PODSTAWY RADIOBIOLOGII, BIOLOGICZNE EFEKTY DZIAŁANIA PROMIENIOWANIA JONIZUJĄCEGO

Transkrypt

1 PODSTAWY RADIOBIOLOGII, BIOLOGICZNE EFEKTY DZIAŁANIA PROMIENIOWANIA JONIZUJĄCEGO Rozważając zagadnienia związane z efektami biologicznymi promieniowania jonizującego warto przypomnieć sobie tematykę dotyczącą sposobów oddziaływania promieniowania jonizującego z materią (Moduł I podstawy fizyki promieniowania jonizującego). Stoją one u podstaw mechanizmów przekazywania energii, która to w znacznym stopniu odpowiada za obserwowane efekty biologiczne. Jak już wspominano we wcześniejszych modułach, parametrem określającym ilość energii traconej w wyniku oddziaływania promieniowania jonizującego z ośrodkiem jest tzw. liniowy współczynnik przekazywania energii (LET). Im wyższa jest jego wartość tym mamy do czynienia z promieniowaniem o większej gęstości jonizacji, a tym samym promieniowanie to na krótszej drodze będzie przekazywało większą ilość energii atomom ośrodka. Oczywiście istotne jest pytanie: jaki wpływ na efekty biologiczne ma depozycja energii? Odpowiedz w tym przypadku jest oczywista. Deponowana energia w ośrodku biologicznym np. cytoplazmie komórki, tkance, narządzie itp. odpowiada za dawkę pochłoniętą w tej strukturze biologicznej, co determinuje z kolei liczbę obserwowanych aktów jonizacji. Zależność ta jest wprost proporcjonalna. Oznacza to, że każdy wzrost deponowanej energii przekłada się na wzrost jonizacji, co z kolei prowadzi do wzrostu uszkodzeń biologicznych. Jak więc widać zaabsorbowana w strukturach biologicznych energia promieniowania jonizującego jest jednym z czynników predykcyjnych dla efektów działania energii promienistej na organizmy żywe. Wartość LET zależy zarówno od rodzaju promieniowania jonizującego, z którego ekspozycją mamy do czynienia jak i z rodzajem ośrodka, które jest penetrowane przez to promieniowanie. W tabeli przedstawiono niektóre rodzaje promieniowania jonizującego wraz ze średnimi wartościami LET. RODZAJ PROMIENIOWANIA LET [kev/µm] Prom. γ (Co-60) 0,2 Prom. X (250 kvp) 2,0 Protony (10 MeV) 4,7 Cząstki α (2,5 MeV) 166 Jony Fe (2 GeV) 1000 Analizując tabelę zwraca uwagę fakt, że dla promieniowania elektromagnetycznego wartość współczynnika LET generalnie przyjmuje niższe wartości niż dla promieniowania korpuskularnego. Nie bez znaczenia jest również wielkość cząstek - nośników energetycznych oraz ich ładunek. Im większy nośnik oraz większy jego ładunek tym LET przyjmuje wyższe wartości. Oznacza to, że ekspozycja na promieniowanie korpuskularne stanowi większe zagrożenie dla organizmów żywych niż promieniowanie elektromagnetyczne. Równocześnie należy podkreślić, że

2 szybciej tracona energia wyższa wartość LET skutkuje ograniczeniem głębokości penetracji promieniowania. W takich przypadkach efekty biologiczne będziemy obserwować w wierzchnich warstwach organizmu. TKANKA PROMIENIOWANIE GAMMA GŁĘBOKA PENETRACJA CENTRUM JONIZACJI PROMIENIOWANIE BETA ŚREDNIA PENETRACJA PROMIENIOWANIE ALFA PŁYTKA PENETRACJA ETRACJA W tym miejscu należy wprowadzić dwa dość istotne pojęcia: ekspozycja wewnętrzna i ekspozycja zewnętrzna. Z pierwszą sytuacją mamy do czynienia gdy źródło promieniowania znajduje się wewnątrz eksponowanego organizmu (np. inkorporacja radioizotopu), natomiast drugie pojęcie dotyczy sytuacji gdy źródło promieniowania jest poza organizmem (np. napromienianie). Dla promieniowania korpuskularnego popromienne uszkodzenia układu biologicznego rozpatrywane na poziomie ustroju w większym nasileniu obserwowane będą w przypadku ekspozycji wewnętrznej niż zewnętrznej. Stąd na obserwowane efekty biologiczne w ujęciu globalnym będzie miał wpływ rodzaj ekspozycji, co związane jest możliwością rozległości penetracji organizmu przez dany rodzaj promieniowania. Znajomość jedynie wartości LET i czasu danej ekspozycji nie jest wystarczającą podstawą do wnioskowania o rodzaju i intensywności uszkodzeń popromiennych. Każda osoba, mająca jakieś doświadczenie w pracy z promieniowaniem jonizującym wie, że na obserwowane efekty biologiczne, znaczący wpływ ma również rodzaj eksponowanych komórek (np. inaczej na tą samą dawkę promieniowania zareagują komórki nerwowe niż komórki szpiku) oraz sama forma i sposób aplikacji promieniowania. Stąd też, aby móc porównywać biologiczną szkodliwość różnych ekspozycji na promieniowanie jonizujące wprowadzono pojęcie względnej skuteczności biologicznej WSB (relative biological effectiveness - RBE). Zgodnie z zaleceniami ICRP względną skuteczność biologiczną definiujemy jako iloraz dawki referencyjnej D X i dawki promieniowania testowego D T dającego ten sam efekt biologiczny. Wzorcem, do którego porównujemy oceniane efekty biologiczne jest promieniowanie X o energii 250keV.

3 D WSB (RBE) = D gdzie: D X dawka prom. X (250 kev), która wywołuje dany skutek biologiczny; D T dawka innego rodzaju promieniowania wywołująca taki sam skutek biologiczny Wartość współczynnika WSB znalazła swoje przełożenie w wyznaczeniu współczynników ważonych dla różnych rodzajów promieniowania (W R ), które mają zastosowanie w ochronie radiologicznej. W tabeli przedstawiono wartości WSB i W R dla niektórych rodzajów promieniowania. X T Rodzaj promieniowania WSB W R X (250 kev) 1 1 X lub γ (różne energie) 0,7-1,2 1 Cząstki β (różne energie) 1,0-1,7 1 Neutrony (różne energie) Protony (różne energie) Cząstki α (różne energie) Ciężkie jony i jądra (różne energie) Różnice obserwowane w wartościach dla WSB i W R dla danego rodzaju promieniowania związane są z kwestiami ochrony radiologicznej, m.in. efektywnością stosowanych metod ochrony przed promieniowaniem. Tak więc posługiwanie się wartością WSB pozwala wprost porównywać efekty biologiczne dla różnych rodzajów promieniowania. Zachodzi jednak pytanie jak wartość LET wpływa na wartość WSB? W tym celu przeanalizujmy poniższy wykres.

