III. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI KWAŚNEJ FOSFATAZY W HOMOGENACIE Z KIEŁKÓW ROŚLINNYCH

Transkrypt

1 III. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI KWAŚNEJ FOSFATAZY W HOMOGENACIE Z KIEŁKÓW ROŚLINNYCH I. WSTĘP Enzymy są to katalizatory, które zwiększają szybkość reakcji chemicznej, same nie ulegając zmianie. Przy braku enzymów większość reakcji w układach biologicznych zachodzi tak wolno, że są one niezauważalne. Enzymy zwiększają szybkość reakcji nawet 10 7 razy. Enzymy są wysoce specyficzne względem substratów, na które działają i produktów, które tworzą. Jeden enzym katalizuje na ogół pojedynczą reakcję chemiczną lub zestaw ściśle pokrewnych reakcji. W wyniku reakcji katalizowanych przez enzymy rzadko występują reakcje uboczne, prowadzące do nieekonomicznego tworzenia zbędnych produktów. Aktywność enzymatyczna może być regulowana, zmieniając się w zależności od stężenia substratów, produktów, inhibitorów, kofaktorów itp. Niemal wszystkie enzymy, za wyjątkiem rybozymów (cząsteczki RNA o właściwościach katalitycznych), są białkami. Mogą mieć budowę monomeryczną tzn. posiadają jeden łańcuch polipeptydowy lub oligomeryczną są zbudowane z dwóch lub więcej podjednostek będących odrębnymi łańcuchami białkowymi. W wielu przypadkach poza częścią białkową posiadają dodatkowo części nie będące białkami. Takie enzymy o złożonej budowie noszą nazwę holoenzymów (rys. 1). Ich część białkowa to apoenzym, natomiast część niebiałkowa to kofaktor, który może być jonem metalu lub małą cząsteczką organiczną (koenzymem). Rys. 1. Aktywny katalitycznie enzym, zwany holoenzymem, zbudowany jest z części białkowej (aponenzym) i kofaktora, którym może być metal, jon metalu lub koenzym. W zależności od stopnia związania koenzymu z apoenzymem, wyróżniamy kosubstraty i grupy prostetyczne (podział wg Berg, Tymoczko, Stryer. Biochemia. 2005)

2 W zależności od sposobu związania z białkiem enzymu, koenzymy możemy podzielić na grupy prostetyczne lub kosubstraty. Grupa prostetyczna jest ściśle związana z białkiem enzymu (np. układy hemowe, stanowiące centrum katalityczne enzymów oksydacyjno-redukcyjnych), natomiast kosubstrat może występować samodzielnie i łączy się z apoenzymem w trakcie katalizowanej reakcji (np. witaminy i ich pochodne, pochodne nukleotydów). Żadna z części składowych enzymu złożonego nie wykazuje aktywności oddzielnie. Zadaniem kofaktorów jest bezpośrednie oddziaływanie z substratem lub udział we właściwym usytuowaniu substratu w centrum aktywnym, co jest niezbędne do zajścia reakcji enzymatycznej. Niektóre enzymy, katalizujące sprzężone ze sobą reakcje chemiczne, występują w organizmach w formie kompleksów wieloenzymowych KLASYFIKACJA ENZYMÓW W celu ujednolicenia klasyfikacji enzymów, powołana w 1964 roku Komisja Enzymowa (ang. Enzyme Commission) wprowadziła system nazewnictwa enzymów, który dzieli wszystkie enzymy na sześć głównych klas (1 6, tab. 1), opierając się na typie katalizowanych reakcji. Tab. 1. Międzynarodowa klasyfikacja enzymów Klasa Nazwa Typ katalizowanej reakcji Przykład 1 Oksydoreduktazy Utlenianie-redukcja (przenoszenie elektronów) A - + B A + B - Dehydrogenaza mleczanowa Dehydrogenaza alkoholowa 2 Transferazy Przenoszenie grup funkcyjnych A B + C A + B C Kinaza nukleozydomonofosforanowa (kinaza NMP) Heksokinaza 3 Hydrolazy Reakcje hydrolizy (przenoszenie grup funkcyjnych na cząsteczki wody) A B + H 2 O A H + B OH Chymotrypsyna Trypsyna 4 Liazy Utworzenie wiązań podwójnych poprzez dodanie lub usunięcie grup A B A=B + X Y vvvvvvvvvvvv X Y vvvvvvvvvv Fumaraza Dehydrogenaza pirogronianowa 5 Izomerazy Izomeryzacja (przenoszenie grup w obrębie cząsteczki) A B A B vvv X Y Y X Izomeraza triozofosforanowa Izomeraza maleinianowa 6 Ligazy (Syntetazy) Ligacja (połączenie) dwóch substratów (tworzenie wiązań) sprzężone z hydrolizą ATP A + B A B Syntetaza aminoacylo-trna Karboksylaza pirogronianowa Zasady klasyfikacji enzymów znajdują odzwierciedlenie w nadawanych im systematycznych numerach kodowych, złożonych z czterech członów liczbowych oddzielonych od siebie kropkami,

