RECENZJA. rozprawy doktorskiej mgr inż. Marii Rutkiewicz

Transkrypt

1 Dr hab. inż. Izabela Madura, prof. PW Katedra Chemii Nieorganicznej Warszawa, 6 września 2019 r RECENZJA rozprawy doktorskiej mgr inż. Marii Rutkiewicz p.t. Badania strukturalne β-d-galaktozydaz z antarktycznych bakterii z rodzaju Paracoccus i Arthrobacter Przedstawiona do recenzji praca doktorska Pani mgr inż. Marii Rutkiewicz została przygotowana na Wydziale Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej pod kierunkiem Pani dr hab. inż. Anny Bujacz, prof. PŁ. W dysertacji przedstawiono wyniki badań strukturalnych dwóch zimnolubnych enzymów z rodziny hydrolaz glikozydowych GH2. Za jeden z głównych celów Doktorantka postawiła sobie określenie struktur krystalicznych słabo scharakteryzowanych strukturalnie zimnolubnych β-d-galaktozydaz w formie natywnej, mutantów i kompleksów z ligandami. Następnie, na podstawie uzyskanych informacji postanowiła podjąć próbę wyjaśnienia mechanizmu reakcji hydrolizy oraz transglikozylacji, a także wywnioskować, dlaczego te enzymy charakteryzują się dużą wydajnością w niskiej temperaturze. Praca przygotowana jest w tradycyjnej formie składającej się z czterech głównych części zawierających wstęp literaturowy, opis metodologii otrzymywania, krystalizacji i badań rentgenostrukturalnych białek, wyników eksperymentalnych oraz dyskusji wyników. Od strony formalnej, rozprawę doktorską mgr inż. Marii Rutkiewicz stanowi 180 stronicowe opracowanie zawierające 65 rysunków i 20 tabel, a bibliografia liczy 143 pozycje literaturowe. Do formy książkowej dołączono reprinty 3 publikacji prezentujących część wyników badań. W pracy znalazły się także wykaz używanych skrótów, spis tabel i rysunków, dorobek naukowy Doktorantki oraz streszczenia w języku polskim i angielskim. Zamieszczono również nazwy rekordów w bazie danych Protein Data Bank (PDB) dla 12 struktur białkowych, których współautorem jest Pani mgr inż. Marii Rutkiewicz. Należy podkreślić, że praca została niezwykle 1

2 starannie przygotowana od strony redakcyjnej, a dbałość o poprawny język i sposób formułowania zdań powodują, że rozprawę czyta się z dużą przyjemnością. Od strony merytorycznej, rozdział zatytułowany Wstęp to 26 stronicowe opracowanie zawierające uporządkowane informacje na temat enzymów zimnolubnych, hydrolaz glikozydowych, oligosacharydów oraz struktur wybranych β-d-galaktozydaz. Każdy podrozdział nakreśla ogólną charakterystykę danego zagadnienia, a następnie bardziej szczegółowo omawiane są pojęcia ściśle powiązane z tematyką badań. Uważam, że świadczy to o wyśmienitym rozeznaniu Doktorantki w temacie przedmiotu oraz o bardzo dobrej umiejętności przedstawiania zasadności podjętych badań, z podkreśleniem ich aspektu praktycznego, dotyczącego m.in. bardziej ekonomicznej produkcji galakto- i heterooligosacharydów. Autorka z dużą starannością przestawiała zagadnienia związane z klasyfikacją i budową β-d-galaktozydaz, zwracając uwagę na rolę informacji pozyskiwanych w wyniku analizy struktur krystalicznych tych enzymów. W podrozdziale 5 Wstępu szczegółowo opisała struktury trzech enzymów odnosząc się do budowy przestrzennej centrum aktywnego, do aktywności katalitycznej i miejsc wiązania substratu. Analizowanymi strukturami enzymów był tetramer LacZ β-d-galaktozydazy z Escherichia coli (EcolβDG), heksamer β-d-galaktozydazy z Arthrobacter C2-2 ArtC2βDG (pierwsza zimnolubna galaktozydaza scharakteryzowana strukturalnie) oraz trimeryczna β-dgalaktozydaza z Rahnella sp. R3. Podkreślone zostało, że różna oligomeryzacja powoduje, że w komplementacji uczestniczą różne fragmenty łańcucha zajmujące inną przestrzeń wokół centrum aktywnego. Kolejny rozdział został zatytułowany Materiały i metody. Znalazł się tu dokładny opis otrzymywania dwóch badanych enzymów (β-d-galaktozydaz z Paracoccus sp. 32d i z Arthrobacter sp. 32cB) z wyraźnym podkreśleniem, że zostały one scharakteryzowane biochemicznie i nadprodukowane przez naukowców z Politechniki Gdańskiej. Jest to zgodne z etyką naukową, a niestety często przez autorów prac doktorskich pomijane. Dla białek tych pokazano także porównania sekwencyjne z najbliższymi homologami wykorzystując do tego celu Bank Danych Białkowych. Następnie Autorka skupiła się na opisie buforów wykorzystywanych w procesie oczyszczania białek, jak również przybliżyła sam proces ze zwięzłym omówieniem wykorzystywanych metod. Najdłuższy rozdział tej części, bo aż 20 stron, został poświęcony metodologii badań struktur białek z wykorzystaniem zjawiska dyfrakcji na monokryształach. Na 2