4 WSB LET [kev/µm] Bez wnikania w szczegóły możemy powiedzieć, że właściwie niezależnie od rodzaju stosowanego promieniowania jonizującego mamy wyraźny wzrost względnych efektów biologicznych dla wartości LET wynoszącej ok. 100keV/µm. Oczywiście dla promieniowania korpuskularnego (krzywa 1 i 2) obserwowane efekty biologiczne będą intensywniej zaznaczone (wyższa wartość WSB) niż w przypadku promieniowania elektromagnetycznego (krzywa 3). Związane jest to z różnymi mechanizmami oddziaływania poszczególnych rodzajów promieniowania z materią (patrz moduł I/II) oraz dodatkowo w przypadku promieniowania korpuskularnego wpływu ładunku i wielkości cząstek-nośników na rozległość uszkodzeń biologicznych. Jak kształtuje się wartość WSB w zależności od energii dla obu rodzajów promieniowania przedstawiono na przykładzie promieniowania neutronowego (korpuskularne) oraz promieniowania gamma (elektromagnetyczne) WSB WSB energia neutronów [kev] energia kwantów gamma [kev]

5 Jak widać na wykresie dla promieniowania elektromagnetycznego w przebiegu zależności względnych efektów biologicznych od energii kwantów promieniowania nie obserwuje się wyraźnie izolowanych maksimów, a promieniowanie o niższych wartościach kwantów energii charakteryzuje się większą względną skutecznością biologiczną, co jest zgodne z poznaną już w module I/II wiedzą dotyczącą mechanizmów oddziaływania tego promieniowania z materią. Całkowicie inaczej wygląda wykres dla promieniowania korpuskularnego, gdzie obserwujemy wyraźnie zaznaczone maksimum względnych efektów biologicznych przypadające na energię 100keV. Wzrost względnych efektów biologicznych w tym zakresie energii związany jest to z uszkodzeniami materiału genetycznego komórki. Nić DNA jak pamiętamy składa się z dwóch komplementarnych do siebie łańcuchów nukleotydów ułożonych w odległości od siebie równej dokładnie 20Å. W przypadku promieniowania korpuskularnego o energii 100keV centra jonizacji, a więc miejsca fizycznego przekazywania energii molekułom, odległe są od siebie dokładnie o 20Å. Stąd częściej niż dla innych energii obserwować będziemy podwójne uszkodzenia nici DNA (DSB double-strand breake), trudniejsze do naprawy niż uszkodzenia pojedyncze (SSB single-strand break)) i skutkujące większym prawdopodobieństwem dysfunkcji komórki łącznie z jej śmiercią. Rozważając zagadnienia związane z biologicznym działaniem promieniowania jonizującego należy być świadomym wielopłaszczyznowości obserwowanych efektów ich wzajemnych interakcji i czasu ich wystąpienia od ekspozycji. Możemy więc mówić o poziomie molekularnym, komórkowym, narządowym i ustrojowym. Omówimy sobie po kolei wszystkie te poziomy. POZIOM MOLEKULARNY Poziom molekularny dotyczy interakcji promieniowania z atomami i cząsteczkami budującymi struktury wewnątrzkomórkowe. Na tym poziomie dochodzi do faktycznego przekazywania energii przez cząstki-nośniki (w przypadku promieniowania korpuskularnego) lub kwanty (dla promieniowania elektromagnetycznego). Mechanizmy przekazywania tej energii są identyczne jak te dotyczące oddziaływania promieniowania jonizującego z materią omawiane w module I/II. Energia ta powoduje ekscytację (wzbudzanie) lub jonizację atomów lub cząsteczek. W efekcie tworzą się wolne rodniki, czyli molekuły o znacznej reaktywności chemicznej bądź dochodzi do zrywania wiązań wewnątrz lub między cząsteczkowych. Ponadto obserwuje się często rozluźnienie wiązań wielokrotnych, co umożliwia rotację grup funkcyjnych prowadzących do zmiany konfiguracji przestrzennej cząstek organicznych, co z kolei może skutkować np. przejściem biologicznie aktywnej formy enzymu w nieaktywną i zaburzeniem komórkowych szlaków metabolicznych. Te wszystkie zmiany mogą prowadzić do dysfunkcji makrocząsteczek. Z punktu widzenia funkcjonowania komórki najbardziej istotne są uszkodzenia makrocząsteczek takich jak białka, lipidy błonowe a szczególnie DNA. Nawet niewielkie w tym zakresie zmiany mogą znacząco wpływać na funkcjonalność całej komórki. Przyjmuje się istnienie dwóch mechanizmów prowadzących do powstawania uszkodzeń biologicznych w wyniku działania promieniowania jonizującego z układem biologicznym: - Mechanizm bezpośredni przez jonizację.

6 Mechanizm ten odpowiada za uszkodzenia biologiczne głównie w przypadku ekspozycji na promieniowanie korpuskularne. Centra jonizacji lokalizują się w strukturach komórkowych doprowadzając bezpośrednio do uszkodzeń makrocząsteczek poprzez zrywanie wiązań wewnątrz lub między cząsteczkowych. Należy pamiętać, że im wyższa wartość LET tym większa gęstość jonizacji dla danego promieniowania i zarazem większe prawdopodobieństwo uszkodzenia istotnej struktury biologicznej, tym samym większy udział tego mechanizmu w uszkodzeniach biologicznych przez dany typ promieniowania. Na rysunku porównano gęstości jonizacji dla promieniowania o wysokim (B) i niskim LET (A) Jak więc widać gęstość jonizacji determinuje prawdopodobieństwo uszkodzeń biologicznych wg tego mechanizmu. Stąd też w przypadku promieniowania elektromagnetycznego (niska gęstość jonizacji) tylko w niewielkim stopniu za popromienne uszkodzenia biologiczne będzie odpowiadał mechanizm bezpośredniej jonizacji. Mechanizm pośredni przez indukcję wolnych rodników Mechanizm ten odpowiada za uszkodzenia popromienne głównie w przypadku ekspozycji układów biologicznych na promieniowanie elektromagnetyczne (X lub gamma). Interakcja kwantów promieniowania z prostymi cząsteczkami występującymi w układach biologicznych (np. wodą w cytoplazmie komórki) zapoczątkowuje kaskadę reakcji chemicznych prowadzących do powstania wolnych rodników, które z kolei wchodzą w reakcje z makrocząsteczkami prowadząc do ich dysfunkcji lub dezaktywacji.

7 SCHEMAT RADIOLIZY WODY CZĄSTKI PROMIENIOWANIA JONIZUJĄ WODĘ: H 2 O H 2 O + + e ZJONIZOWANA CZĄSTECZKA WODY MOŻE NP. POŁĄCZYĆ SIĘ Z UWOLNIONYM ELEKTRONEM, TWORZĄC CZĄSTECZKĘ WZBUDZONĄ: H 2 O + + e H 2 O* NA SKUTEK JEJ ROZPADU POWSTAJĄ PRODUKTY SILNIE REAGUJĄCE ZE ZWIĄZKAMI CHEMICZNYMI WCHODZĄCYMI W SKŁAD KOMÓREK ORGANIZMU: H 2 O* H. + OH. Dodatkowym czynnikiem wzmacniającym skuteczność biologiczną promieniowania jonizującego, w którym obserwowane efekty biologiczne związane są z pośrednim mechanizmem uszkodzeń popromiennych układów biologicznych jest wysokie parcjalne ciśnienie tlenu w cytoplazmie komórki. Efekt tlenowy powoduje uwrażliwienie na promieniowanie jonizujące (szczególnie elektromagnetyczne) komórek euoksycznych (z dużą zawartością tlenu) w porównaniu z komórkami będącymi w stanie hipoksji. Mechanizm przebiegu reakcji chemicznych związanych z efektem tlenowym (OER) przedstawiono na rysunku. Należy również nadmienić, że mechanizm prowadzący do powstawania nadtlenku wodoru jest tylko jednym z wielu procesów związanych z wytwarzaniem reaktywnych form tlenu (ROS) odpowiedzialnych za uszkodzenia biologiczne powstające w efekcie ekspozycji na promieniowanie jonizujące układów biologicznych.