3 poprzedzonych literami EC. Numer klasyfikacyjny jednoznacznie wskazuje określony enzym. Przykładowo numer EC oznacza α-amylazę (jeden z enzymów hydrolizujących skrobię). - Pierwsza cyfra tego enzymu oznacza przynależność do 3 klasy enzymów hydrolaz i charakteryzuje typ reakcji katalizowanej przez ten enzym. - Druga cyfra oznacza podklasę 2, w której znajdują się enzymy działające na związki glikozylowe. - Trzecia cyfra określa pod-podklasę 1 i precyzuje bliżej typ hydrolizowanego wiązania (O-glikozydowe). - Czwarta cyfra jest kolejnym numerem danego enzymu w jego podklasie. W podanym powyżej przykładzie posłużono się nazwą zwyczajową enzymu. Nazwa systematyczna α-amylazy to 1,4-glukanohydrolaza:α-1,4-glukan. Komisja Enzymowa dopuszcza stosowanie nazw potocznych enzymów, zwłaszcza w odniesieniu do enzymów dawno odkrytych np. α-amylazy, trypsyny, chymotrypsyny itp. Często używa się także dwuczłonowych, zwyczajowych nazw enzymów np. oksydaza mleczanowa (EC oksydoreduktaza L-mleczan : tlen). Są one utworzone wg schematu, w którym pierwsza część nazwy pochodzi od rodzaju katalizowanej reakcji i zawsze ma końcówkę -aza, natomiast druga część jest tworzona od nazwy substratu, podanej w formie przymiotnika (końcówka -owa ). W praktyce laboratoryjnej można zetknąć się również z nazwami zwyczajowymi enzymów, które zostały utworzone od nazw ich substratów przez dodanie przyrostka -aza np. rybonukleaza, ureaza, arginaza. Obecnie nie tworzy się nazw enzymów od nazwy substratu. Na ogół używanie potocznych nazw enzymów jest wygodniejsze i powszechnie stosowane w literaturze podręcznikowej, natomiast w pracach naukowych podaje się nazwy systematyczne i numery klasyfikacyjne. Izoenzymy (izozymy) to różne formy enzymu, które katalizują tę samą reakcję, ale wykazują odmienne właściwości fizyczne lub kinetyczne (np. punkt izoelektryczny, optimum ph, powinowactwo do substratu, wrażliwość na inhibitory). MIEJSCE AKTYWNE ENZYMU Miejsce aktywne enzymu to obszar który wiąże substrat (i kofaktor jeśli taki występuje) i przemienia je w produkt. Miejsce to zawiera reszty aminokwasowe (tzw. grupy katalityczne enzymu), które biorą bezpośredni udział w tworzeniu i zrywaniu wiązań. Miejsce aktywne stanowi względnie niewielką część całej cząsteczki enzymu. Jest to określona trójwymiarowa przestrzeń, zagłębienie lub szczelina, zbudowana z aminokwasów pochodzących z różnych części sekwencji aminokwasowej (leżących w pewnej odległości od siebie w łańcuchu polipeptydowym). W centrum aktywnym można wyróżnić grupy aminokwasów pełniących różne role w katalizowanym procesie, są to: - aminokwasy kontaktowe, których jeden lub więcej atomów jest oddalony od substratu na odległość odpowiadającą przeciętnej długości wiązania chemicznego; należą do nich aminokwasy wiążące substrat oraz biorące bezpośredni udział w katalizie;

