwencji występującej w elastynie. Analiza NMR tego fragmentu wykazała, że przyjmuje on strukturę bardzo rozciągniętej harmonijki β, dzięki czemu C-koniec SM50 może brać udział w tworzeniu macierzy organicznej biominerału, a także wiązać się z powierzchnią kryształu. Drugi, jeszcze bardziej rozciągnięty i elastyczny fragment zawierający powtórzenia Pro-Asn-Asn-Pro prawdopodobnie bierze udział w oddziaływaniach białko białko oraz białko kryształ [18,124] Białko macierzy spikuli PM27 PM27 jest białkiem zasadowym, posiadającym domenę lektyny typu C, wyizolowanym z jeżowca Strongylocentrotus purpuratus. Zawiera motyw powtarzającej się sekwencji Pro-Gly-Met-Gly, który wykazuje właściwości regionów nieuporządkowanych, dzięki czemu białko to może oscylować pomiędzy różnymi stanami konformacyjnymi [18]. Analiza wykorzystująca technikę barwienia immunocytochemicznego embrionów jeżowca wykazała, że białko zlokalizowane jest w pobliżu oraz na powierzchni spikuli, jednak rola PM27 w procesie biomineralizacji jak dotąd nie została poznana [110]. PODSUMOWANIE Dzięki połączeniu twardych i kruchych substancji mineralnych z makrocząsteczkami biologicznymi mogą powstawać struktury kompozytowe o właściwościach mechanicznych dostosowanych do specyficznych potrzeb żywego organizmu. Należą do nich między innymi kości, które są zdolne do utrzymania organizmu w pozycji pionowej, lecz jednocześnie wykazują się plastycznością i odpornością na kruszenie, zęby, które umożliwiają rozdrabnianie pokarmu i walkę o przetrwanie oraz muszle, które zapewniają mięczakom ochronę przed drapieżnikami. W procesie biomineralizacji makrocząsteczki mogą pełnić trzy zasadnicze funkcje. Kolagen, chityna i proteoglikany zapewniają rusztowanie i określają kształt tkanki twardej. Białka regulujące proces biomineralizacji, w szczególności silnie naładowane o strukturze nieuporządkowanej (IDPs), pozwalają na dostosowanie właściwości mechanicznych i nanostruktury biominerału do specyficznych wymogów stawianych danej tkance. Wreszcie, enzymy takie jak fosfatazy czy anhydraza węglanowa oraz kanały i pompy jonowe dostarczają nieorganicznego budulca. Mimo, że ich funkcja w procesie biomineralizacji bywa niedoceniana, to na przykładzie kości widać jak ważną rolę odgrywają podczas wytwarzania tkanek twardych. W naszym przeglądzie skupiliśmy się na molekularnych podstawach procesu biomineralizacji, szczególnie na udziale białek, w tym inherentnie nieuporządkowanych. Praca ta nie obejmuje szczegółowo ciekawych zagadnień związanych z udziałem lipidów, czynników transkrypcyjnych czy czynników wzrostu, o których można przeczytać w innych pracach przeglądowych [50,125]

14 Analizując wyniki badań prowadzonych szczególnie intensywnie w czasie ostatnich kilkunastu lat można zauważyć, że szczególnie rozpowszechnioną cechą białek wpływających na procesy biomineralizacji jest silne nieuporządkowanie struktury oraz duża zawartość aminokwasów naładowanych. Dzięki temu, białka te mogą wiązać jony i zagęszczać je, co prowadzi do kontrolowanego wzrostu biominerału. Nieuporządkowanie pozwala również na zwiększenie elastyczności w oddziaływaniach między składnikami tkanki twardej. Mimo wielu badań, biominerały kryją przed badaczami jeszcze wiele tajemnic. Badanie tych struktur i mechanizmów ich powstawania pozwoli na poszerzenie wiedzy i zrozumienie procesów patologicznych związanych