8 USZKODZENIA POŚREDNIE EFEKT TLENOWY (OER) DECYDUJĄCY WPŁYW NA UDZIAŁ EFEKTU POŚREDNIEGO MA CZĄSTKOWE CIŚNIENIE TLENU W KOMÓRCE. TLEN REAGUJE Z POWSTAŁYM NA SKUTEK RADIOLIZY WODY RODNIKIEM WODORU, CO PROWADZI DO POWSTANIA NIESTABILNEGO RODNIKA WODORO-NADTLENKOWEGO: H. + O 2 HO 2. REAGUJĄC Z DRUGIM TAKIM RODNIKIEM LUB Z RODNIKIEM WODORU, TWORZY ON NADTLENEK WODORU, CZĄSTECZKĘ SILNIE UTLENIAJĄCĄ, POWODUJĄCĄ LICZNE USZKODZENIA DNA: 2HO 2. H 2 O 2 + O 2 HO 2. + H. H 2 O 2 STWIERDZONO, ŻE PODWYŻSZENIE CZĄSTKOWEGO CIŚNIENIA TLENU MOŻE WZMOCNIĆ SKUTEK PROMIENIOWANIA. Innym czynnikiem również wpływającym synergicznie na efekty biologiczne promieniowania jonizującego jest stan hipertermii komórki. Należy zaznaczyć, że czynnik termiczny wzmaga efekty biologiczne niezależnie od typu mechanizmu stającego u podstaw obserwowanych zmian popromiennych. Wpływ efektu tlenowego i hipertermii na promieniowrażliwość komórek przedstawiono poniżej. SF 0,85 0,65 0,45 0,25 DAWKA [Gy] 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 KOMÓRKI EUOKSYCZNE KOMÓRKI HIPOKSYCZNE SF DAWKA [Gy] 0 0,5 1 1,5 2 0,85 T=40 O C 0,65 0,45 T=42,5 O C 0,25 0,05 0,05 Jak widać w obecność tlenu cząsteczkowego jak i podwyższona temperatura układu biologicznego znacząco wzmagają odpowiedź komórkową na stres związany z

9 ekspozycją na promieniowanie jonizujące. Wpływ efektu tlenowego na intensywność uszkodzeń biologicznych wyznacza się ilościowo zgodnie ze wzorem: DAWKA OER = DAWKA DLA DLA EFEKTU EFEKTU F F W W STANIE STANIE HIPOKSJI EOKSJI Badania odpowiedzi komórkowej na działanie promieniowania jonizującego w różnych warunkach, pozwalają zwiększać wydajność metod radioterapeutycznych prowadzących do skutecznego niszczenia komórek patologicznych (np. nowotworowych) lub patogennych mikroorganizmów, przy maksymalnej ochronie komórek prawidłowych. Na rysunku przedstawiono przebieg zjawisk zachodzących na poziomie molekularnym będących skutkiem ekspozycji organizmu żywego na jonizujące promieniowanie elektromagnetyczne. Zbliżony przebieg zjawisk obserwuje się w przypadku ekspozycji układu biologicznego na promieniowanie korpuskularne. Jak widać obserwowane na poziomie molekularnym efekty działania promieniowania jonizującego na organizm żywy według mechanizmu pośredniego mają charakter sekwencyjny z następującymi po sobie cyklami. Każdy cykl składa się z 4 podstawowych etapów: I pierwotnego, w którym następuje interakcja nośnika energii promieniowania (kwantu lub cząstki) z układem biologicznym. W przypadku promieniowania

10 korpuskularnego mamy do czynienia ze sprężystymi lub niesprężystymi zderzeniami skutkujące jonizacją atomów układu biologicznego, natomiast dla promieniowania elektromagnetycznego przekazanie energii towarzyszy zjawisku fotoelektrycznemu, Comptona czy kreacji par. II fizyko-chemiczny, w którym obserwuje się tworzenie się wolnych rodników. III chemiczny, w którym dochodzi do reakcji pomiędzy rodnikami (reakcje kaskadowe) oraz pomiędzy rodnikami a obojętnymi cząsteczkami układu biologicznego. IV zmian własności biologicznych ośrodka, w którym dochodzi do zmian strukturalnych i przestrzennych makrocząsteczek co prowadzi do dysfunkcji struktur komórkowych i zaburzeń przebiegu szlaków metabolicznych. W literaturze dotyczącej zagadnień biologicznych skutków ekspozycji na promieniowanie często spotykamy się z pojęciem stopnia przeżywalności komórkowej. Pojęcie to zostało wprowadzone w celu bardziej czytelnego porównywania wrażliwości komórkowej na promieniowanie jonizujące dla różnych typów linii komórkowych lub dla różnego sposobu aplikacji energii promienistej. Test przeżywalności komórkowej jest ilościową oceną wpływu promieniowania jonizującego na populacje komórkową. Podstawą jest ocena zdolności proliferacyjnej komórek poddanych działaniu promieniowania jonizującego. Miernikiem zaś zdolność wytworzenia kolonii zawierających 50 komórek po czasie odpowiadającym 5-6 podziałom komórkowym. Przebieg testu przedstawiono na schemacie. Test przeżywalności - schemat eksperymentu komórki w hodowli trypsyna 0 Gy 1 Gy 2 Gy 3 Gy rozsianie zawiesina komórek frakcja przeżywalności (SF) inkubacja: 1-2 tygodnie SF = liczba kolonii liczba komórek x PE/100 PE = wydajność klonowania liczba kolonii: wydajność klonowania: frakcja przeżywalności: 70 70% , , ,14 Jak widać ocena wpływu promieniowania może dotyczyć różnych typów populacji komórek eksponowanych w identycznych warunkach lub też różnych warunków ekspozycji dla tego samego typu populacji komórkowej. Oceniana populacja określonych komórek traktowana jest trypsyną w celu pobudzenia ich proliferacji i umieszczana na odpowiednich podłożach odżywczych. Następnie poddawana jest w

11 ustalonych warunkach działaniu promieniowania jonizującego. Kultury komórkowe pozostawia się na czas inkubacji zapewniający ok. 5-6 podziałów mitotycznych. Ocenia się liczbę kolonii oraz wydajność klonowania dla populacji komórek. Wynikiem doświadczenia jest wyznaczenie frakcji przeżywalności (SF). Im niższa uzyskiwana w eksperymencie wartość SF (surviving fraction) tym bardziej wrażliwe są komórki na promieniowanie jonizujące w ocenianych warunkach ekspozycji. Poniżej przedstawiono schematycznie graficzną prezentację wyników uzyskiwanych w ramach powyższego eksperymentu. D Q = miara szerokości ramienia 1 D Q D 0 = miara promieniowrażliwości = dawka, która powoduje obniżenie przeżywalności do 37% mierzonej na prostej Przeżywalność 0,1 0,037 krzywa 1 D = 0,6 Gy 0 + krzywa 2 D = 1,5 Gy 0 promieniowrażliwoś ć D 0 D 0 - duże D małe D 0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Dawka (Gy) Przebieg krzywych przeżywalności dla określonych linii komórkowych lub warunków ekspozycji na promieniowanie jonizujące pozwala wnioskować o stopniu promieniowrażliwości układów biologicznych. Jako miarę promieniowrażliwości przyjęto wielkość dawki pochłoniętej promieniowania, powodującą spadek przeżywalności komórek do 37% populacji wyjściowej. Im wyższa ta wartość, tym mniejszą promieniowrażliwości cechują się komórki. Na wykresie przedstawiono dwie populacje komórkowe opisane krzywą nr 1 i 2. Populacja komórkowa 1 wykazuje większą promieniowrażliwość niż populacja komórkowa 2. W pierwszym przypadku wystarczy zwiększyć dawkę pochłoniętą promieniowania jedynie o 0,6Gy, aby spowodować spadek przeżywalności komórek do poziomu 37%. Dla drugiej populacji komórkowej, aby doprowadzić do identycznego spadku przeżywalności, należy dostarczyć energii promienistej zwiększającej dawkę pochłoniętą o 1,5Gy. Doświadczenia oparte na teście przeżywalności pozwoliły opracować model obrazujący zachowanie się komórek w warunkach ekspozycji na promieniowanie jonizujące. Przyjętym modelem jest tzw. model liniowo-kwadratowy, który w najbardziej optymalny sposób tłumaczy zachowanie się komórek w polu promieniowania jonizującego.

