Prof. dr hab. Joanna Trylska tel: (22) Rada Naukowa Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk

Transkrypt

1 ul. S. Banacha 2c, Warszawa TEL.: , FAX: , sekretariat@cent.uw.edu.pl Warszawa, 27 lipca 2018 Prof. dr hab. Joanna Trylska joanna@cent.uw.edu.pl tel: (22) Rada Naukowa Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk Recenzja rozprawy doktorskiej mgr inż. Ilony Foik pt. "Nowe inhibitory metylotransferaz RNA odpowiedzialnych za bakteryjną oporność na antybiotyki" Przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska mgr inż. Ilony Foik zatytułowana "Nowe inhibitory metylotransferaz RNA odpowiedzialnych za bakteryjną oporność na antybiotyki" przedłożona Radzie Naukowej Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk została wykonana pod kierunkiem prof. dra hab. Janusza Bujnickiego oraz promotora pomocniczego dr Elżbiety Purty. Celem pracy było doświadczalne przetestowanie nowych inhibitorów metylotransferaz rybosomowego RNA (o nazwach ErmC', KamB i NpmA) wytypowanych komputerowymi metodami przesiewowymi w Laboratorium Bioinformatyki i Inżynierii Białka. Metylotransferazy to enzymy, które przenoszą grupę metylową z donora (przeważnie S-Adenozylo- L-metioniny, tzw. SAM) na akceptor - białko, czy zasadę azotową w RNA lub DNA. Autorka rozprawy zajmowała się metylotransferazami, które modyfikowały 16S lub 23S RNA w rybosomie. Wiele antybiotyków pełni swoją przeciwbakteryjną rolę poprzez oddziaływanie z kluczowymi miejscami w rrna. Tak więc enzymy, które metylują miejsca wiązania antybiotyków w rrna powodują, że antybiotyki przestają efektywnie oddziaływać z celem. Metylacja rrna jest jednym z mechanizmów obrony bakterii przed działaniem antybiotyków. Aby antybiotyki były skuteczne chcemy więc zapobiec post-transkrypcyjnej modyfikacji rrna przez metylotransferazy bakteryjne poprzez użycie efektywnych inhibitorów tych metylotransferaz. Blokowanie metylotransferaz uniemożliwia przeprowadzenie przez nich metylacji (czyli modyfikacji miejsca działania antybiotyku) i nie zmniejsza efektywności działania antybiotyków. W idealnym przypadku antybiotyk i inhibitor metylotransferazy powinny wykazywać działanie synergii. Rozprawa doktorska mgr inż. Ilony Foik została napisana w języku polskim i składa się z 6 standardowych rozdziałów oraz obszernej bibliografii odwołującej czytelnika do prawie 130 artykułów. Wstęp jest podzielony na kilka podrozdziałów. W pierwszym z nich mgr inż. Ilona Foik opisuje mechanizmy oporności bakterii na antybiotyki. W jednym z mechanizmów oporności uczestniczą metylotransferazy, więc kolejny podrozdział jest poświęcony opisowi różnych metylotransferaz, ich budowy i wymagań substratowych. Autorka zajmowała się metylotransferazą ErmC', która modyfikuje zasadę A2058 w 23S rrna, co skutkuje opornością bakterii na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B. Druga badana przez autorkę metylotransferaza to KamB, która metyluje nukleotyd A1408 w 16S rrna w pozycji N1 zasady

2 azotowej, wywołując oporność na niektóre aminoglikozydy. Trzecia badana metylotransferaza, o nazwie NpmA, także nadaje oporność na aminoglikozydy i też modyfikuje A1408 w pozycji N1, mimo niskiego podobieństwa sekwencyjnego z KamB. W kolejnym podrozdziale Wstępu autorka rozprawy opisuje jak możemy próbować walczyć z opornością bakterii na antybiotyki. W ostatnim podrozdziale opisana jest technika wirtualnego badania przesiewowego oparta na strukturze receptora i na strukturze ligandów. Kolejny krótki rozdział opisuje cel rozprawy. Następna sekcja to Materiały opisane w formie tabel, w których wymieniono odczynniki, plazmidy, enzymy, szczepy bakteryjne, linie komórkowe, podłoża, złoża do oczyszczania białek oraz aparaturę i oprogramowanie używane