4 - aminokwasy pomocnicze, które nie stykając się z substratem, pełnią jednak określoną rolę w czynności katalitycznej enzymu, właściwie orientując substrat. Oprócz aminokwasów tworzących centrum aktywne, w cząsteczce enzymu występują aminokwasy stabilizujące jego strukturę przestrzenną oraz aminokwasy nie biorące udziału w stabilizacji budowy przestrzennej ani w funkcji katalitycznej. W obszarze centrum aktywnego wyróżnia się miejsce wiązania substratu, czyli miejsce określające specyficzność enzymu oraz miejsce katalityczne, czyli miejsce, w którym zachodzi katalizowana reakcja. Szczelina miejsca aktywnego ma zazwyczaj charakter niepolarny co sprzyja wiązaniu substratu. Substrat/-y jest wiązany w miejscu aktywnym przez liczne słabe siły (np. oddziaływania elektrostatyczne, wiązania wodorowe, siły van der Waalsa, oddziaływania hydrofobowe) lub z niektórych przypadkach także przez odwracalne wiązania kowalencyjne. Po związaniu cząsteczki substratu i utworzeniu kompleksu enzym-substrat, katalitycznie czynne reszty znajdujące się w miejscu aktywnym enzymu działają na cząsteczkę substratu tak, aby początkowo przekształcić go w stan przejściowy, a następnie w produkt. Uwolnienie produktu zwalnia enzym, który może związać kolejną cząsteczkę substratu i rozpocząć nowy cykl katalityczny. Rys. 2. Ogólny cykl katalityczny. E enzym, S substrat, P produkt. Specyficzność wiązania substratu zależy od precyzyjnie określonego ułożenia atomów w miejscu aktywnym. Ponieważ enzym i substrat oddziałują na siebie poprzez siły o niewielkim zasięgu, które wymagają bliskiego kontaktu, substrat musi mieć odpowiedni kształt, by mógł pasować do miejsca aktywnego. Zaproponowano dwa modele wyjaśniające jak enzym może wiązać swój substrat: a) Model zamka i klucza (model E. Fischera) przestrzenny kształt substratu i miejsca aktywnego pasują do siebie jak klucz do zamka. Są to struktury sztywne, trwałe, idealnie do siebie pasujące po odpowiednim zestawieniu (rys. 3a). b) Model indukowanego dopasowania (model Koshlanda) związanie substratu indukuje zmianę konformacyjną w miejscu aktywnym enzymu (rys. 3b). Różne enzymy wykazują cechy charakterystyczne dla obu modeli, tzn. pewną komplementarność i pewne zmiany konformacji. Specyficzność substratowa może być wąska i dotyczyć tylko jednego rodzaju cząsteczki lub szeroka i dotyczyć grupy cząsteczek o podobnej budowie i charakterze.

5 Rys. 3. Model dopasowania substratu do enzymu a) jak klucz do zamka ; b) indukowanego dopasowania Enzymy są cząsteczkami labilnymi, dlatego mogą łatwo tracić swą katalityczną aktywność. Zniszczenie struktury fragmentów cząsteczki odpowiedzialnych za aktywność enzymu powoduje spadek lub całkowitą utratę jego aktywności, czyli inaktywację. Może to wystąpić m.in. wskutek zablokowania centrum aktywnego enzymu, degradacji cząsteczki lub zniszczenia struktury przestrzennej, czyli denaturacji. Denaturację enzymów powodują wszystkie czynniki chemiczne i fizyczne denaturujące białka. RÓWNOWAGA REAKCJI I ENERGIA AKTYWACJI Aby zaszła reakcja biochemiczna musi zostać pokonana bariera energetyczna związana z przekształceniem cząsteczki substratu w stan przejściowy. Stan przejściowy ma w przebiegu reakcji największą energię swobodną (G). Różnica energii swobodnej miedzy substratem a stanem przejściowym nazywana jest energią aktywacji (ΔG ). Enzym stabilizuje stan przejściowy i zmniejsza wartość ΔG, zwiększając przez to szybkość przebiegu reakcji (rys. 4). Zmiana energii swobodnej G (ΔG) decyduje, czy reakcja będzie termodynamicznie korzystna, czy niekorzystna: ΔG 0 reakcja termodynamicznie korzystna, może zajść spontanicznie bez dopływu energii, reakcja egzoergiczna (rys. 4).

