Prof. dr hab. Krzysztof Lewiński Kraków, Wydział Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego

Transkrypt

1 Prof. dr hab. Krzysztof Lewiński Kraków, Wydział Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego Recenzja rozprawy doktorskiej mgr. Michała Mietusa "Strukturalna i biochemiczna charakterystyka mechanizmu rozpoznawania substratowego DNA przez rdzeń katalityczny nukleazy Rad2" DNA zawarte w komórkach żywych organizmów narażone jest ustawicznie na działanie czynników mogących powodować jego uszkodzenie. Do takich czynników należy między innymi promieniowanie ultrafioletowe. Uszkodzenia DNA mogą powodować zarówno zmianę zakodowanej informacji jak też wpłynąć na proces jej odczytu, co może prowadzić do upośledzenia funkcji komórki, a w konsekwencji doprowadzić do jej śmierci lub powstania nowotworu. Aby temu zapobiec, powstały mechanizmy rozpoznawania nieprawidłowości i naprawy DNA przez grupy specyficznych białek, do których należy białko Rad2 będące przedmiotem badań przedstawionych w rozprawie. Celem przeprowadzonych badań było zbadanie mechanizmu specyficzności substratowej drożdżowej endonukleazy Rad2 w tworzeniu kompleksu z DNA oraz wyjaśnienie związku pomiędzy mutacjami jego ortologu, ludzkiego białka XPG, a występowaniem choroby genetycznej o nazwie skóra pergaminowa. Badania zostały wykonane w Laboratorium Struktury Białka Międzynarodowego Instytutu Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie pod kierunkiem dr hab. Marcina Nowotnego. Rozprawa liczy nieco ponad 100 stron. Jej głównymi elementami są: Wstęp, opis metodyki (Materiały i Metody) i Wyniki. Rozprawę zamyka Dyskusja oraz obszerna, licząca blisko sto pozycji, 1

2 starannie opracowana Bibliografia. Rozprawa zawiera ponadto spis skrótów oraz krótkie streszczenia w języku polskim i angielskim. Materiał eksperymentalny przedstawiony w rozprawie jest bardzo obszerny. Obejmuje on kolejno: przygotowanie plazmidów dla wariantów białka dzikiego szczepu, białka z delecją C-terminalnej części (ΔP), białka z delecją domeny separatora (ΔS) oraz z obiema delecjami (ΔSP) mutagenezę przy użyciu PCR przygotowanie bakterii kompetentnych i ich transformację hodowlę bakterii i izolację białka oraz jego oczyszczanie przy użyciu chromatografii jonowymiennej oznaczanie aktywności enzymatycznej krystalizację kompleksów Rad2 z DNA pomiary dyfraktometryczne na synchrotronie rozwiązanie i udokładnienie struktur Doktorant otrzymał kryształy i wyznaczył struktury krystaliczne pięciu kompleksów wariantu ΔSP białka Rad2 z DNA, jedna ze struktur ze względu na niską rozdzielczość nie była szczegółowo analizowana. Przeprowadził też próby krystalizacji kompleksów białka typu dzikiego oraz wariantu ΔP jak również innych kompleksów wariantu ΔSP, ale w pracy nie ma wzmianki o tym, aby zakończyły się one sukcesem. Otrzymane struktury były bazą do analizy oddziaływań pomiędzy białkiem i kwasem nukleinowym i posłużyły do zaproponowania mechanizmu specyficzności substratowej nukleazy Rad2. Ponadto, zostały wykorzystane do analizy wpływu chorobotwórczych mutacji w ludzkim białku XPG na działanie tego białka. Porównano też wyznaczoną strukturę białka Rad2 z dostępnymi w PDB strukturami ludzkich białek EXO1 i FEN1 mającymi inną specyficzność substratową i wyjaśniono strukturalne podłoże tych różnic. Wyniki przedstawione w rozprawie stały się już przedmiotem publikacji w prestiżowym Nucleic Acids Research (2014, Vol.42, No. 16, ), czasopiśmie o znakomitej renomie potwierdzonej m.i. przez wysoki współczynnik oddziaływania IF wynoszący około 8,8. Stawia to mnie jako recenzenta w sytuacji zarówno dobrej jak też kłopotliwej. Z jednej strony potwierdza to moją opinię, że opisane w rozprawie eksperymenty są na bardzo wysokim poziomie naukowym a wnioski przedstawione w rozprawie są prawidłowe, z drugiej jednak strony zarzuty merytoryczne podważałyby pozytywną opinię ekspertów i redakcji czasopisma. Na szczęście takich zarzutów nie 2