z nieprawidłową biomineralizacją. Ważnym źródłem wiedzy o mechanizmie biomineralizacji są eksperymenty prowadzone in vitro zarówno w układach syntetycznych (roztwory, hydrożele) [126,127], jak i pochodzenia naturalnego (demineralizowane macierze organiczne zębiny, kości i innych tkanek) [99, ]. Uzyskana wiedza jest wykorzystywana do projektowania i otrzymywania materiałów imitujących naturalne, które już dziś umożliwiają normalne funkcjonowanie osobom z wrodzonymi lub nabytymi wadami tkanek twardych. PIŚMIENNICTWO 1. Gower LB (2008) Biomimetic model systems for investigating the amorphous precursor pathway and its role in biomineralization. Chem Rev 108: Skinner HCW, Jahren AH (2007) 8.04 Biomineralization. w: Holland HD, Turekian KK (eds) Treatise on Geochemistry. Pergamon, Oxford, str Elliott JC (2002) Calcium Phosphate Biominerals. Rev Mineral Geochem 48: Olszta MJ, Cheng X, Jee SS, Kumar R, Kim Y, Kaufman MJ, Douglas EP, Gower LB (2007) Bone structure and formation: A new perspective. Mat Sci Eng R 58: Pina S, Oliveira JM, Reis RL (2015) Natural-Based Nanocomposites for Bone Tissue Engineering and Regenerative Medicine: A Review. Adv Mater 27: Zhao J, Liu Y, Sun W, Zhang H (2011) Amorphous calcium phosphate and its application in dentistry. Chem Cent J 5: He G, Dahl T, Veis A, George A (2003) Nucleation of apatite crystals in vitro by self-assembled dentin matrix protein 1. Mat Mater 2: Kawasaki K, Buchanan AV, Weiss KM (2009) Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annu Rev Genet 43: Söllner C, Burghammer M, Busch-Nentwich E, Berger J, Schwarz H, Riekel C, Nicolson T (2003) Control of crystal size and lattice formation by starmaker in otolith biomineralization. Science 302: Kapłon TM, Rymarczyk G, Nocula-Ługowska M, Jakób M, Kochman M, Lisowski M, Szewczuk Z, Ożyhar A (2008) Starmaker exhibits properties of an intrinsically disordered protein. Biomacromolecules 9: Kapłon TM, Michnik A, Drzazga Z, Richter K, Kochman M, Ożyhar A (2009) The rod-shaped conformation of Starmaker. Biochim Biophys Acta 1794: Wojtas M, Kapłon TM, Dobryszycki P, Ożyhar A (2012) The effect of counter ions on the conformation of intrinsically disordered proteins studied by size-exclusion chromatography. Methods Mol Biol 896: Wojtas M, Wołcyrz M, Ożyhar A, Dobryszycki P (2012) Phosphorylation of Intrinsically Disordered Starmaker Protein Increases Its Ability To Control the Formation of Calcium Carbonate Crystals. Cryst Growth Des 12: Tohse H, Takagi Y, Nagasawa H (2008) Identification of a novel matrix protein contained in a protein aggregate associated with collagen in fish otoliths. FEBS J 275: Nemoto Y, Chatani M, Inohaya K, Hiraki Y, Kudo A (2008) Expression of marker genes during otolith development in medaka. Gene Expr Patterns 8: Różycka M, Wojtas M, Jakób M, Stigloher C, Grzeszkowiak M, Mazur M, Ożyhar A (2014) Intrinsically disordered and pliable Starmaker-like protein from medaka (Oryzias latipes) controls the formation of calcium carbonate crystals. PLoS One 9: e Kalmar L, Homola D, Varga G, Tompa P (2012) Structural disorder in proteins brings order to crystal growth in biomineralization. Bone 51: Wojtas M, Dobryszycki P, Ożyhar A (2012) Intrinsically Disordered Proteins in Biomineralization. w: Jong S (ed) Advanced Topics in Biomineralization. InTech, str Uversky VN (2013) Unusual biophysics of intrinsically