6 ΔG 0 reakcja termodynamicznie niekorzystna i wymaga nakładu energii, nie zachodzi spontanicznie, reakcja endoergiczna. Rys. 4. Zmiany energii zachodzące podczas przebiegu reakcji biochemicznej. W układach biochemicznych nakład energii konieczny do przeprowadzenia reakcji termodynamicznie niekorzystnej uzyskuje się poprzez sprzężenie z reakcją termodynamicznie korzystną tzw. reakcje sprzężone. Reakcja chemiczna istnieje zazwyczaj w stanie równowagi dynamicznej, w której mimo ustawicznego przekształcania nowych cząstek substratu i tworzenia nowych cząstek produktu, proporcja substratu do produktu pozostaje stała. W równowadze stosunek stężeń substratu do produktu stanowi wartość stałą, znaną jako stała równowagi (K). Stała równowagi jest określana przez stosunek szybkości reakcji w kierunku wprost (k 1 ) do szybkości reakcji w kierunku odwrotnym (k -1 ). Enzymy nie zmieniają stałej równowagi reakcji ale zwiększają szybkość reakcji w obu kierunkach w tym samym stopniu, przyspieszając tym samym osiągnięcie stanu równowagi. AKTYWNOŚĆ ENZYMU Pomiar szybkości katalizowanej reakcji umożliwia określenie aktywności enzymu. Aby ułatwić porównywanie aktywności preparatów enzymatycznych, Komisja Enzymowa Międzynarodowej Unii Biochemicznej wprowadziła pojęcie międzynarodowej standardowej jednostki U (ang. U = unit). Jest to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 µmola substratu w ciągu 1 minuty, w temp. 30 C i w optymalnych warunkach (optymalne ph i stężenie substratu zapewniające wysycenie enzymu). Mianem jednostki standardowej jest µmol/min. szybkość katalizowanej reakcji (V 0 ). Aktywność enzymu najczęściej wyraża się jako początkowa

7 Poza jednostką standardową (U) do wyrażania aktywności enzymu stosuje się również jednostkę o nazwie katal (kat). Jest to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 mola substratu w ciągu 1 sekundy. Mianem katala jest mol/s. Jest to jednostka 60 milionów razy większa od jednostki standardowej, stąd też zaleca się stosowanie jednostek pokrewnych: mikrokatal (μkat =10 6 kat), nanokatal (nkat = 10 9 kat), pikokatal (pkat= kat). Zależność liczbowa pomiędzy jednostką standardową i katalem: 1 kat = 1 mol/s = 60 moli/min = µmola/min = U 1 U = 1 µmol/min = 1/60 µmola/s = 1/60 µkat = 16, kat = 16,67 nkat Inną wielkością określającą zdolność enzymu do katalizowania reakcji chemicznych jest stała katalityczna k kat, określająca stosunek szybkości maksymalnej reakcji V max do całkowitego stężenia enzymu: k kat = V max /[E] = µm/s/µm = 1/s Stała katalityczna (liczba obrotów, aktywność molekularna) określa liczbę cząsteczek substratu przetworzonych przez cząsteczkę enzymu w czasie 1 sekundy, w warunkach, w których enzym wykazuje maksymalną aktywność. Inne wartości liczbowe charakteryzujące czysty enzym: Aktywność całkowita całkowita liczba jednostek enzymu w próbce Aktywność specyficzna, właściwa liczba jednostek standardowych enzymu na 1 mg białka (U/mg białka). SZYBKOŚĆ REAKCJI ENZYMATYCZNEJ Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od stężenia substratu i enzymu oraz warunków, w jakich jest przeprowadzana (temperatura, ph, obecność aktywatorów, lub inhibitorów). Początkowa szybkość reakcji V 0 to wartość wyznaczona eksperymentalnie, zanim więcej niż ok 10% substratu ulegnie przekształceniu w produkt (aby zminimalizować wpływ zjawisk komplikujących pomiar, tj. reakcja odwrotna, hamowanie enzymu przez produkt i stopniowa inaktywacja enzymu). V 0 wyznacza się z wykresu zależności ilości powstawania produktu od czasu. Taki typowy wykres wykazuje początkowy okres szybkiego narastania produktu, co odpowiada prostoliniowemu odcinkowi wykresu (rys. 5). Po okresie tym następuje stopniowe zwalnianie szybkości działania enzymu w miarę zużywania substratu lub/i osłabienia aktywności enzymu. Wartość V 0 wyznacza się jako nachylenie prostej stycznej do wykresu funkcji w punkcie t=0.