12 KRZYWE PRZEŻ YWALNOŚCI MODEL LINIOWO-KWADRATOWY P(s) = e (-αd - βd2 ) uszkodzenia typu one-hit prawdopodobieństwo wystąpienia zależy od D uszkodzenia typu two-hit prawdopodobieństwo wystąpienia zależy od D 2 Dose (Gy) Zgodnie z tym modelem w efekcie działania promieniowania jonizującego w układzie biologicznym zachodzą dwa przeciwstawne typy reakcji. Pierwsza związana jest z niszczącym działaniem energii promienistej i objawia się powstawaniem uszkodzeń makrocząsteczek lub struktur wewnątrzkomórkowych. Drugi typ reakcji związany jest z mechanizmami obronnymi i naprawczymi komórki uruchamianymi jako odpowiedź na niszczące działanie promieniowania jonizującego. Początkowo liczba uszkodzeń popromiennych w komórce jest niewielka i najczęściej są one izolowane, stąd też wydajność mechanizmów naprawczych komórki jest wystarczająca, a uszkodzenia naprawiane są na bieżąco. Wraz z dalszym wzrostem dawki pochłoniętej układy naprawcze komórki stają się coraz mniej wydajne i maksymalnie wysycane, co prowadzi do kumulacji uszkodzeń i w efekcie śmierci komórki. Pierwszy etap trwający do punktu równowagi obu przeciwstawnych typów reakcji komórki opisywany modelem liniowym. Im mniejsze nachylenie prostej tym większa zdolność regeneracyjna komórki (mała wartość α, duża wartość β). Etap drugi, w którym dominują uszkodzenia popromienne odpowiada modelowi kwadratowemu. Im większe nachylenie krzywej tym większa wrażliwość komórek na promieniowanie. Krzywe liniowo-kwadratowe opisujące zachowanie się komórek pod wpływem promieniowania jonizującego pozwalają modelować przebieg procedur terapeutycznych bazujących na promieniowaniu jonizującym w celu zwiększenia ich efektywności. Wracając do obserwowanych na poziomie molekularnym zmian biologicznych związanych z działaniem promieniowania jonizującego na układy biologiczne najbardziej istotne dla funkcjonowania komórki są wszelkie uszkodzenia materiału genetycznego DNA. Materiał ten zawiera pełna informację dotyczącą budowy i funkcji organelli komórkowych, procesów metabolicznych zachodzących w komórce,

13 a także sposobu komunikacji komórki z otoczeniem. Wynika z tego, ze wszelkie uszkodzenia materiału genetycznego będą znacząco wpływały na losy komórki. Wiadomo, że promieniowanie jonizujące jest fizycznym mutagenem, a jego działanie na komórkowe DNA prowadzi do zwiększenia spontanicznych mutacji. Należy równocześnie podkreślić, że promieniowanie jonizujące nie powoduje powstawania mutacji specyficznych, czyli zmian charakterystycznych jedynie dla tego promieniowania. Oznacza to, że nie ma możliwości stwierdzenia czy zmiana wykryta w materiale genetycznym spowodowana jest działaniem promieniowania jonizującego czy też działaniem innego czynnika mutagennego. Materiał genetyczny komórki może być uszkadzany zarówno w mechanizmie bezpośrednim interakcji nośników promieniowania z elementami struktury DNA jak i pośrednim w wyniku ataku cząstek chemicznie reaktywnych (wolnych rodników, ROS reaktywne formy tlenu) na łańcuch DNA. DZIAŁANIE ANIE PROMIENIOWANIA JONIZUJĄCEGO NA DNA OH ROS H O H JONIZACJA POŚREDNIA JONIZACJA BEZPOŚREDNIA 2 nm 4 nm Niezależnie od mechanizmu stojącego u podstaw destrukcyjnego działania promieniowania jonizującego na DNA, obserwowane uszkodzenia mogą być identyczne, natomiast ich intensywność wzrasta wraz ze wzrostem deponowanej w komórce energii. Zachodzi zatem pytanie jakich zmian możemy spodziewać się w DNA komórki eksponowanej na działanie promieniowania jonizującego? Najczęściej obserwuje się uszkodzenia związane z pęknięciem nici DNA: pojedyncze (SSB) i podwójne (DSB), składowych nukleotydów: utrata, uszkodzenie lub zamiana zasady, uszkodzenie reszt cukrowych lub fosforanowych czy odkształcenie spirali DNA lub wytworzenie dodatkowych wiązań krzyżowych: zasada-zasada lub DNA-białko. Jak już wcześniej zwrócono uwagę, identycznych defektów materiału genetycznego możemy spodziewać się również w przypadku działania innych niż promieniowanie

14 jonizujące mutagenów: fizycznych i chemicznych. Dodatkowym czynnikiem obciążającym dla komórki i wpływającym zarówno na ilość występujących uszkodzeń genetycznych jak i skuteczność mechanizmów naprawczych DNA jest wiek komórki. Im starsza komórka tym wydajność procesów przeciwdziałających uszkodzeniu materiału genetycznego i efektywność napraw DNA maleje. Najbardziej istotne z punktu widzenia funkcji komórki skutki związane z punktowymi, izolowanymi zmianami popromiennymi w obrębie DNA przedstawiono w tabeli. RODZAJE USZKODZENIA SKUTKI MODYFIKACJE ZASAD AZOTOWYCH W WYNIKU DZIAŁANIA RODNIKÓW HYDROKSYLOWYCH REAKCJA W MIEJSCU WIĄZANIA AROMATYCZNEGO PIRYMIDYN, POMIĘDZY C-5 I C-6, PURYN POMIĘDZY C-4 I C-8; PRZYKŁADOWO, TYMINA PRZEMIENIA SIĘ W 5-HYDROKSY-5-METYLOHYDANTOINĘ, GUANINA ULEGA MODYFIKACJI DO 8-HYDROKSYGUANINY. TWORZENIE WIĄZAŃ POPRZECZNYCH TYPU: DNA-BIAŁKO PĘKNIĘCIE ŁAŃCUCHA DNA W WYNIKU REAKCJI RODNIKÓW HYDROKSYLOWYCH Z PIERŚCIENIEM CUKROWYM TWORZENIE ADDUKTU TYPU: ZASADA AZOTOWA-AMINOKWAS; GŁÓWNIE POŁĄCZENIE TYMINY Z TYROZYNĄ. PĘKNIĘCIE JEDNEJ NICI, Z REGUŁY NAPRAWIANE ENZYMATYCZNIE ORAZ PĘKNIĘCIA PODWÓJNE, KTÓRYCH NAGROMADZENIE PROWADZI DO ŚMIERCI KOMÓRKI. ANOMALIE METYLACJI DNA HYPOMETYLACJA, PROWADZĄCA DO ZMIAN W EKSPRESJI GENÓW. Każde z tych uszkodzeń może prowadzić do zmiany zawartości informacji genetycznej posiadanej przez komórkę lub do utraty części tej informacji. Szczególnie istotne są anomalie w zakresie metylacji DNA, gdyż może to skutkować zmianami ekspresji genów w szczególności w zakresie genów regulatorowych. Tym samym komórki takie będą w przyszłości bardziej narażone na utrwalone zmiany genetyczne. Jak już wspomniano, materiał genetyczny komórki jest stale narażony na czynniki powodujące jego uszkadzanie, a energia promienista deponowana w komórce jedynie proporcjonalnie do swej wielkości wzmaga ilość tych uszkodzeń. Poniżej przedstawiono w tabeli częstość obserwowanych uszkodzeń DNA spowodowanych dawką pochłoniętą promieniowania gamma na poziomie 1Gy.