3 mam a moje uwagi krytyczne dotyczą głównie zagadnień formalnych i odnoszą się wyłącznie do treści rozprawy a nie publikacji. Pierwsza uwaga dotyczy relacji pomiędzy rozprawą a publikacją, która jest wieloautorska. Pan Miętus jest w tej publikacji pierwszym autorem co jednoznacznie wskazuje na jego wiodącą rolę w realizacji badań, jednak cała rozprawa jest pisana w formie bezosobowej i nie jestem w stanie ocenić, jaki był wkład poszczególnych współautorów. Oceniając szczegółowość opisów zawartych w rozdziale Materiały i Metody, mogę jedynie przypuszczać, że wiodąca rola doktoranta związana była głownie z otrzymaniem wariantów białka Rad2 i jego kompleksów z DNA, natomiast jego udział w badaniach krystalograficznych był mniejszy. Nie należy tej uwagi traktować jako zarzutu, jednak powinno to zostać wyjaśnione w trakcie obrony. Kolejna uwaga również odnosi się do kwestii formalnej. W rozprawie zamieszczona jest informacja, że doktorant był stypendystą Fundacji na rzecz Nauki Polskiej w ramach programu Międzynarodowych Projektów Doktoranckich. Prace realizowane w ramach MPD są wykonywane w ośrodku macierzystym i zagranicznym, zwykle z udziałem zagranicznego ko-promotora. Nie znalazłem w rozprawie żadnych informacji związanych z takim modelem realizacji pracy. Wymienione powyżej uwagi mają charakter formalny związany z okolicznościami powstawania rozprawy, natomiast kolejne będą odnosić się do jej treści. Rozprawa zawiera znaczną ilość błędów o różnej wadze, od prostych błędów typograficznych aż po błędy, które uważam za merytoryczne, a które powstały przypuszczalnie również przez nieuwagę. Zagadnienia związane z procesem rozwiązywania i udokładniania struktur nie zostały moim zdaniem wystarczająco opisane lub też opis jest tak skąpy, że nie wyjaśnia niczego. Poniżej skupię się tylko na wybranych zagadnieniach pomijając ze względu na ich znaczną liczbę, oczywiste pomyłki w pisowni wyrazów. Spis skrótów jest sporządzony w kolejności ich występowania a nie alfabetycznie, co ułatwiłoby korzystanie z niego str. 46: odnośnik do strony programu XDSAPP jest nieprawidłowy str. 47: odnośnik do strony programu OligoAnalyzer jest nieprawidłowy str. 69: Na czym opiera się stwierdzenie Nie wykorzystywano białka z drożdży bo założono, że próby krystalizacji zostały już podjęte przez inne zespoły? str. 74: Zdanie Aby rozwiązać strukturę krystaliczną makromolekuły, niezbędne są informacje o amplitudzie i fazie każdej z fal elektromagnetycznych, ugiętych na sieci przestrzennej kryształu zdecydowanie wymaga rozwinięcia i trudno je uznać za prawidłowe 3

4 str. 75: Co to są fale rentgena Brak jest informacji o rozmiarach kryształów użytych do pomiaru oraz średnich rozmiarach kryształów uzyskiwanych w wyniku krystalizacji. Szkoda też, że nie zamieszczono zdjęć otrzymanych kryształów. W opisach struktur powtarza się nieprawidłowo Komórka elementarna zawierała, podczas gdy chodzi o zawartość asymetrycznej części komórki W Tabeli 4.3 dla wszystkich kompleksów wartość wskaźnika R work jest różna od wartości zawartej w Protein Data Bank, podczas gdy zgadza się wartość R free W Tabeli 4.3 dla kompleksu I podano nieprawidłowo wartość kąta γ oraz zakresu rozdzielczości dla pełnego zbioru W Tabeli 4.3 dla kompleksu IV nieprawidłowo podano zakres rozdzielczości (brak przecinka dziesiętnego), dziwi mnie kompletność całkowita niższa od kompletności w zakresie najwyższej rozdzielczości Termin Krotność pomiaru użyty w opisie Tabeli 4.3 zamiast redundancja wydaje mi się mylący Termin Współczynnik temperaturowy w opisie Tabeli 4.3 jest nieprawidłowy, powinien być użyty czynnik przemieszczenia str. 78: kolejna nieco inna wartość R work str. 85: nieprawidłowy symbol grupy przestrzennej kryształów kompleksu III str. 87: Nie zgadzam się ze stwierdzeniem, że kryształy dostarczyły 10 niezależnych rozwiązań struktury. Doktorantowi chodzi zapewne o 10 symetrycznie niezależnych protomerów występujących w strukturach. Tymczasem, tylko w przypadku kompleksu I mamy do czynienia z niezależnym wyznaczeniem struktury metodą SAD, natomiast w pozostałych kompleksach stosowano model uzyskany właśnie z tej pierwszej struktury, nie są to zatem rozwiązania niezależne. W całej pracy długość fali jest oznaczana znakiem odwróconego igreka (ʎ) zamiast greckiej litery lambda (λ) str. 101: Zdanie...cztery struktury krystaliczne [...] które rozwiązano w różnych grupach przestrzennych sugeruje, że w oparciu o jeden pomiar uzyskano cztery alternatywne rozwiązania o różnych symetriach str. 107: Zadanie Jony manganu wymagają mniej precyzyjnej koordynacji w porównaniu do jonów magnezu nie jest jednoznaczne str. 32 nazwy organizmów powinny być pisane z dużej litery i kursywą str. 80 i inne: razi mnie określenie zdeponowane w PDB pod identyfikatorem 4

5 Jak już wcześniej wspomniałem, przedstawione powyżej uwagi nie wpływają na wartość merytoryczną rozprawy a związane są w większości ze starannością jej przygotowania, jednak obowiązkiem recenzenta jest ich wytknięcie. Cel badawczy postawiony na wstępie został zrealizowany w całości. Imponująca jest liczba wykonanych eksperymentów i ich wysoki poziom naukowy. Stanowią one oryginalne rozwiązanie problemu naukowego a wnioski wysnute w oparciu o wyniki badań wnoszą istotne elementy nowości naukowej i stwarzają perspektywy dalszych interesujących prac. W świetle powyższego, uważam, że rozprawa spełnia warunki określone w art. 13 ustawy z dnia 14 marca 2003 w stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. z 2003 r., nr 65 poz. 595 z późniejszymi zmianami) i z pełnym przekonaniem stawiam wniosek o dopuszczenie pana mgr Michała Miętusa do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Równocześnie, biorąc pod uwagę zarówno rozległość przeprowadzonych eksperymentów jak też bardzo wysoki poziom merytoryczny rozprawy potwierdzony publikacją w znakomitym czasopiśmie, wnoszę o wyróżnienie rozprawy. prof. dr hab. Krzysztof Lewiński 5