do badań. W następnym czwartym rozdziale mgr inż. Foik opisuje Metody badań. Na początku każdego podrozdziału podany jest cel danego doświadczenia, co znacznie ułatwia zrozumienie stosowanych metod. Autorka opisuje techniki pracy z DNA, sposoby prowadzenia hodowli bakteryjnych, określanie minimalnego stężenia hamującego (tzw. MIC), którego wyznaczenie pomagało określić zdolność inhibitorów do hamowania aktywności metylotransferaz w hodowlach bakteryjnych. W takich badaniach in vivo porównywano minimalne stężenie hamujące wzrost bakterii po całonocnej hodowli, w obecności inhibitora danej metylotransferazy lub bez inhibitora, dla dwóch szczepów (z plazmidem kodującym określoną metylotransferazę i z kontrolnym plazmidem, który metylotransferazy nie koduje). MIC w przypadku badania efektywności inhibitorów KamB i NpmA był stosowany dla kanamycyny, a w przypadku badania efektywności inhibitorów ErmC' - dla erytromycyny. Autorka opisuje też metody nadekspresji i izolacji metylotransferaz do badań in vitro. Następnie opisuje techniki pracy z RNA, w tym izolację rybosomów oraz ich podjednostek 30S i 50S. W kolejnym podrozdziale opisany jest sposób badania inhibicji reakcji metylacji katalizowanej przez metylotransferazy ErmC', KamB i NpmA. W przypadku metylacji rrna katalizowanej przez ErmC' jako substrat stosowano syntetyczny oligonukleotyd, a w przypadku pozostałych dwóch metylotransferaz była to cała podjednostka 30S. Poziom metylacji substratu określano poprzez stopień inkorporacji trytu. Dla metylotransferazy ErmC', oprócz badania inhibicji reakcji metylacji, mgr inż. Foik badała także oddziaływanie inhibitorów z ErmC', po to by określić model inhibicji, na przykład, czy zaprojektowane inhibitory są kompetycyjne. Dla wybranych związków autorka zbadała także czy są toksyczne dla ludzkiej linii komórek HEK 293. W rozdziale 5 autorka opisuje uzyskane wyniki. Najpierw opisuje badania wykonane dla metylotransferazy ErmC'. W laboratorium prof. Bujnickiego wytypowano metodami komputerowymi 29 związków, których zdolność inhibicji autorka rozprawy weryfikowała doświadczalnie. Są to cząsteczki mniejsze niż erytromycyna ale zawierające pięcio- lub sześcioczłonowe pierścienie oraz w niektórych przypadkach puryny. W pierwszym etapie autorka zbadała zdolność tych związków do hamowania wzrostu komórek E. coli. Jeden ze szczepów zawierał plazmid kodujący metylotransferazę ErmC' i wobec tego był oporny na erytromycynę, a drugi nie. Kilka związków wykazywało działanie anty-metylotransferazowe, choć efekt in vivo nie był imponujący. Tym niemniej uważam te wyniki za bardzo użyteczne, gdyż został przygotowany szczep E. coli, w którym mamy nadekspresję metylotransferazy ErmC' i będzie mógł być wykorzystany do testowania innych związków. W drugim etapie autorka zajęła się sprawdzaniem oddziaływania inhibitorów z izolowaną metylotransferazą oraz sprawdzeniem czy hamują reakcję metylacji. Okazało się, że 22 związki blokowały reakcję metylacji katalizowaną przez ErmC' w stężeniach mikromolowych. Niestety okazało się także, że dużo związków nie było rozpuszczalnych nawet w 10% DMSO. Najlepsze dwa związki o numerach 1 i 28 wykazywały IC 50 ok. 300 i 100 µm. Dla nich sprawdzono więc cytotoksyczność dla komórek HEK 293. Związek numer 1 okazał się toksyczny, a numer 28 obniżał przeżywalność komórek do 58% w porównaniu z kontrolą bez inhibitora. Autorka uznała jednak, że związek numer 28 nadaje się jako związek wiodący i w laboratorium prof. Bujnickiego zaproponowano metodami komputerowymi kolejne 16 związków, które