disordered proteins. BBA-Proteins Proteom 1834: Dziedzic-Letka A, Ożyhar A (2012) Białka inherentnie nieuporządkowane. Postepy Biochem 58: Staines KA, MacRae VE, Farquharson C (2012) The importance of the SIBLING family of proteins on skeletal mineralisation and bone remodelling. J Endocrinol 214: Kulkarni GV, Chen B, Malone JP, Narayanan AS, George A (2000) Promotion of selective cell attachment by the RGD sequence in dentine matrix protein 1. Arch Oral Biol 45: Rowe PS, Kumagai Y, Gutierrez G, Garrett IR, Blacher R, Rosen D, Cundy J, Navvab S, Chen D, Drezner MK, Quarles LD, Mundy GR (2004) MEPE has the properties of an osteoblastic phosphatonin and minhibin. Bone 34: George A, Veis A (2008) Phosphorylated proteins and control over apatite nucleation, crystal growth, and inhibition. Chem Rev 108: Feng Q (2011) Principles of calcium-based biomineralization. Prog Mol Subcell Biol 52: Weiner S, Wagner HD (1998) The Material Bone: Structure-Mechanical Function Relations. Annu Rev Mater Sci 28: Nudelman F, Lausch AJ, Sommerdijk NA, Sone ED (2013) In vitro models of collagen biomineralization. J Struct Biol 183: van der Rest M, Garrone R (1991) Collagen family of proteins. FASEB J 5: Knott L, Bailey AJ (1998) Collagen cross-links in mineralizing tissues: A review of their chemistry, function, and clinical relevance. Bone 22: Saito T, Arsenault AL, Yamauchi M, Kuboki Y, Crenshaw MA (1997) Mineral induction by immobilized phosphoproteins. Bone 21: Masuda K, Takahashi N, Tsukamoto Y, Honma H, Kohri K (2000) N-Glycan structures of an osteopontin from human bone. Biochem Biophys Res Commun 268: Hunter GK (2013) Role of osteopontin in modulation of hydroxyapatite formation. Calcif Tissue Int 93: Addison WN, Masica DL, Gray JJ, McKee MD (2010) Phosphorylation- -dependent inhibition of mineralization by osteopontin ASARM peptides is regulated by PHEX cleavage. J Bone Miner Res 25: Staines KA, Mackenzie NC, Clarkin CE, Zelenchuk L, Rowe PS, MacRae VE, Farquharson C (2012) MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization. Bone 51: Jahnen-Dechent W, Heiss A, Schafer C, Ketteler M (2011) Fetuin-A regulation of calcified matrix metabolism. Circ Res 108: Price PA, Toroian D, Lim JE (2009) Mineralization by inhibitor exclusion: the calcification of collagen with fetuin. J Biol Chem 284: Lombardi G, Perego S, Luzi L, Banfi G (2015) A four-season molecule: osteocalcin. Updates in its physiological roles. Endocrine 48: Postępy Biochemii 61 (4)

15 38. Hoang QQ, Sicheri F, Howard AJ, Yang DSC (2003) Bone recognition mechanism of porcine osteocalcin from crystal structure. Nature 425: Sullivan TR, Duque G, Keech AC, Herrmann M (2013) An Old Friend in a New Light: The Role of Osteocalcin in Energy Metabolism. Cardiovasc Therapeut 31: Paiva KBS, Granjeiro JM (2014) Bone tissue remodeling and development: Focus on matrix metalloproteinase functions. Arch Biochem Biophys 561: Golub EE (2009) Role of matrix vesicles in biomineralization. Biochim Biophys Acta 1790: Stickens D, Behonick DJ, Ortega N, Heyer B, Hartenstein B, Yu Y, Fosang AJ, Schorpp-Kistner M, Angel P, Werb Z (2004) Altered endochondral bone development in matrix metalloproteinase 13-deficient mice. Development 131: Inada M, Wang Y, Byrne MH, Rahman MU, Miyaura C, Lopez-Otin C, Krane SM (2004) Critical roles for collagenase-3 (Mmp13) in development of