3 wstępie Doktorantka przedstawiała problemy związane z nieprzewidywalnością procesu otrzymywania monokryształów białek, wskazując, że kluczowym etapem krystalizacji jest utworzenie sieci słabych oddziaływań pomiędzy elastycznymi, często wielodomenowymi makromolekułami. Pani mgr inż. Marii Rutkiewicz przedstawiała też szczegółowy przegląd metod stosowanych w krystalizacji białek. Rozdział 9.2 poświęcony jest zagadnieniu przygotowania próbki monokrystalicznej białka do pomiaru dyfrakcyjnego z wykorzystaniem krioprotekcji. Jest to bardzo zwięzła, a zarazem szczegółowa instrukcja postępowania z monokryształem białka, którą według mnie śmiało można wykorzystać jako instrukcję dla studentów lub nowych adeptów w dziedzinie pomiarów dyfrakcji białek. Również kolejny rozdział, to swego rodzaju instrukcja, w której zostały podane podstawowe informacje na temat promieniowania uzyskiwanego w laboratoryjnych lampach rentgenowskich oraz w synchrotronach, budowy dyfraktometru oraz procesu zbierania danych. Z reguły w pracach doktorskich dotyczących badań monokryształów małych cząsteczek takie informacje uważam za zbędne, zakładając, że doktoranci posiadają ugruntowaną wiedzę na temat teoretycznych podstaw dyfrakcji i pomiarów dyfrakcyjnych. Biorąc jednak pod uwagę kolejne rozdziały w których opisano procedurę redukcji danych, metody rozwiązywania i udokładniania struktur białek można wnioskować, że Doktorantka chciała całościowo przedstawić metodę, która była podstawą jej badań. Trzecim rozdziałem pracy Pani mgr inż. Marii Rutkiewicz jest Część eksperymentalna. Na wstępie przedstawione zostały procedury wykorzystane w procesie doczyszczania białek dzikich ParβDG i ArthβDG oraz mutantów ArthβDG E517Q, ArthβDG E441Q, ArthβDG N440A i ArthβDG D207A, a ich rezultaty zostały przedstawione na odpowiednich chromatogramach. Do określenia stabilności ArthβDG i jej mutantów w danych roztworach buforowych oraz wpływu dodatku soli Doktorantka wykorzystała testy termofluorowe. Zastanawia tylko dlaczego nie przedstawiono wyników takich testów dla białka ParβDG? Następnie podany został opis optymalizacji krystalizacji badanych białek. Rozdział ten jest bogato ilustrowany zdjęciami, a na uwagę zasługuje ogromna liczba przebadanych układów ponad 100 dla każdego białka! Kolejny podrozdział dotyczy opisu otrzymywania kompleksów β-d-galaktozydazy. Jako ligandy Doktorantka wybrała 9 związków będących cukrami prostymi, złożonymi bądź ich pochodnymi. Wybór takich ligandów był związany z celem który sobie postawiła, czyli próbą charakterystyki kieszeni katalitycznej enzymu oraz pokazaniem zmian konformacyjnych zachodzących w niej 3