15 POPROMIENNE USZKODZENIA DNA PO POCHŁONI ONIĘCIU 1 Gy PROMIENIOWANIA γ RODZAJ USZKODZENIA PĘKNIĘCIA DWUNICIOWE (DSB) PĘKNIĘCIA JEDNONICIOWE (SSB) ZMIANA (USZKODZENIE) ZASADY W DNA ZMIANA (USZKODZENIE) CUKRU W DNA WIĄZANIA KRZYŻOWE DNA-DNA WIĄZANIA KRZYŻOWE DNA-BIAŁKO LICZBA W KOMÓRCE Pęknięcia dwuniciowe (DSB) wyróżnione w tabeli kolorem czerwonym, obserwowane są głównie w przypadku ekspozycji komórek na promieniowanie jonizujące stąd ich obecność pozwala z dużym prawdopodobieństwem wnioskować, że na dany układ biologiczny działało promieniowanie jonizujące. Pozostałe rodzaje uszkodzeń DNA w podobnej skali występują w przypadku działania również innych niż promieniowanie jonizujące czynników mutagennych. Należy pamiętać, że promieniowanie jonizujące jest naturalnym czynnikiem środowiskowym na działanie którego stale narażony jest każdy układ biologiczny. Dlatego też organizmy żywe w trakcie ewolucji wypracowały swoiste metody pozwalające minimalizować negatywne skutki promieniowania jak i przeciwdziałać utrwalaniu się zmian w materiale genetycznym. Promieniowanie jonizujące mobilizuje zarówno układy przeciwdziałające jak i naprawcze. Do tych pierwszych należą wszelkiego rodzaju związki organiczne, których celem jest neutralizowanie wolnych rodników bądź reaktywnych form tlenu (ROS) powstających w wyniku interakcji promieniowania jonizującego z układem biologicznym. Przykładem wymiatacza wolnych rodników może glutation. W wyniku zachodzących przemian biochemicznych tego związku dochodzi do neutralizacji rodnika hydroksylowego lub nadtlenku wodoru z usunięcie poza światło komórki powstałych metabolitów. Warto również podkreślić że w układzie z glutationem mogą być neutralizowane także elektrofilowe ksenobiotyki. Przebieg takiego procesu przedstawiono na schemacie.

16 GLUTATION Glu Cys Gly H 2 O + GS DISULFID GLUTATIONU GSSG SH ATAK PRZEZ RODNIK OH GS REAKTYWNE FORMY TLENU GS H 2 O H 2 O 2 WOLNE RODNIKI RH R ELEKTROFILOWE KSENOBIOTYKI QX HX GS-OH Peroksydaza glutationowa GSSG GSH Reduktaza glutationowa NADPH Transferaza glutationowa NADP+H + GS-Q ATP ADP+P Przedstawiony układ jest jednym z wielu mechanizmów chroniących najważniejsze struktury wewnątrzkomórkowe oraz makrocząsteczki przed działaniem niekorzystnych czynników. Szczególnie chroniony przed uszkodzeniami jest materiał genetyczny, który poza krótkimi momentami w cyklu komórki, otoczony jest białkami. Stanowią one dość skuteczną barierę chroniącą DNA przed penetracją niszczących czynników. Tym niemniej pojedyncze zasady w DNA mogą być uszkadzane w czasie ekspozycji na promieniowanie jonizujące, co powoduje niewłaściwe parowanie zasad, a w konsekwencji wprowadzenie mutacji w DNA. Dlatego też kolejną linią obrony komórki przed utrwaleniem niekorzystnych zmian w materiale genetycznym są układy naprawcze głównie wieloetapowe, enzymatyczne. Mobilizowane są one w momencie powstawania uszkodzeń DNA. Oczywiście określony rodzaj uszkodzenia materiału genetycznego będzie aktywował specyficzne tylko dla niego mechanizmy naprawcze. Mamy więc tyle mechanizmów naprawczych ile rodzajów uszkodzeń. Mechanizmy te bazują na zasadzie komplementarności informacji genetycznej stąd ich skuteczność jest bardzo wysoka. Uszkodzenia izolowane, jednoniciowe są stosunkowo łatwe do naprawy. Przykładem takiego mechanizmu może być naprawa uszkodzonej zasady w nukleotydzie. Naprawa przez wycinanie zasady (BER - base excision repair) polega na wycięciu zmutowanej zasady z helisy DNA i jej naprawę. W procesie bierze udział szereg wyspecjalizowanych enzymów aktywowanych zgodnie z przedstawionym poniżej schematem

17 W procesie biorą udział dwa typy enzymów, glikozylazy DNA i endonukleazy AP. Glikozylaza DNA przecina wiązanie β-n glikozydowe między uszkodzoną zasadą a cząsteczką deoksyrybozy, tworząc miejsce apurynowe/apirymidynowe. Endonukleaza AP rozpoznaje to miejsce i nacina DNA w kierunku 5' od miejsca AP tworząc wolny koniec 3'-OH. Polimeraza DNA, wydłuża nić DNA od wolnego końca 3'-OH wykorzystując aktywność egzonukleazy do zastąpienia nukleotydu z uszkodzoną zasadą oraz kilku następnych. Następnie nowa nić jest łączona ze starą za pomocą ligazy DNA. O wiele trudniejsze do skutecznej naprawy są uszkodzenia dwuniciowe, zlokalizowane w miejscach komplementarnych. Zasadniczo są tylko dwa mechanizmy biochemiczne umożliwiające dokonanie takich napraw: mechanizm niehomologicznego łączenia końców (NHEJ non homologous end joining) i mechanizm homologicznej rekombinacji (HRR homologous recombination repair). Który z mechanizmów zostanie uruchomiony zależy od fazy cyklu komórki w której działa promieniowanie jonizujące. Jeśli uszkodzenie DNA następuje w fazie S/G2 cyklu komórkowego to mechanizmem naprawczym jest HRR, a rekombinacja bazuje na użyciu chromatydy siostrzanej jako matrycy. Mechanizm ten przebiega stosunkowo wolno ale naprawa jest ale wierna. Jeśli natomiast do uszkodzeń DNA dochodzi w fazie G1 cyklu komórkowego, wówczas uruchamiany jest drugi mechanizm naprawczy: NHEJ. Zgodnie z nim następuje sklejanie wolnych końców DNA po ich wcześniejszym nadtrawieniu enzymatycznym. Proces ten przebiega

18 stosunkowo szybka jednak skuteczność jego jest niewielka. Jak więc widać każde uszkodzenie materiału biologicznego stwarza mniejsze lub większe problemy dla wewnątrzkomórkowych mechanizmów naprawczych mogące prowadzić do błędnych napraw. Nieskuteczne naprawy punktowych, izolowanych uszkodzeń DNA mogą mieć swoje przełożenie na produkowane przez komórkę białka. W tym aspekcie możemy więc wyróżnić kilka rodzajów mutacji. Mutacje synonimowe, w których punktowe uszkodzenie DNA prowadzi do zamiany jednego kodonu (triplet nukleotydów kodujący określony aminokwas) na inny kodujący również ten sam aminokwas. Stąd też taka mutacja nie wpływa na szlaki metaboliczne i z poziomu produkowanych przez komórkę białek jest niewykrywalna. Mutacje zmieniające sens w wyniku działania promieniowania jonizującego następuje zmiana sekwencji nukleotydów w kodonie, prowadząca do biosyntezy innego aminokwasu niż pierwotny. Skutkuje to zmianami produkowanych przez komórkę białek i wpływa na przebieg szlaków metabolicznych. Wpływ ten może prowadzić do upośledzenia, w większym lub mniejszym stopniu, przebiegu wewnątrzkomórkowych przemian biochemicznych gdy nowe białka enzymatyczne mają zbliżoną strukturę przestrzenną do białek właściwych lub ich całkowitego zablokowania gdy ta struktura znacząco się różni. W pierwszym przypadku mówimy o mutacji konserwatywnej, w drugim o non-konserwatywnej. Innym skutkiem tego typu mutacji może być uruchomienie całkiem nowych dla komórki szlaków metabolicznych, których produkty mogą być cytotoksyczne. Mutacje non-sensowne, zmiany dotyczą sekwencji nukleotydów w obszarach intronowych, a więc nie wpływają bezpośrednio na rodzaj produkowanych białek. Mutacje tego typu mogą objawiać się zaburzeniem cyklu komórkowego czy ekspresji genów. Ekspozycja na promieniowanie jonizujące prowadzić może także do bardziej rozległych zmian w materiale genetycznym obejmującym zespoły genów. Takie zmiany zwane aberracjami chromosomowymi dotyczą przemieszczenia dużych fragmentów DNA w obrębie jednego chromosomu lub między chromosomami. Stany takie można wizualizować metodą FISH przez zastosowanie sond fluorescencyjnych, co przedstawiono na rysunkach.