growth plate cartilage and in endochondral ossification. Proc Natl Acad Sci USA 101: Holmbeck K, Bianco P, Caterina J, Yamada S, Kromer M, Kuznetsov SA, Mankani M, Robey PG, Poole AR, Pidoux I (1999) MT1-MMP-deficient mice develop dwarfism, osteopenia, arthritis, and connective tissue disease due to inadequate collagen turnover. Cell 99: Shi J, Son M, Yamada S, Szabova L, Kahan S, Chrysovergis K, Wolf L, Surmak A, Holmbeck K (2008) Membrane-type MMPs enable extracellular matrix permissiveness and mesenchymal cell proliferation during embryogenesis. Dev Biol 313: Orimo H (2010) The mechanism of mineralization and the role of alkaline phosphatase in health and disease. Journal of Nippon Medical School = Nippon Ika Daigaku zasshi 77: Millan JL (2013) The role of phosphatases in the initiation of skeletal mineralization. Calcif Tissue Int 93: New SE, Aikawa E (2013) Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: an additional novel mechanism of cardiovascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol 33: Omelon S, Ariganello M, Bonucci E, Grynpas M, Nanci A (2013) A Review of Phosphate Mineral Nucleation in Biology and Geobiology. Calcif Tissue Int 93: During A, Penel G, Hardouin P (2015) Understanding the local actions of lipids in bone physiology. Prog Lipid Res 59: Toroian D, Lim JE, Price PA (2007) The Size Exclusion Characteristics of Type I Collagen: Implications for the Role of Noncollagenous Bone Constituents in Mineralization. J Biol Chem 282: Nelson SJ (2009) Wheeler s Dental Anatomy, Physiology and Occlusion. Saunders, Filadelfia, Stany Zjednoczone 53. Zeichner-David M (2001) Is there more to enamel matrix proteins than biomineralization? Matrix Biol 20: Moradian-Oldak J (2012) Protein-mediated enamel mineralization. Front Biosci (Landmark Ed) 17: Gruenbaum-Cohen Y, Tucker AS, Haze A, Shilo D, Taylor AL, Shay B, Sharpe PT, Mitsiadis TA, Ornoy A, Blumenfeld A, Deutsch D (2009) Amelogenin in cranio-facial development: the tooth as a model to study the role of amelogenin during embryogenesis. J Exp Zool B Mol Dev Evol 312B: Ye L, Le TQ, Zhu L, Butcher K, Schneider RA, Li W, Besten PK (2006) Amelogenins in human developing and mature dental pulp. J Dent Res 85: Pugach MK, Suggs C, Li Y, Wright JT, Kulkarni AB, Bartlett JD, Gibson CW (2013) M180 amelogenin processed by MMP20 is sufficient for decussating murine enamel. J Dent Res 92: Hart S, Hart T, Gibson C, Wright JT (2000) Mutational analysis of X- -linked amelogenesis imperfecta in multiple families. Arch Oral Biol 45: Moradian-Oldak J, Paine ML, Lei YP, Fincham AG, Snead ML (2000) Self-assembly properties of recombinant engineered amelogenin proteins analyzed by dynamic light scattering and atomic force microscopy. J Struct Biol 131: Moradian-Oldak J (2007) The emergence of nanospheres as basic structural components adopted by amelogenin. J Dent Res 86: Buchko GW, Tarasevich BJ, Roberts J, Snead ML, Shaw WJ (2010) A solution NMR investigation into the murine amelogenin splice-variant LRAP (Leucine-Rich Amelogenin Protein). BBA-Proteins Proteom 1804: Delak K, Harcup C, Lakshminarayanan R, Sun Z, Fan Y, Moradian- -Oldak J, Evans JS (2009) The Tooth Enamel Protein, Porcine Amelogenin, Is an Intrinsically Disordered Protein with an Extended Molecular Configuration in the Monomeric Form. Biochemistry (N Y ) 48: Ndao M, Dutta K, Bromley