4 podczas wiązania substratów, produktów przejściowych i produktów niezbędnych w celu wyjaśnienia mechanizmu katalizowanych reakcji. Rozdział 12 zawiera wyniki pomiarów dla 20 kryształów białkowych, co już należy uznać za wybitne osiągnięcie. Dodatkowo należy zauważyć, że białko ArthβDG zawiera ponad 1000 aminokwasów i zaliczane jest do bardzo dużych białek. Pomiary dyfrakcyjne wykonano na synchrotronach PETRA w Hamburgu oraz BESSY II w Berlinie. Skrupulatne eksperymenty krystalizacyjne, a także zastosowane procedury pomiarowe oraz udokładniania struktur pozwoliły Doktorantce uzyskać struktury o bardzo dobrej rozdzielczości. Ostatnią część pracy stanowi Dyskusja wyników. Należy zauważyć, że białko ParβDG jest pierwszą strukturalnie scharakteryzowaną dimeryczną β-d-galaktozydazą z rodziny GH2. Uzyskane przez Panią Marię Rutkiewicz wyniki pozwoliły stwierdzić, że mimo iż analiza sekwencji wskazywała na brak domeny 5, to w strukturze krystalicznej obecnych jest pięć domen. Domena 5 nie ma jednak budowy typowej dla rodziny GH2, gdzie najczęściej występuje w postaci super β- kanapki, tylko jej architektura zbliżona jest do baryłki typu jelly-roll. Analiza uzyskanych struktur krystalicznych wykazała, że dla białka ArthβDG również obserwuje się budowę dimeryczną, z tym że agregacja ta zachodzi pomiędzy monomerami powiązanymi krystalograficzną dwukrotną osią symetrii, podczas gdy w ParβDG dimer jest częścią niezależną komórki elementarnej i posiada taki sam element symetrii, jednakże ta oś dwukrotna nie jest krystalograficzną. Porównanie budowy obu dimerów pozwoliło Doktorantce na opisanie dwóch różnych sposobów tworzenia dimerycznego stanu oligomeryzacji. Natomiast porównanie do białek należących do rodziny GH2 i wykazujących wysokie strukturalne podobieństwo pozwoliło wykazać, że angażowanie skrajnie różnych regionów białek w tworzeniu oddziaływań między monomerami, prowadzi do różnego typu oligomeryzacji. Co więcej, porównanie budowy centrum katalitycznego dla ParβDG i ArthβDG umożliwiło wyjaśnienie dlaczego pierwsze z nich ma znikomą aktywność transglikozylazy, a drugie wykazuje dobrą zdolność tworzenia galakto- i heterooligosacharydów. Skrupulatna analiza porównawcza pozwoliła Doktorantce wykazać, że ArthβDG nie posiada dobrego miejsca wiązania cukrowego akceptora reszty galaktozylowej i dlatego katalizuje reakcję transglikozylacji z umiarkowaną wydajnością. Doktorantka postuluje, że przyszłe badania powinny skupić się na modyfikacjach tego enzymu umożliwiających zwiększenie liczby oddziaływań stabilizujących akceptor reszty galaktozylowej we właściwej pozycji wobec aminokwasów katalitycznych. Zgodnie z założonymi celami i ukierunkowanym eksperymentom 4