3 są dostępnymi komercyjnie pochodnymi inhibitora numer 28. Wszystkie badania powtórzono, na komórkach E. coli oraz in vitro. Podsumowując stwierdzono, że dwa inhibitory poprawiły nieco działanie hamujące do IC 50 ok. 100 µm. Niestety ponownie jeden z tych inhibitorów okazał się toksyczny dla komórek HEK 293. Po podsumowaniu badań dla ErmC' autorka wybrała 3-4 związki, dla których sprawdzała powinowactwo i miejsce wiążące w enzymie. Najpierw sprawdzała czy inhibitory mają wpływ na wiązanie substratu RNA do ErmC'. Związek wiodący numer 28 obniżał dwukrotnie powinowactwo wiązania, natomiast obecność pochodnych o nazwach 3s lub 4s, co ciekawe, obniżyło K d oddziaływania substratu RNA z ErmC'. Następnie mgr inż. Ilona Foik sprawdzała model inhibicji - czy jest kompetycyjny czy nie. Przeprowadziła także badania powinowactwa wiązania inhibitorów do ErmC' metodą izotermicznego miareczkowania titracyjnego (ITC) oraz mikrotermoforezy. Drugą mniejszą część wyników, choć równie ważną i pracochłonną, autorka poświęciła dwóm pozostałym metylotransferazom, które modyfikują rrna małej podjednostki rybosomu i tym samym powodują oporność na kanamycynę. Autorka przeprowadziła podobne jak dla ErmC' badania dla metylotransferaz KamB i NpmA. Zaczęła od przedstawienia 30 inhibitorów wytypowanych metodami komputerowymi, które miały blokować działanie zarówno KamB jak i NpmA. Mimo, że te dwa enzymy nie są podobne sekwencyjnie to są podobne strukturalnie, więc wybrano te same związki do badań. Następnie autorka sprawdziła na bakteriach, niosących plazmid kodujący albo KamB albo NpmA, czy związki te obniżają minimalne stężenie hamujące kanamycyny, czyli czy niwelują działanie odpowiednich metylotransferaz. Wiele z nich takie obniżenie wykazywało, nawet o 50%. Jednak były też związki, które hamowały wzrost bakterii bez obecności kanamycyny co świadczy o tym, że nie są specyficzne tylko wobec KamB czy NpmA, ale też wobec innych kluczowych enzymów. Kolejne badania in vitro inhibicji metylacji pokazały, że spośród 30 związków, pięć hamowało reakcję metylacji katalizowaną przez KamB, ale wartości IC 50 były w zakresie od 300 do 1000 µm. Podobna sytuacja wystąpiła dla metylotransferazy NpmA. Przeprowadzono też analizę cytotoksyczności inhibitorów wobec linii komórek ludzkich HEK 293. Niestety wyniki sugerowały toksyczność większości zbadanych inhibitorów sugerującą brak specyficzności wobec bakteryjnych metylotransferaz oraz ich słabą rozpuszczalność. Ostatecznie jako dobry związek wiodący wybrano jeden inhibitor o nazwie KN24. Rozdział 6 poświęcony jest dyskusji. Pierwsza część dotyczy metylotransferazy ErmC'. Opisany jest cały szlak badań przesiewowych. Wyjaśniono dlaczego wybrano miejsce wiązania substratu rrna jako główne miejsce wiążące inhibitora, a nie miejsce wiążące SAM. Powodem było podobieństwo sekwencyjne miejsca wiążącego SAM u innych metylotransferaz, co uniemożliwiłoby znalezienie inhibitora, który by wybiórczo oddziaływał z ErmC' w miejscu wiązania SAM. Jednak po znalezieniu dosyć specyficznego związku wiodącego do miejsca wiązania rrna postanowiono go rozszerzyć o możliwość oddziaływania z miejscem wiążącym SAM, aby poprawić skuteczność blokowania metylacji. Wyjaśniono na podstawie struktur kompleksów pochodzących z dokowania wyniki dotyczące mechanizmu inhibicji - kompetycyjnego i niekompetycyjnego. Przedyskutowano też trudności w określeniu powinowactwa wiązania metodami ITC i mikrotermoforezy. W dyskusji autorka pokusiła się także o wnikliwą i jakościową analizę wyników dotyczącą relacji między strukturą kompleksu przewidzianą metodą dokowania a aktywnością inhibitora. Kolejna część dyskusji dotyczy inhibitorów metylotrasferaz KamB i NpmA oraz badań in vivo i in vitro. W przypadku KamB i NpmA autorka także podjęła próbę powiązania aktywności związków ze strukturą przewidzianego komputerowo kompleksu. Po Dyskusji znajduje się krótkie Podsumowanie wyników rozprawy.