8 Rys. 5. Zależność między powstawaniem produktu a czasem trwania reakcji katalizowanej przez enzym. a) Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej Przy małych stężeniach substratu podwojenie [S] powoduje podwojenie wartości V 0. Przy wyższych stężeniach substratu enzym ulega wysyceniu i dalszy wzrost [S] powoduje niewielką zmianę wartości V 0 (rys. 6). Szybkość działania enzymu jest zależna od szybkości oddysocjowywania produktu od enzymu. Rys. 6. Zależność między stężeniem substratu [S] a szybkością reakcji (V 0 ) krzywa hiperboliczna. b) Wpływ stężenia enzymu na szybkość reakcji enzymatycznej Przy stężeniu substratu zapewniającym wysycenie enzymu szybkość reakcji V 0 jest wprost proporcjonalna do stężenia enzymu. Przy niewystarczającym stężeniu substratu szybkość reakcji maleje (rys. 7). Rys. 7. Zależność między stężeniem enzymu [E] a szybkością reakcji (V 0 ) przy wysycającym stężeniu substratu [S] zależność liniowa, lub przy nie wysycającym stężeniu substratu zależność hiperboliczna

9 c) Wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznej Wzrost temperatury zwiększa energię termiczną cząsteczek substratu, co zwiększa ilość cząsteczek, które mają dostateczną ilość energii by przekroczyć barierę energetyczną ΔG, dzięki czemu szybkość reakcji się zwiększa. Jednak wraz z podwyższeniem temperatury wzrasta również energia termiczna enzymu, co zwiększa szansę zerwania licznych słabych wiązań niekowalencyjnych utrzymujących trójwymiarową strukturę enzymu i miejsca aktywnego, co może prowadzić do denaturacji (rozfałdowania) enzymu i spadku lub do całkowitej utraty aktywności katalitycznej. Zatem wpływ wzrostu temperatury na V 0 jest wynikiem równowagi miedzy tymi dwoma zjawiskami. Stan optimum temperaturowego (wąski lub szeroki zakres temperatury oraz wartość temperatury) jest różny dla różnych enzymów. Większość enzymów wykazuje optimum temperatury w zakresie C, a w temperaturach powyżej 60 C traci aktywność nieodwracalnie (denaturacja). Istnieją jednak enzymy, które zachowują aktywność nawet po dłuższym ogrzewaniu w temp. 100 C (np. enzymy wydzielane przez bakterie żyjące w gorących źródłach). Rys. 8. Wpływ temperatury na aktywność enzymu. d) Wpływ ph na szybkość reakcji enzymatycznej Każdy enzym ma optymalne ph działania, w którym szybkość katalizowanej reakcji jest maksymalna. Niewielkie odchylenia ph od wartości optymalnej powodują spadek aktywności spowodowany zmianami jonizacji grup w miejscu aktywnym enzymu. Duże odchylenia ph prowadzą do zrywania słabych niekowalencyjnych oddziaływań, utrzymujących trójwymiarową strukturę białka, co w konsekwencji prowadzi do denaturacji enzymu. Krzywa ph ma najczęściej ma kształt dzwonowy (jak w przypadku trypsyny, rys. 9a), tzn. enzym wykazuje najwyższą aktywność w ph optymalnym, natomiast poniżej i powyżej tej wartości aktywność enzymu maleje. Większość enzymów wykazuje optimum ph w zakresie 6 8. Nie zawsze jednak krzywa zależności aktywności od ph musi mieć charakter dzwonowy. Niektóre enzymy mają taką samą aktywność w szerokim zakresie ph, np. papaina, esteraza cholinowa (rys. 9b-d).

10 Rys. 9. Wpływ ph na aktywność różnych enzymów. MODEL MICHAELISA-MENTEN Enzym E wiąże się z substratem S, tworząc kompleks enzym-substrat E S, ze stałą szybkości k 1. Kompleks E S może z powrotem dysocjować do E i S ze stałą szybkości k -1 lub może się przekształcać tworząc produkt P, ze stałą szybkości k 2. Zakłada się, że produkt reakcji nie może ulec powrotnemu przekształceniu w wyjściowy substrat. Jest to warunek, który jest spełniany na początkowym etapie reakcji, zanim stężenie produktu stanie się znaczące. Ponieważ stężenie E S utrzymuje się na stałym poziomie dopóki w przybliżeniu całkowita ilość substratu nie zostanie zużyta, przez większość czasu przebiegu reakcji szybkość powstawania E S jest równa szybkości jego przekształcania w P i wolny E, a więc E S utrzymuje stan równowagi. Przy małych stężeniach substratu ([S]), kiedy [S] jest znacznie mniejsze do K M, początkowa szybkość reakcji V 0 jest wprost proporcjonalna do [S], natomiast przy dużych stężeniach substratu, kiedy [S] jest dużo większe od K M, szybkość zmierza do wartości maksymalnej V max, czyli szybkość staje się niezależna od [S] (rys. 6).