19 Każdy chromosom znakowano swoistą dla niego sondą fluorescencyjną dającą określoną barwę. Chromosomy z przemieszczonymi fragmentami DNA wybarwione są na rożne kolory (kolor fragmentu DNA odpowiada kolorowi chromosomu, z którego pochodzi). Dodatkowo metoda ta pozwala również obrazować różnego rodzaju zaburzenia budowy morfologicznej chromosomu: brak centromeru, budowa pierścieniowa, dwa centromery. Z punktu widzenia ciągłości zachowania informacji genetycznej przy podziale mitotycznym komórki, aberracje możemy podzielić na stabilne i niestabilne. Te pierwsze to translokacje, które prowadzą do utrwalenia zmienionej informacji genetycznej. Komórka może wchodzić w mitozę, a zmodyfikowany materiał genetyczny jest prawidłowo dzielony pomiędzy komórki potomne, gdyż morfologicznie chromosom ma prawidłową budowę. Inaczej wygląda sytuacja w przypadku aberracji chromosomowych niestabilnych. Zaliczamy do nich aberracje prowadzące do powstawania chromosomów acentrycznych, dicentrycznych i pierścieniowych. Zaburzenie prawidłowej morfologii chromosomu (brak lub nadmiar centromerów) powoduje utratę, w trakcie podziału mitotycznego, części informacji genetycznej, w zakresie genów na nim zlokalizowanych. Schemat powstawania takich aberracji przedstawiono na rysunku.

20 Promieniowanie jonizujące powoduje pęknięcie ramienia chromosomu w wyniku czego materiał genetyczny może ulec przemieszczeniu do innego chromosomu. W efekcie możemy otrzymać chromosomy z translokowanymi fragmentami DNA lub chromosomy dicentryczne z fragmentami acentrycznymi. Utrata materiału genetycznego w trakcie procesu mitozy, związana z niestabilnymi aberracjami chromosomowymi skutkuje pojawieniem się w komórkach potomnych (jednej lub obu - w zależności od ilości traconych fragmentów DNA) tzw. mikrojader popromiennych.

21 Jak widać na schemacie, w trakcie podziału mitotycznego, chromatydy siostrzane z chromosomów o prawidłowej budowie morfologicznej (jeden centromer) przesuwane są do dwóch przeciwstawnych biegunów, tworząc dwie równoważne pule informacji genetycznej dla potomnych komórek. W sytuacji gdy chromosomy mają zaburzoną morfologię (fragmenty acentryczne, dicentryki, chromosomy pierścieniowe) ich ruch w kierunku biegunów jest niemożliwy, a zgromadzona na nich informacja genetyczna jest tracona. Po podziale cytoplazmy uszkodzone fragmenty DNA otaczają się błoną komórkową tworząc tzw. mikrojądra. Należy pamiętać, że mikrojądra mogą również pojawiać się w komórkach spontanicznie, a czynnikiem sprzyjającym zwiększonej częstości ich występowania może być np. dym tytoniowy lub etanol. Tym niemniej mikrojadra popromienne w przeciwieństwie do tych spontanicznych w swoim wnętrzu zawierają fragmenty DNA. Uszkodzenia materiału genetycznego w wyniku ekspozycji układu biologicznego na promieniowanie jonizujące, a szczególnie powstawanie aberracji chromosomowych oraz mikrojąder popromiennych pozwoliło na wypracowanie cytogenetycznych metod oceny wielkości ekspozycji w przypadku jej niekontrolowanego przebiegu. POZIOM KOMÓRKOWY Życie komórki przebiega według stałego schematu zwanego cyklem komórkowym, zgodnym z zapisem genetycznym i regulowane jest odpowiednimi białkami, których synteza uzależniona jest od prawidłowej ekspresji genów regulatorowych. W cyklu komórki wyróżnia się kilka faz zgodnie ze schematem. Źródło: Solomon, Berg, Martin, Ville, "Biologia", Warszawa 2000 Komórki, które są w stanie spoczynku, znajdują się w fazie G 0. Każde pobudzenie takich komórek do proliferacji zapoczątkowuje zachodzące w nich ściśle określone i uporządkowane chronologicznie przemiany wewnątrzkomórkowe zgodnie z fazami:

22 G 1, S, G 2 i M. Są dwie zasadnicze przerwy w przebiegu cyklu: przed rozpoczęciem replikacji DNA oraz przed wejściem w mitozę. Każda z tych przerw jest niezbędna komórce do sprawdzenia: spójności materiału genetycznego oraz rezerw energetycznych i substratowych niezbędnych do prawidłowego przeprowadzenia zaprogramowanych przemian biochemicznych. Tym niemniej jeśli zachodzi konieczność komórka jest w stanie wstrzymać cykl komórkowy na każdym jego etapie poza mitozą w celu dokonania napraw. Jednym z czynników wstrzymujących cykl komórkowy jest promieniowanie jonizujące. Czas przerwy jest zależny od wielkości ekspozycji. Duże dawki promieniowania są w stanie całkowicie wstrzymać przebieg cyklu komórkowego a nawet zniszczyć komórkę poprzez trwałe zaburzenie jej równowagi wodno-elektrolitowej lub przerwanie ciągłości błony komórkowej. Radiowrażliwość komórki w poszczególnych fazach cyklu jest zróżnicowana. Jak wynika ze schematu największą radiowrażliwość przejawiają komórki znajdujące się w fazie G 2 oraz M. Chromatyna w fazie G 2 jest silnie skondensowana stąd wszelkie jej uszkodzenia obejmują rozległe obszary. Dodatkowo dostęp czynników naprawczych do miejsc występowania uszkodzeń DNA jest znacząco ograniczony.

23 W przypadku fazy M, nie może jej przebieg być wstrzymany, stąd na naprawę popromiennych uszkodzeń komórce brakuje po prostu czasu. Fazami, w których komórka przejawia mniejszą wrażliwość na działanie promieniowania jonizującego jest faza spoczynkowa G 0 oraz późna faza S. Późna faza S charakteryzuje się podwojonym materiałem genetycznych (2 komplety chromosomów) i rozluźnioną chromatyną, stąd łatwy dostęp enzymów naprawczych do miejsc uszkodzonych, a głównym mechanizmem naprawczym jak już wcześniej wspominano jest mechanizm HRR o bardzo dobrej skuteczności. Prześledźmy zachowanie się komórki poddanej ekspozycji na promieniowanie jonizujące. Jak już wspominaliśmy pierwszym objawem stresu popromiennego jest zatrzymanie cyklu komórkowego. W tym czasie komórka uruchamia mechanizmy przeciwdziałające uszkodzeniom tzw. wymiatacze wolnych rodników (WWR) czy reaktywnych form tlenu (ROS) o których już wcześniej wspominano. W dalszej kolejności uruchamiane są mechanizmy rozpoznawcze, których zadaniem jest stwierdzenie powstałych uszkodzeń, głównie w zakresie materiału genetycznego. Mechanizmy te stymulują produkcję właściwych białek enzymatycznych wchodzących w skład odpowiednich układów naprawczych. Możemy mieć więc do czynienia z dwoma zasadniczymi sytuacjami rzutującymi na dalsze losy komórki. Pierwsza sytuacja dotyczy przypadków, gdy promieniowanie jonizujące nie spowodowało żadnych, istotnych dla funkcjonowania komórki uszkodzeń, bądź powstałe uszkodzenia zostały skutecznie naprawione. Komórka funkcjonuje prawidłowo, pełniąc swoją dotychczasową role w organizmie a jedynym obserwowanym skutkiem promieniowania jonizującego jest podwyższone stężenie czynników układów WWR i ROS oraz enzymów naprawczych. Druga sytuacja dotyczy nieskutecznych lub niepełnych napraw popromiennych uszkodzeń. Naturalną konsekwencją takiego stanu rzeczy jest skierowanie takiej komórki na drogę śmierci apoptycznej. Strażnikiem cyklu komórkowego jest białko p53, którego produkcja stymulowana jest obecnością czynników genotoksycznych, w tym promieniowaniem jonizującym i powstającymi w wyniku ich działania uszkodzeniami w DNA.