4 Po przeczytaniu rozprawy mgr inż. Ilony Foik zastanowiło mnie kilka kwestii. Chciałabym jednak podkreślić, że stanowią one punkty do dyskusji i nie umniejszają wkładu bardzo dużego pracy włożonego w przeprowadzenie doświadczeń i ich analiz. strona 18, w wymienionych ośmiu nukleotydach, nie ma A2058, która jednak jest opisywana w kolejnym podrozdziale? strona 19, do linkozamidów zaliczamy też pirlimycynę, nie tylko linkomycynę i klindamycynę strona 26, tylko grupy aminowe nadają aminoglikozydom ładunek dodatni, a nie grupy hydroksylowe. Wstęp - przydałoby się wyjaśnienie jak opisywana jest miara podobieństwa tzw. współczynnik Tanimoto, gdyż określenie to pojawia się w wielu miejscach rozprawy W przypadku metylotransferazy ErmC' - czy autorka ma pomysł dlaczego akurat związek zawierający trifluorek działał najlepiej, jeśli nie jest zaangażowany w wiązania wodorowe? Napisano, że może pomagać w odpowiednim umiejscowieniu związku w kieszeni, ale co to znaczy? strona 91 - analiza modelu inhibicji dla ErmC' wskazała, że dwa inhibitory są kompetycyjne, jeden niekompetycyjny, a jeden akompetycyjny, mimo tego, że są to podobne związki. Interesuje mnie co decyduje o takim modelu, czy jest on faktycznie zgodny z przewidywaniami dokowania? K d dla SAM z pomiarów ITC wyniosło 50 µm, a z pomiarów mikrotermoforezy ok. 300 µm. Czy autorka ma pomysł skąd taka różnica i czy są jakieś wcześniejsze dane literaturowe dla SAM, żeby z nimi porównać? Dla skuteczności inhibitorów in vivo powinniśmy obserwować efekt synergii antybiotyk - inhibitor metylotransferazy. Zwykle mierzy się to tzw. Fractional Inhibitory Concentration index, FIC. Czy w tym przypadku taki wskaźnik miałby zastosowanie i czy próbowano go wyznaczyć dla najlepszego inhibitora ERmC'? Przedstawione in vivo podstawy określenia synergistycznej wartości MIC dla erytromycyny i inhibitora tak mierzone są raczej zgrubne (str. 106)? str. 112, komentarz dotyczący ITC. Zgadzam się, że do wyznaczenia K d standardowo technika ITC wymaga dużo próbki i żmudnego ustawienia warunków (bufor, kontrole), ale ITC "pracuje" dla mętnych roztworów, więc nie zgadzam się, że wymaga bardzo dobrej rozpuszczalności. Praca zawiera trochę literówek i językowych pomyłek. Nie obniżają one wartości merytorycznej rozprawy jednak wyszczególnię część z nich, z obowiązku recenzenta. Na przykład: - strona 12, podpis pod Ryciną 1.1 powinno być poza komórkę, - strona 13, tytuł podrozdziału powinno być transportu antybiotyku, - strona 14, Rycina 1.2, nie zaznaczono, że schemat dotyczy bakterii Gram ujemnych, - strona 21, Rycina 1.4, brak jednostek przy legendzie kolorów, - strona 26, Rycina 1.6, słaba jakość rysunku struktury drugorzędowej, - strona 26, powinno być grupę metylową, - strona 30, raczej krawędź Hoogsteena a nie brzeg, - strona 30, powinno być Reszty w podpisie obok Ryciny 1.9, - strona 32, powinno być sekwencji,