11 Rys. 10. Zależność między stężeniem substratu [S] a szybkością reakcji (V 0 ) wykres hiperboliczny. Równanie Michaelisa-Menten gdzie jeśli [S] = K M, wtedy K M (stała Michaelisa) jest równa takiemu stężeniu substratu [S] przy którym szybkość reakcji V 0 osiąga połowę swojej maksymalnej wartości. K M jest miarą stabilności kompleksu E S, stanowiąc iloraz sumy szybkości rozkładu E S i szybkości jego powstawania. W przypadku, gdy k -1 >> k 2 (znacznie większe) to K M staje się również miarą powinowactwa enzymu do substratu: wysoka wartość K M wskazuje na słabe wiązanie substratu (gdyż k 2 > k 1 ) niska wartość K M wskazuje na silne wiązanie substratu (gdyż k 1 > k 2 ) ` WYKRES LINEWEAVERA-BURKA Wykres Lineweavera-Burka pochodzi z przekształcenia równania Michaelisa-Menten i służy wyznaczeniu wartości V max i K M. Aby wyznaczyć wartości V max i K M należy zmierzyć V 0 przy różnych stężeniach substratu i wykonać wykres kinetyki enzymu, czyli zależności 1/V 0 od 1/[S]. Wykres 1/V 0 = f(1/[s]) jest linią prostą, której przecięcie z osią y równa się 1/V max, a przecięcie z osią x równa się -1/K M. Nachylenie linii ma wartość K M /V max.

12 Rys. 11. Zależność między stężeniem substratu [S] a szybkością reakcji (V 0 ) w układzie współrzędnych będących odwrotnościami V 0 i [S]. Ważną grupą enzymów działających niezgodnie z kinetyką Michaelisa-Menten są enzymy allosteryczne. Enzymy te składają się z kilku podjednostek i kilku miejsc aktywnych. W przypadku tych enzymów wykres zależności szybkości reakcji V 0 od stężenia substratu [S] często przybiera kształt sigmoidalny (rys. 12). Rys. 12. Kinetyka enzymów allosterycznych. Enzymu allosteryczne wykazują sigmoidalny zależność szybkości reakcji od stężenia substratu. W enzymach allosterycznych, związanie substratu do jednego miejsca aktywnego może zmienić właściwości innych miejsc aktywnych w tej samej cząsteczce enzymu. Rezultatem takiego oddziaływania miedzy podjednostkami enzymu może być kooperatywność wiązania substratu do innych miejsc aktywnych (tzn. związanie substratu w jednym miejscu aktywnym indukuje w enzymie zmianę konformacyjną, zmieniającą powinowactwo do substratu w innych miejscach aktywnych). Ponadto aktywność enzymów allosterycznych może być zmieniana przez cząsteczki regulatorowe (aktywatory, inhibitory), które wiążą się do specyficznych miejsc innych niż miejsca katalityczne. Fosfatazy (fosfomonoesterazy) są enzymami katalizującymi hydrolityczny rozpad estrów kwasu fosforowego do odpowiedniego alkoholu i kwasu fosforowego. Enzymy te powszechnie występują zarówno