KM, Lakshminarayanan R, Sun Z, Rewari G, Moradian-Oldak J, Evans JS (2011) Probing the self-association, intermolecular contacts, and folding propensity of amelogenin. Protein Sci 20: Ravindranath HH, Chen L, Zeichner-David M, Ishima R, Ravindranath RMH (2004) Interaction between the enamel matrix proteins amelogenin and ameloblastin. Biochem Biophys Res Commun 323: Fan D, Du C, Sun Z, Lakshminarayanan R, Moradian-Oldak J (2009) In vitro study on the interaction between the 32 kda enamelin and amelogenin. J Struct Biol 166: Iijima M, Fan D, Bromley KM, Sun Z, Moradian-Oldak J (2010) Tooth enamel proteins enamelin and amelogenin cooperate to regulate the growth morphology of octacalcium phosphate crystals. Cryst Growth Des 10: Nanci A, Zalzal S, Lavoie P, Kunikata M, Chen W, Krebsbach PH, Yamada Y, Hammarstrom L, Simmer JP, Fincham AG, Snead ML, Smith CE (1998) Comparative Immunochemical Analyses of the Developmental Expression and Distribution of Ameloblastin and Amelogenin in Rat Incisors. J Histochem Cytochem 46: Krebsbach PH, Lee SK, Matsuki Y, Kozak CA, Yamada KM, Yamada Y (1996) Full-length Sequence, Localization, and Chromosomal Mapping of Ameloblastin: A Novel Tooth-Specific Gene. J Biol Chem 271: Fukumoto S, Kiba T, Hall B, Iehara N, Nakamura T, Longenecker G, Krebsbach PH, Nanci A, Kulkarni AB, Yamada Y (2004) Ameloblastin is a cell adhesion molecule required for maintaining the differentiation state of ameloblasts. J Cell Biol 167: Vymetal J, Slaby I, Spahr A, Vondrasek J, Lyngstadaas SP (2008) Bioinformatic analysis and molecular modelling of human ameloblastin suggest a two-domain intrinsically unstructured calcium-binding protein. Eur J Oral Sci 116: Mazumder P, Prajapati S, Lokappa SB, Gallon V, Moradian-Oldak J (2014) Analysis of co-assembly and co-localization of ameloblastin and amelogenin. Front Physiol 5: Deutsch D, Palmon A, Fisher LW, Kolodny N, Termine JD, Young MF (1991) Sequencing of bovine enamelin ( tuftelin ) a novel acidic enamel protein. J Biol Chem 266: Paine CT, Paine ML, Luo W, Okamoto CT, Lyngstadaas SP, Snead ML (2000) A Tuftelin-interacting Protein (TIP39) Localizes to the Apical Secretory Pole of Mouse Ameloblasts. J Biol Chem 275: Hu JC, Hu Y, Smith CE, McKee MD, Wright JT, Yamakoshi Y, Papagerakis P, Hunter GK, Feng JQ, Yamakoshi F, Simmer JP (2008) Enamel defects and ameloblast-specific expression in Enam knock-out/lacz knock-in mice. J Biol Chem 283: Tanabe T, Aoba T, Moreno EC, Fukae M, Shimuzu M (1990) Properties of phosphorylated 32 kd nonamelogenin proteins isolated from porcine secretory enamel. Calcif Tissue Int 46: Lu Y, Papagerakis P, Yamakoshi Y, Hu JC, Bartlett JD, Simmer JP (2008) Functions of KLK4 and MMP-20 in dental enamel formation. Biol Chem 389: Orsini G, Ruggeri A, Mazzoni A, Nato F, Manzoli L, Putignano A, Di Lenarda R, Tjäderhane L, Breschi L (2009) A review of the nature, role, and function of dentin non-collagenous proteins. Part 1: proteoglycans and glycoproteins. Endodontic Topics 21: Niu LN, Zhang W, Pashley DH, Breschi L, Mao J, Chen JH, Tay FR (2014) Biomimetic remineralization of dentin. Dent Mater 30:

16 79. Kmieć Z (2011) Histologia i cytofizjologia zeba i jamy ustnej. Elsevier Urban & Partner, Wrocław, Polska 80. Kinney JH, Marshall SJ, Marshall GW (2003) The mechanical properties of human dentin: a critical review and re-evaluation of the dental literature. Crit Rev Oral Biol Med 14: He G, Ramachandran A, Dahl T, George S, Schultz D, Cookson D, Veis A, George A (2005) Phosphorylation of Phosphophoryn Is Crucial for Its Function as a Mediator of Biomineralization. J Biol Chem 280: George A, Sabsay B, Simonian PA, Veis A (1993) Characterization of a novel dentin matrix acidic phosphoprotein. Implications for induction of biomineralization. J Biol Chem 268: Hao J, Zou B, Narayanan K, George A (2004) Differential expression patterns of the dentin matrix proteins during mineralized tissue formation. Bone 34: Qin C, Brunn JC, Cook RG, Orkiszewski RS, Malone JP, Veis A, Butler WT (2003) Evidence for the proteolytic processing of dentin matrix protein 1. Identification and characterization of processed fragments and cleavage sites. J Biol Chem 278: Narayanan K, Ramachandran A, Hao J, He G, Park KW, Cho M, George A (2003) Dual functional roles of dentin matrix protein 1: Implications in biomineralization and gene transcription by activation of intracellular Ca 2+ store. J Biol Chem 278: Gajjeraman S, Narayanan K, Hao J, Qin C, George A (2007) Matrix macromolecules in hard tissues control the nucleation and hierarchical assembly of hydroxyapatite. J Biol Chem 282: Ogbureke KU, Fisher LW (2004) Expression of SIBLINGs and their partner MMPs in salivary glands. J Dent Res 83: Terasawa M, Shimokawa R, Terashima T, Ohya K, Takagi Y, Shimokawa H (2004) Expression of dentin matrix protein 1 (DMP1) in nonmineralized tissues. J Bone Miner Metab 22: Gericke A, Qin C, Sun Y, Redfern R, Redfern D, Fujimoto Y, Taleb H, Butler WT, Boskey AL (2010) Different Forms of DMP1 Play Distinct Roles in Mineralization. J Dent Res 89: Bertassoni LE, Orgel JP, Antipova O, Swain MV (2012) The dentin organic matrix limitations of restorative dentistry hidden on the nanometer scale. Acta Biomater 8: Osborn JW (1981) Dental Anatomy and Embryology. Blackwell Science, Oxford, Wielka Brytania 92. Bosshardt DD, Selvig KA (1997) Dental cementum: the dynamic tissue covering of the root. Periodontol : Saygin NE, Giannobile WV, Somerman MJ (2000) Molecular and cell biology of cementum. Periodontol : Giachelli CM, Steitz S (2000) Osteopontin: a versatile regulator of inflammation and biomineralization. Matrix Biol 19: Arzate H, Zeichner-David M, Mercado-Celis G (2015) Cementum proteins: role in cementogenesis, biomineralization, periodontium formation and regeneration. Periodontol : Popper AN, Fay RR, Platt C, Sand O (2003) Sound Detection Mechanism and Capabilities of Teleost Fishes. w: Collin SP, Marshall JN (eds) Sensory Processing in Aquatic Environments. Springer, Nowy Jork, Stany Zjednoczone, str Popper AN, Ramcharitar J, Campana SE (2005) Why otoliths? Insights from inner ear physiology and fisheries biology. Mar Freshwater Res 56: Lundberg YW, Xu Y, Thiessen KD, Kramer KL (2015) Mechanisms of otoconia and otolith development. Dev Dyn 244: Falini G, Fermani S, Vanzo S, Miletic M, Zaffino G (2005) Influence on the Formation of Aragonite or Vaterite by Otolith Macromolecules. Eur J Inorg Chem 2005: Bajoghli B, Ramialison M, Aghaallaei N, Czerny T, Wittbrodt J (2009) Identification of starmaker-like in medaka as a putative target gene of Pax2 in the otic vesicle. Dev Dyn 238: Tohse H, Saruwatari K, Kogure T, Nagasawa H, Takagi Y (2009) Control of Polymorphism and Morphology of Calcium