5 - strona 34, jednostki powierzchni to Å 2 a nie Å, - strona 36, powinno być podjednostki, - strona 74, autorka nie określała siły wiązania tylko powinowactwo wiązania, - strona 92, wielkości takie jak ΔH czy ΔS mają jednostki, inaczej ich podawanie nie ma sensu, - podrozdział bardziej pasuje do Materiałów lub Metod niż do Wyników, - strony 114 i 128 literówka w tytule podsekcji - powinno być strukturą i struktury, - Rycina 6.6 i inne tego typu rysunki wygenerowane programem LigPlot są słabej jakości i nie są czytelne. Wiem, że z tym programem się ciężko pracuje, więc lepiej używać innych np. Maestro. - strona 120, wstawione słowa nie pasujące do zdania, nie zostały usunięte w czasie pisania, - strona 121 powinno być enzymami, - Rycina nie podano w podpisie kodu PDB, Jest też trochę niezręcznych sformułowań, które wyglądają na "kalkę" z języka angielskiego, na przykład miejsce wychwytu antybiotyku (strona 17). Lepiej pewnie miejsca docelowego działania lub wiązania antybiotyku. Przeszukiwanie bazy sekwencją na stronie 23 też nie jest najlepszym sformułowaniem w języku polskim. Elastyczność związku chemicznego też brzmi dziwnie bo nie rozciągamy go raczej, chodzi zapewne o ruchliwość czy dynamikę wewnętrzną. Na stronie 72 autorka napisała, że "Produkt oczyszczano od niewinkorporowanego ATP..." Podsumowując recenzję rozprawy chciałabym jednak podkreślić, że badania doświadczalne przeprowadzone przez autorkę są kompleksowe. Od badań in vivo na komórkach E. coli, poprzez badania in vitro, czyli sprawdzanie hamowania reakcji metylacji dla danego inhibitora, badanie powinowactwa wybranych inhibitorów do enzymu, sprawdzenie miejsca wiązania inhibitora w obrębie metylotransferazy, do badań sprawdzenia cytotoksyczności dla komórek eukariotycznych. Mgr inż. Ilona Foik opanowała mnóstwo technik badawczych. W wielu doświadczeniach przecierała szlaki dobierając warunki co jest żmudnym i trudnym zajęciem. Enzym działa w określonych warunkach, a praca z inhibitorami nie była łatwa ze względu na słabą rozpuszczalność większości z nich. Co ważne autorka podkreśliła ograniczenia testowanych związków i trudności w pracy z nimi. Kilka inhibitorów miało akceptowalną cytotoksyczność dla komórek eukariotycznych. Zwykle w początkowym etapie badań szuka się związku wiodącego, który ma być później modyfikowany, więc uważam, że praca nad tą tematyką zakończyła się sukcesem. Ostatecznie zaprojektowano pierwszy niekompetycyjny wobec SAM inhibitor metylotransferazy ErmC'. Wyniki badań dotyczące metylotransferazy ErmC' zostały opublikowane w bardzo dobrym czasopiśmie - European Journal of Medicinal Chemistry. W przypadku metylotransferaz KamB i NpmA podjęte przez autorkę rozprawy próby znalezienia inhibitorów były pierwszymi dotąd znanymi. Wybrano kilka związków wiodących, które najprawdopodobniej są kompetycyjne wobec SAM, ale mogą stanowić podstawę dalszych badań i wprowadzania modyfikacji. Stwierdzam, że rozprawa doktorska mgr inż. Ilony Foik stanowi oryginalne rozwiązanie problemu naukowego, potwierdza jej ogólną wiedzę teoretyczną w dyscyplinie naukowej oraz umiejętność samodzielnego prowadzenia pracy naukowej. Wobec tego rozprawa doktorska Ilony Pauliny Foik spełnia wszystkie warunki ustawy o tytule naukowym i stopniach naukowych. W związku z tym wnoszę o dopuszczenie jej do dalszych etapów przewodu doktorskiego.