5 otrzymywania ArthβDG oraz jego mutantów z substratami, inhibitorem i produktem reakcji Doktorantka dokonała szczegółowej charakterystyki strukturalnej katalizowanej reakcji hydrolizy, wskazała strukturalne aspekty mechanizmu transglikozylacji oraz wykazała, że badany enzym może wykazywać aktywność transglikozylazy z utworzeniem różnorodnych produktów. Dodatkowo, uzyskane wysoko rozdzielcze dane pozwoliły Autorce na określenie prawdopodobnego miejsca allosterycznego enzymu. Drugi ważny cel również został zrealizowany, bo dzięki szczegółowej strukturalnej charakterystyce poszczególnych fragmentów dwóch nowych zimnolubnych β-d-galaktozydaz oraz porównaniu ich do odpowiednich struktur enzymów mezofilnych Doktorantka mogła postulować, że przystosowanie do zimna prawdopodobnie zostało wykształcone przez enzymy należące do rodziny GH2 na drodze niezależnej ewolucji. Na koniec warto wspomnieć o dorobku naukowym mgr inż. Marii Rutkiewicz. Jest ona współautorką 6 publikacji oraz łącznie 12 depozycji struktur w bazie PDB. Trzy z publikacji w czasopismach takich jak Acta Cryst. D, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins & Proteomics, Crystals oraz praca po recenzjach wysłana do International Journal of Molecular Sciences są bezpośrednio związane z wynikami przedstawionymi w dysertacji. Doktorantka jest też współautorką komunikatów konferencyjnych na 17 konferencjach o zasięgu międzynarodowym bądź krajowym. Podsumowując stwierdzam, że przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska mgr inż. Marii Rutkiewicz zatytułowana Badania strukturalne β-d-galaktozydaz z antarktycznych bakterii z rodzaju Paracoccus i Arthrobacter spełnia wszelkie wymagania stawiane pracom doktorskim określone w ustawie o stopniach i tytule naukowym z dnia 14 marca 2003 r. (Dz.U. nr 65 poz. 595 z 2003 r. z późn. zm. Dz.U. nr 164 poz z 2005 r. oraz Dz.U. nr 84 poz. 455 z 2011 r.) i wnoszę o dopuszczenie mgr inż. Marii Rutkiewicz do kolejnych etapów przewodu doktorskiego. Jednocześnie, biorąc pod uwagę bardzo wysoki poziom przedstawionej dysertacji i znaczący dorobek naukowy Doktorantki, zwracam się do Rady Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej o wyróżnienie niniejszej rozprawy. Izabela Madura 5

6 Dr hab. inż. Izabela Madura, prof. PW Katedra Chemii Nieorganicznej Warszawa, 6 września 2019 r WNIOSEK O WYRÓŻNIENIE rozprawy doktorskiej mgr inż. Marii Rutkiewicz p.t. Badania strukturalne β-d-galaktozydaz z antarktycznych bakterii z rodzaju Paracoccus i Arthrobacter Przedstawiona mi do recenzji praca doktorska Pani mgr inż. Marii Rutkiewicz przygotowana pod kierunkiem Pani dr hab. inż. Anny Bujacz, prof. PŁ jest w pełni dojrzałą, przemyślaną pracą naukową. Analiza 20 struktur kryształów białkowych dwóch zimnolubnych enzymów z rodziny hydrolaz glikozydowych GH2 jest już sama w sobie wybitnym osiągnięciem. Należy zauważyć, że białko ParβDG jest pierwszą strukturalnie scharakteryzowaną dimeryczną β- D-galaktozydazą z rodziny GH2. Zgodnie z założonymi celami i ukierunkowanym eksperymentom otrzymywania ArthβDG oraz jego mutantów z substratami, inhibitorem i produktem reakcji Doktorantka dokonała szczegółowej charakterystyki strukturalnej katalizowanej reakcji hydrolizy, wskazała strukturalne aspekty mechanizmu transglikozylacji oraz wykazała, że badany enzym może wykazywać aktywność transglikozylazy z utworzeniem różnorodnych produktów. Drugi ważny cel również został zrealizowany, bo dzięki szczegółowej strukturalnej charakterystyce poszczególnych fragmentów dwóch nowych zimnolubnych β-d-galaktozydaz oraz porównaniu ich do odpowiednich struktur enzymów mezofilnych Doktorantka mogła postulować, że przystosowanie do zimna prawdopodobnie zostało wykształcone przez enzymy należące do rodziny GH2 na drodze niezależnej ewolucji. Należy podkreślić, że praca została niezwykle starannie przygotowana od strony redakcyjnej, a dbałość o poprawny język i sposób formułowania zdań powodują, że rozprawę czyta się z dużą przyjemnością. Ponadto, mgr inż. Marii Rutkiewicz jest współautorką 6 publikacji oraz łącznie 12 depozycji struktur w bazie PDB. Trzy z publikacji w czasopismach takich jak Acta Cryst. D, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins & Proteomics, Crystals oraz praca po recenzjach wysłana do 1

7 International Journal of Molecular Sciences są bezpośrednio związane z wynikami przedstawionymi w dysertacji. Doktorantka jest też współautorką komunikatów konferencyjnych na 17 konferencjach o zasięgu międzynarodowym bądź krajowym. Biorąc pod uwagę bardzo wysoki poziom przedstawionej dysertacji i znaczący dorobek naukowy Doktorantki, zwracam się do Rady Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej o wyróżnienie niniejszej rozprawy. Izabela Madura 2