Carbonate Crystals by a Matrix Protein Aggregate in Fish Otoliths. Cryst Growth Des 9: Zhao X, Yang H, Yamoah EN, Lundberg YW (2007) Gene targeting reveals the role of Oc90 as the essential organizer of the otoconial organic matrix. Dev Biol 304: Petko JA, Millimaki BB, Canfield VA, Riley BB, Levenson R (2008) Otoc1: a novel otoconin-90 ortholog required for otolith mineralization in zebrafish. Dev Neurobiol 68: Maurer P, Hohenadl C, Hohenester E, Gohring W, Timpl R, Engel J (1995) The C-terminal portion of BM-40 (SPARC/osteonectin) is an autonomously folding and crystallisable domain that binds calcium and collagen IV. J Mol Biol 253: Xu Y, Zhang H, Yang H, Zhao X, Lovas S, Lundberg YW (2010) Expression, functional, and structural analysis of proteins critical for otoconia development. Dev Dyn 239: Deans MR, Peterson JM, Wong GW (2010) Mammalian Otolin: a multimeric glycoprotein specific to the inner ear that interacts with otoconial matrix protein Otoconin-90 and Cerebellin-1. PLoS One 5: e Moreland KT, Hong M, Lu W, Rowley CW, Ornitz DM, De Yoreo JJ, Thalmann R (2014) In vitro calcite crystal morphology is modulated by otoconial proteins otolin-1 and otoconin-90. PLoS One 9: e Lundberg Y, Xu Y (2012) Proteins Involved in Otoconia Formation and Maintenance. w: Gendeh B (ed) Otolaryngology. InTech, str Li Z, Gao Y, Feng Q (2009) Hierarchical structure of the otolith of adult wild carp. Mater Sci Eng 29: Wilt FH, Killian CE, Livingston BT (2003) Development of calcareous skeletal elements in invertebrates. Differentiation 71: Marin F, Luquet G, Marie B, Medakovic D (2008) Molluscan shell proteins: primary structure, origin, and evolution. Curr Top Dev Biol 80: Cusack M, Freer A (2008) Biomineralization: elemental and organic influence in carbonate systems. Chem Rev 108: Miyazaki Y, Nishida T, Aoki H, Samata T (2010) Expression of genes responsible for biomineralization of Pinctada fucata during development. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 155: Isowa Y, Sarashina I, Setiamarga DH, Endo K (2012) A comparative study of the shell matrix protein aspein in pterioid bivalves. J Mol Evol 75: Mann K, Weiss IM, André S, Gabius H, Fritz M (2000) The amino-acid sequence of the abalone (Haliotis laevigata) nacre protein perlucin. Eur J Biochem 267: Blank S, Arnoldi M, Khoshnavaz S, Treccani L, Kuntz M, Mann K, Grathwohl G, Fritz M (2003) The nacre protein perlucin nucleates growth of calcium carbonate crystals. J Microsc 212: Weber E, Bloch L, Guth C, Fitch AN, Weiss IM, Pokroy B (2014) Incorporation of a Recombinant Biomineralization Fusion Protein into the Crystalline Lattice of Calcite. Chem Mater 26: Zhang B, Wustman BA, Morse D, Evans JS (2002) Model peptide studies of sequence regions in the elastomeric biomineralization protein, Lustrin A. I. The C-domain consensus-pg-, -NVNCT-motif. Biopolymers 63: Wustman BA, Weaver JC, Morse DE, Evans JS (2003) Structure-function studies of the lustrin A polyelectrolyte domains, RKSY and D4. Connect Tissue Res 44 Suppl 1: Nagasawa H (2011) Structure and function of matrix proteins and peptides in the biomineral formation in crustaceans. Prog Mol Subcell Biol 52: Inoue H, Ohira T, Nagasawa H (2007) Significance of the N- and C-terminal regions of CAP-1, a cuticle calcification-associated peptide from the exoskeleton of the crayfish, for calcification. Peptides 28: Taylor PD, Lombardi C, Cocito S (2014) Biomineralization in bryozoans: present, past and future. Biol Rev 90: Gilbert PU, Wilt FH (2011) Molecular aspects of biomineralization of the echinoderm endoskeleton. Prog Mol Subcell Biol 52: Wilt FH (2002) Biomineralization of the spicules of sea urchin embryos. Zoolog Sci 19: Postępy Biochemii 61 (4)