13 w tkankach roślinnych jak i zwierzęcych. Wyróżniamy dwie klasy fosfataz: kwaśne, które wykazują maksymalną aktywność przy ph 4-6 oraz zasadowe z maksymalną aktywnością przy ph 8-9. Kiełki roślinne są łatwo dostępnym źródłem szeregu enzymów w tym również fosfatazy kwaśnej o małej specyficzności w stosunku do substratu. Rola fosfatazy kwaśnej w roślinie polega na uwalnianiu rezerw fosforanu znajdujących się w kiełkujących ziarnach w postaci m. in. sześciofosforanu inozytolu. Fosfataza kwaśna jest łatwo uwalniana w trakcie mieszania homogenizowanych kiełków w wodzie. Do oznaczania aktywności enzymu zostanie użyty syntetyczny substrat: nitrofenylofosforan sodu. Reakcja będzie przeprowadzana w warunkach optymalnych dla fosfatazy - w buforze cytrynianowym o ph 5,3. Produktem reakcji katalizowanej przez fosfatazę jest nitrofenol, bezbarwny w ph kwaśnym. Dodanie NaOH zatrzymuje reakcję i umożliwia przekształcenie nitrofenolu w barwny anion nitrofenolanowy (rys. 13). Rys.13. Reakcja chemiczna z udziałem fosfatazy kwaśnej Ilość produktu reakcji można określić na podstawie pomiaru spektrofotometrycznego. Oznaczanie aktywności fosfatazy prowadzi się przy stałym stężeniu substratu. Ilość enzymu należy dobrać tak, aby stężenie substratu nie ograniczało szybkości katalizowanej reakcji. Zawartość enzymu określa się w jednostkach aktywności, przyjmując za jednostkę taką ilość enzymu, która hydrolizuje 1 µmol nitrofenylofosforanu w ciągu minuty. II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA 1. Enzymy jako katalizatory reakcji biochemicznych (wpływ enzymów na równowagę reakcji i energię aktywacji; miejsce aktywne enzymu, kompleksy enzym - substrat, specyficzność substratowa, klasyfikacja enzymów). 2. Czynniki wpływające na aktywność enzymatyczną (temperatura, ph, kofaktory, stężenie substratu, stężenie enzymu). 3. Pojęcia: kofaktor, koenzym, grupa prostetyczna, holoenzym, apoenzym, izoenzymy, enzymy allosteryczne, jednostka enzymu (U), aktywność właściwa, aktywność całkowita, aktywność specyficzna, aktywność molekularna (liczba obrotów). 4. Kinetyka reakcji enzymatycznej - równanie Michaelisa-Menten, stała Michaelisa, wykres Lineveawera- Burka. 5. Znajomość części doświadczalnej (+ przeliczanie stężeń).

14 III. APARATURA I SPRZĘT LABORATORYJNY 1. Probówki chemiczne zwykle 2. Pipeta szklana (5 ml) + nasadka 3. Statywy do probówek 4. Łaźnia wodna 5. Spektrofotometr 6. Mikser 7. Kolba stożkowa (500 ml) 8. Papier milimetrowy 9. Lejek, sączek, bibuła filtracyjna 10. Cylinder miarowy (200 ml) 11. Pipeta automatyczna (1000 µl), tipsy do 1000 µl IV. ODCZYNNIKI 1. 0,005 M roztwór nitrofenylofosforanu sodu w wodzie (przygotować bezpośrednio przed użyciem) 2. 0,1 M bufor cytrynianowy ph N NaOH 4. 0,5 mm roztwór p-nitrofenolu w wodzie (przygotować bezpośrednio przed użyciem) 5. H 2 O w lodówce do r-row 1 i 4 V. WYKONANIE ĆWICZENIA A. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU ENZYMATYCZNEGO Do 2-3 g kiełków (ilość i rodzaj kiełków zostanie podana przez prowadzącego) dodać 200 ml wody destylowanej. Korzystając z miksera przygotować homogenat z kiełków. Przesączyć. Przesącz należy rozcieńczyć 2-5 razy (wielokrotność rozcieńczenia zostanie podana przez prowadzącego). Przesącz zawiera fosfatazę kwaśną, której aktywność należy oznaczyć. UWAGA! Otrzymany ekstrakt należy przechowywać w lodzie. B. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ a. Przygotowanie krzywej wzorcowej Do 7 probówek odmierzyć odpowiednie ilości roztworów wg tabeli 2. Próby wymieszać, zmierzyć ekstynkcję przy długości fali 430 nm (spektrofotometr wyzerować względem pierwszej próby, pomiary wpisać do tabeli 3).

15 Tab. 2. Skład poszczególnych mieszanin reakcyjnych Nr probówki 0,5 mm p-nitrofenol (ml) 1 N NaOH (ml) Woda destylowana (ml) 1- kontrola ,25 1 4,75 3 0,5 1 4, ,5 1 3, Tab. 3. Dane opisujące zależność wartości ekstynkcji od stężenia p-nitrofenolu Nr probówki 1- kontrola stężenie p-nitrofenolu (mm) Ekstynkcja przy λ=430 nm Krzywa wzorcowa stanowi zależność wartości ekstynkcji od stężenia p-nitrofenolu w każdej próbie (wykres 1). b. Przygotowanie mieszanin reakcyjnych i przeprowadzenie reakcji hydrolizy Do 5 ponumerowanych czystych probówek laboratoryjnych odmierzyć roztwory wg tabeli 4.