24 Wzrost stężenia tego białka jest sygnałem dla komórki do spowolnienia lub zatrzymania jej cyklu komórkowego. Równocześnie białko to stymuluje układy odpowiedzialne za aktywację właściwych białek enzymatycznych. Naprawa uszkodzeń wygasza szlaki sygnałowe działając supresyjnie na ekspresję odpowiedzialnych za nie genów. Brak skutecznej naprawy uruchamia z kolei mechanizm zaprogramowanej śmierci komórkowej. Ma to na celu zapobieżenie utrwaleniu uszkodzeń genetycznych i przekazaniu błędnej informacji genetycznej komórkom potomnym. Jak widać sterowanie cyklem komórkowym jest skomplikowanym układem wzajemnych relacji czynników komórkowych opartych na sprzężeniu zwrotnym dodatnim lub ujemnym. Dysfunkcja tego układu, np. mutacje genów dla białek regulatorowych lub sygnałowych, mogą zaburzyć prawidłową regulację cyklu komórkowego, w tym również procesu apoptozy. Taka dysfunkcyjna komórka ze zmutowanym DNA może przekształcić się w dalszej kolejności w komórkę potencjalnie nowotworową rozpoczynając proces onkogenezy. Mamy więc 3 podstawowe drogi zachowania się komórki u której materiał DNA został uszkodzony w wyniku ekspozycji na promieniowanie jonizujące.

25 KOMÓRKA PRAWIDŁOWA SKUTECZNA NAPRAWA USZKODZONEGO DNA - BRAK ZMIAN W MATERIALE GENETYCZNYM APOPTOZA NIESKUTECZNA NAPRAWA USZKODZONEGO DNA CYKL KOMORKOWY PRAWIDŁOWY USZKODZONE DNA KOMÓRKA ZMUTOWANA NIESKUTECZNA NAPRAWA USZKODZONEGO DNA CYKL KOMORKOWY ZABURZONY Jak widać nieskuteczna naprawa uszkodzonego DNA może skutkować zarówno śmiercią komórkową jak i utrwaleniem takich uszkodzeń. Istnieje kilka form śmierci komórkowej. W każdym momencie cyklu komórkowego może dojść do śmierci komórki. Mówimy wtedy o śmierci interfazalnej czyli występującej pomiędzy podziałami mitotycznymi. Najbardziej korzystną śmiercią interfazalną, patrząc z poziomu ustroju, jest tzw. śmierć zaprogramowana czyli apoptyczna. Nieskutecznie naprawiony materiał genetyczny przy prawidłowo działającym cyklu komórkowym uruchamiają mechanizm prowadzący do likwidacji tak uszkodzonej komórki w sposób czysty. Inny, dość gwałtowny przebieg śmierci komórkowej zachodzi w przypadku nekrozy. Cała zawartość komórki wraz ze wszystkimi enzymami i białkami przedostaje się do przestrzeni międzykomórkowej wywołując w miejscu lokalizacji stan zapalny. Porównanie przebiegu obu rodzajów śmierci interfazalnej przedstawiono na schemacie.

26 W przypadku śmierci nekrotycznej duża dawka promieniowania deponowana w cytoplazmie powoduje utratę zachowania równowagi wodno-elektrolitowej komórki. Powoduje to znaczący wzrost ciśnienia wewnątrzkomórkowego prowadzący do rozerwania błony komórkowej. Cała zawartość komórki przedostaje się do przestrzeni międzykomórkowej aktywując procesy zapalne. Śmierć ta przebiega w sposób bardzo gwałtowny i nieuporządkowany. Przeciwieństwem śmierci nagłej komórki jest śmierć apoptyczna. Przebiega ona w sposób uporządkowany, ściśle według określonego schematu. Rozpoczyna się etapem defragmentacji komórki powstają tzw. ciałka apoptyczne, które w prosty sposób są fagocytowane przez inne komórki. Jak więc widać ta forma śmierci nie manifestuje się żadnym procesem zapalnym. Innym rodzajem śmierci komórkowej jest śmierć mitotyczna. Występuje wówczas, gdy ilość materiału genetycznego komórki jest zbyt uboga i niewystarczająca do uruchomienia mitozy. Należy pamiętać, że śmierć interfazalna w przeciwieństwie do mitotycznej następuje w trakcie tego samego cyklu komórkowego, w którym doszło do ekspozycji komórki na promieniowanie jonizujące. Śmierć mitotyczna może objawić się w pierwszym lub w kolejnym cyklu mitotycznych w zależności od nagromadzenia popromiennych uszkodzeń DNA. Jak więc widać losy komórki ze zmienionym DNA mogą przebiegać w różny sposób. Wynika stąd, że obecność zmutowanej komórki nie jest wystarczającym warunkiem do rozwinięcia pełnoobjawowej choroby nowotworowej. Oprócz możliwości śmierci interfazalnej i mitotycznej, sam proces kancerogenezy wymaga zadziałania szeregu niekorzystnych z punktu widzenia ustroju czynników. Proces nowotworowy jest procesem

27 biologicznie złożonym. Bez wnikania w szczegóły możemy wyróżnić 3 podstawowe etapy rozwoju nowotworu: inicjacja, promocja i progresja. Podstawowym warunkiem zapoczątkowania rozwoju nowotworu jest zajście przetrwałej mutacji genetycznej. Oznacza to, że komórka nie tylko musi zachować zdolność do proliferacji (brak śmierci mitotycznej), ale również oszukać system immunologiczny aby traktował ją jako komórkę prawidłową. Przewiduje się, że na tym etapie muszą zadziałać przynajmniej dwa czynniki mutagenne, w tym jeden w zakresie genów regulatorowych bądź supresorowych. Kolejnym etapem rozwoju nowotworu jest aktywacja onkogenów oraz unieśmiertelnienie zmutowanych komórek poprzez modyfikacje w zakresie genów aktywujących telomerazę. Obecność tego enzymu umożliwia nieskończoną ilość podziałów komórkowych. Jak więc widać zmiany w komórce dotyczą zarówno jej genotypu jak i fenotypu. Na dalszym etapie staje się konieczne efektywne dostarczanie niezbędnych w podziale komórkowym składników, w tym czynników wzrostu. Proces ten zwany neoangiogenezą polega na otaczaniu komórek nowotworowych siecią naczyń krwionośnych i dalszym ich pobudzaniem do podziałów (uwalnianie czynników wzrostowych z nieprawidłowych naczyń krwionośnych i otaczających tkanek). Znaczny rozrost komórek nowotworowych, już cechujących się zmienionym kariotypem, manifestuje się klinicznie, a poprzez inwazję i metastazę rozprzestrzenia się w ustroju. Etap ten zwany progresją kończy proces kancerogenezy. Dotychczas wskazywaliśmy cykl komórkowy, a konkretnie fazę tego cyklu w momencie działania promieniowania jonizującego, jako determinantę radiowrażliwości komórkowej. Innym również dość istotnym zagadnieniem związanym z radiowrażliwością komórkową jest rodzaj komórek poddawanych napromienianiu. Zgodnie z zasadą Bergonié-Tribondeau wrażliwość komórek na działanie promieniowania jonizującego zależy od ich aktywności proliferacyjnej oraz stopnia wyspecjalizowania. Poniżej w tabeli zestawiono radiowrażliowść komórek i tkanek. Komórki Tkanki/Narządy Przykłady komórek r Rozrodcza (gonady) Spermatogonie Macierzyste (spoczynkowe i proliferujące) Krwiotwórcza (szpik kostny) Nabłonkowa (jelita, skóra) Rozrodcza (gonady) Komórki macierzyste szpiku Komórki krypt jelitowych i warstwy podstawnej naskórka Spermatocyty duża (++) Różnicujące się (prekursorowe) (aktywnie proliferujące) Krwiotwórcza (szpik kostny) Nabłonkowa (jelita, skóra) Komórki prekursorowe erytrocytów, limfocytów, granulocytów Komórki warstw pośrednich nabłonka i naskórka b.duża (+++)