17 125. Carreira AC, Alves GG, Zambuzzi WF, Sogayar MC, Granjeiro JM (2014) Bone Morphogenetic Proteins: Structure, biological function and therapeutic applications. Arch Biochem Biophys 561: Albeck S, Weiner S, Addadi L (1996) Polysaccharides of Intracrystalline Glycoproteins Modulate Calcite Crystal Growth In Vitro. Chem- Eur J 2: Dorvee JR, Boskey AL, Estroff LA (2012) Rediscovering hydrogel-based double-diffusion systems for studying biomineralization. Cryst Eng Comm 14: Cao CY, Mei ML, Li Q, Lo ECM, Chu CH (2015) Methods for Biomimetic Remineralization of Human Dentine: A Systematic Review. Int J Mol Sci 16: Lausch AJ, Sone ED (2015) A Top-down Approach to Elucidate the Role of Matrix-Bound Phosphoproteins in Control of Collagen Biomineralization. Biomacromolecules 16: Thula TT, Rodriguez DE, Lee MH, Pendi L, Podschun J, Gower LB (2011) In vitro mineralization of dense collagen substrates: A biomimetic approach toward the development of bone-graft materials. Acta Biomaterialia 7: Takagi Y, Takahashi A (1999) Characterization of otolith soluble-matrix producing cells in the saccular epithelium of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) inner ear. Anat Rec 254: Biomineralization precision of shape, structure and properties controlled by proteins Rafał Hołubowicz*, Aleksandra Porębska*, Monika Poznar*, Mirosława Różycka*, Piotr Dobryszycki * Department of Biochemistry, Wroclaw University of Technology, 27 Wybrzeże Wyspiańskiego St., Wrocław, Poland * piotr.dobryszycki@pwr.edu.pl * Autors equally contributed to this work Key words: biomineralization, calcium carbonate, collagen, hydroxyapatite, intrinsically disordered proteins, nanoparticles, SIBLING ABSTRACT Biomineralization is the process of the formation of crystal structures that is under biological control. Living organisms produce structures such as bone, teeth, otoliths, otoconia or shells. Although the chemical composition of these tissues is similar to corresponding inorganic minerals, their structure and mechanical properties differ significantly. This may be because of how they are adapted for the functions they perform. The precise control of the formation of biominerals starting with the early nucleation stage influences how the final tissues are formed. The key factors which determine the size, shape, internal structure and properties of biominerals are proteins which control the nucleation and growth of the crystals. Biomineralization is a multi-step process involving protein-protein interactions, as well as interactions between proteins and inorganic fraction. Due to their specific properties, intrinsically disordered proteins (IDPs) perform a particularly important role in the control of the biomineralization process. This article contains an overview of biominerals that are naturally occurring and describes the structures and mineralization mechanisms of the most important of them. The main part of this work was dedicated to the role of proteins which control crystal growth