28 Zróżnicowane (mogą być pobudzane do proliferacji) Zróżnicowane Śródbłonki nacz. krwionośnych Narządy miąższowe Tkanki łączne Nerwowa Krew obwodowa Nabłonkowa (jelita, skóra) Kom. endotelialne naczyń Kom. śródmiąższowe nerek, wątroby, gruczołów Osteocyty, chondrocyty, kom. mięśniowe Kom. OUN i obwodowego układu nerwowego Granulocyty, erytrocyty Komórki powierzchni nabłonka i naskórka średnia/ mała (+/-) mała/ b.mała (-) Jak widać na podstawie tabeli, komórki prekursorowi są najbardziej radiowrażliwymi komórkami w organizmie, co związane jest z dużą częstością mitoz którym podlegają oraz niską ich specjalizacją. W dalszej kolejności szeregu radiowrażliwości znajdują się komórki macierzyste, które jedynie okresowo stymulowane są do podziałów mitotycznych i w tych momentach wykazują identyczna radiowrażliwość co komórki prekursorowe. Szereg ten zamykają komórki wysoko zróżnicowane pozostające stale w fazie G 0 cyklu komórkowego. POZIOM USTROJOWY Skutki dotyczące całego ustroju, który został poddany ekspozycji na promieniowanie jonizujące ujawniają się w ostatniej kolejności. Są one bezpośrednią konsekwencją zmian obserwowanych na poziomie komórkowym, a pośrednio zaistniałych na poziomie molekularnym. Uproszczony łańcuch zdarzeń w układzie biologicznym narażonym na działanie promieniowania jonizującego przedstawiono na rysunku

29 Konsekwencje ekspozycji dla ustroju Zarówno zależą od wielu czynników. W dużym uproszczeniu możemy podzielić je na czynniki związane z warunkami ekspozycji oraz czynniki związane z eksponowanym układem biologicznym. Do tej pierwszej grupy możemy zaliczyć rodzaj promieniowania, jego natężenie czy czas ekspozycji. Generalnie możemy powiedzieć, że czynniki sprzyjające wzrostowi aktów oddziaływania promieniowania z molekułami układu biologicznego zwiększać będą prawdopodobieństwo wystąpienia radiogennych objawów ustrojowych i ich nasilenie. Z drugiej strony nie można zapominać o mechanizmach przeciwdziałających i naprawczych, których duża wydajność i efektywność zmniejszać będzie konsekwencje działania promieniowania jonizującego na poziomie ustrojowym. Jak już wspomnieliśmy los komórki eksponowanej na promieniowanie jonizujące może rzutować na cały organizm. Poniżej przedstawiono jakich skutków popromiennych można się spodziewać po zaistniałych na poziomie komórkowym zmianach.

30 PROMIENIOWANIE WYSOKA DAWKA ŚMIERĆ NEKROTYCZNA NAPRAWA DNA EFEKT SOMATYCZNY BEZBŁĘDNA BŁĘDNA KOMÓRKA PRAWIDŁOWA KOMÓRKA Z USZKODZONYM DNA BRAK EFEKTU MIKROJĄDRA NIESTABILNE ABERACJE ŚMIERĆ MITOTYCZNA EFEKT SOMATYCZNY ŚMIERĆ APOPTYCZNA STABILNE ABERACJE MUTACJE BRAK EFEKTU TOR MUTACYJNY X Y KOMÓRKI ROZRODCZE EFEKT KANCEROGENNY EFEKT GENETYCZNY Jak widać na podstawie tego schematu los komórki uszkodzonej promieniowaniem jonizującym determinuje efekt biologiczny obserwowany na poziomie ustrojowym. W przypadku efektu genetycznego czy kancerogennego objawy ustrojowe mogą być skutkiem zmian pojedynczej komórki natomiast efekty somatyczne wymagają właściwej skali uszkodzeń. Poniżej przedstawiony schemat obrazuje szlaki uszkodzeń popromiennych i ich wpływ na funkcję ustroju.

31 POCHŁONIĘCIE ENERGII BRAK SKUTKÓW ZMIANY W MAKROCZASTECZKACH (DNA, BŁONY KOMÓRKOWE) BRAK SKUTKÓW NAPRAWA USZKODZEŃ NIESKUTECZNA SKUTECZNA BRAK SKUTKÓW MUTACJE ŚMIERĆ KOMÓRKI KOMÓRKI KOMÓRKI DUŻA LICZBA KOMÓREK POJEDYNCZE ROZRODCZE SOMATYCZNE MACIERZYSTYCH KOMÓRKI I CZYNNOŚCIOWYCH WADY WRODZONE CH. DZIEDZICZNE BIAŁACZKI NOWOTWORY OBJAWY KLINICZNE OSTRE BRAK SKUTKÓW PRZEWLEKŁE Zdefiniujmy sobie używane pojęcia dotyczące opisu skutków jako efektów działania promieniowania jonizującego na organizm: Skutki somatyczne wszelkiego rodzaju dysfunkcje organizmu objawiają się u osobników poddawanych ekspozycji na promieniowanie jonizujące. Skutki somatyczne są spowodowane masywnymi uszkodzeniami komórek budującymi określone tkanki (tzw. efekt skali) bądź defektami pojedynczych komórek jak np. w przypadku rozwoju nowotworu. Nasilenie skutków somatycznych jest uwarunkowane zarówno przez rodzaj, sposób i formę aplikacji promieniowania jak i wrażliwość osobniczą. Skutki somatyczne mogą objawiać się krótko po zaistnieniu ekspozycji tzw. skutki wczesne, jak też na manifestacje ich objawów musimy czekać długi okres czasu tzw. skutki późne. W przypadku człowieka do wczesnych popromiennych skutków somatycznych możemy zaliczyć ostrą chorobę popromienną czy ostre zespoły popromienne, do późnych wszystkie stany przewlekłe, chorobę nowotworową, zaćmę itp. Skutki genetyczne (dziedziczne) zmiany związane z działaniem promieniowania jonizującego objawiają się potomstwa organizmów, które były eksponowane na promieniowanie jonizujące. Może to dotyczyć już pierwszego pokolenia lub kolejnych.

32 Skutki deterministyczne (pewne) występują po przekroczeniu progu czyli dawki pochłoniętej określonej dla danego efektu. Wraz ze wzrostem dawki zwiększa się nasilenie i skraca czas wystąpienia skutków. Przykładem jest ostra choroba popromienna (OChP). Skutki stochastyczne (prawdopodobne) zmiany mogą być indukowane dowolną dawką promieniowania i są efektem zmian w pojedynczych komórkach. Wraz ze wzrostem dawki wzrasta prawdopodobieństwo wystąpienia efektu biologicznego. Przykład nowotwór radiogenny. Poniżej przedstawiono podział skutków popromiennych na deterministyczne i stochastyczne. Jak widać na schemacie wczesne zmiany popromienne mają zawsze przebieg ostry i są zmianami deterministycznymi, czyli do ich wywołania wymagany jest odpowiedni poziom ekspozycji na promieniowanie jonizujące. Późne zmiany popromienne dotyczą zarówno skutków deterministycznych jak i stochastycznych stąd czas manifestacji ewentualnych efektów biologicznych nie może być podstawą do określenia stopnia prawdopodobieństwa ich wystąpienia. Dość istotnym zagadnieniem pozwalającym przewidywać czas wystąpienia ewentualnych zaburzeń w funkcji określonych narządów lub tkanej jest przypisanie ich budowy komórkowej do jednej z dwóch podstawowych grup: elastycznej lub hierarchicznej. U podstaw tego podziału leży częstość mitoz komórek budujących daną tkankę. Przyjmując, że śmierć mitotyczna jest głównym rodzajem śmierci komórkowej a odczyny tkanek są wynikiem takiej śmierci. Tkanki elastyczne charakteryzują się powolną odnową biologiczną, czyli częstość mitoz jest nieznaczna. Stąd tkanki takie będą reagować na promieniowanie jonizujące ze znacznym opóźnieniem, zależnym od szybkości