16 Tab. 4. Skład poszczególnych mieszanin reakcyjnych Nr probówki Homogenat z kiełków (ml) Woda destylowana (ml) Bufor cytrynianowy (ml) 1 - kontrola 0 2,0 1,0 2 0,5 1,5 1,0 3 1,0 1,0 1,0 4 1,5 0,5 1,0 5 2,0 0 1,0 Próby po dokładnym wymieszaniu wstawić do łaźni wodnej o temp. 37 C na 10 min (przygotowanie środowiska reakcji). Następnie do każdej probówki szybko dodać po 2 ml 0,005 M roztworu nitrofenylofosforanu sodu o temp. 37 C i inkubować próby w temp. 37 C przez kolejne 10 min (przebieg reakcji). Po tym czasie do każdej probówki dodać po 1 ml 1 N roztworu NaOH, wymieszać (zatrzymanie reakcji) i przeprowadzić pomiar ekstynkcji przy długości fali 430 nm (spektrofotometr wyzerować względem pierwszej próby, pomiary wpisać do tabeli 5). Tab. 5 Dane opisujące zależność objętości homogenatu od µmol/min zhydrolizowanego p-nitrofenylofosforanu Nr probówki Homogenat z kiełków (ml) 1 0 Ekstynkcja przy λ=430 nm C m p-nitrofenolu (mm) Całkowita ilość moli zhydrolizowanego p-nitrofenylofosforanu (µmol) Ilość moli zhydrolizowanego p-nitrofenylofosforanu w czasie 1 minuty (µmol/min) 2 0,5 3 1,0 4 1,5 5 2,0 Na podstawie wyników pomiaru ekstynkcji odczytać z wykresu 1 (krzywa wzorcowa) stężenie powstałego p-nitrofenolu w każdej próbie, a następnie obliczyć liczbę moli p-nitrofenolu każdej próbie. Na podstawie uzyskanych wyników wyznaczyć całkowitą liczbę moli zhydrolizowanego p-nitrofenylofosforanu dla każdej próby i obliczyć ilość moli zhydrolizowanego p- nitrofenylofosforanu w czasie 1 minuty. Przedstawić krzywą hydrolizy p-nitrofenylofosforanu sodu w obecności kwaśnej fosfatazy w zależności od objętości homogenatu (wykres 2).

17 c. Wyznaczenie aktywności fosfatazy kwaśnej Na podstawie wykresu 2, należy wyznaczyć objętość homogenatu, w której zawiera się 1 jednostka enzymu fosfatazy kwaśnej oraz obliczyć, ile jednostek enzymu znajduje się w 1 ml homogenatu. VI. WYNIKI i WNIOSKI - SPRAWOZDANIE 1. Cel/temat ćwiczenia. 2. Homogenat: podać rodzaj i ilość kiełków wykorzystywanych w ćwiczeniu, stopień rozcieńczenia homogenatu. 3. Krzywa wzorcowa: napisać reakcję jaka zachodzi w probówkach na tym etapie ćwiczenia (należy skorzystać z rys. 13). Podpisać nazwy związków (substraty i produkty), zaznaczyć kolory roztworów jakie tworzą te związki. wyznaczyć stosunek molowy substratu i produktu tej reakcji. obliczyć stężenie p-nitrofenolu (mm) w każdej próbie (przedstawić obliczenia dla dowolnej próby, uwzględniając przeliczenie jednostek), uzupełnić tabelę 3, wpisując wartości ekstynkcji dla każdej próby oraz obliczone wartości stężenia p-nitrofenolu, sporządzić wykres zależności ekstynkcji od stężenia p-nitrofenolu (wykres 1 ), odkładając na osi odciętych stężenie p-nitrofenolu w danej próbie, a na osi rzędnych wartości ekstynkcji. Należy pamiętać, że krzywa wzorcowa to linia prosta przechodząca przez punkt (0,0) oraz przez jak największą ilość punktów pomiarowych lub w ich pobliżu (jest to tzw. linia trendu). 4. Reakcja hydrolizy p-nitrofenylofosforanu: napisać reakcję jaka zachodzi w probówkach na tym etapie ćwiczenia (należy skorzystać z rys. 13). Podpisać nazwy związków (substraty i produkty), zaznaczyć kolory roztworów jakie tworzą te związki. wyznaczyć stosunek molowy substratu i produktów tej reakcji. uzupełnić tabelę 5, wpisując wartości ekstynkcji dla każdej próby na podstawie wykresu 1 odczytać stężenie p-nitrofenolu w każdej próbie (mm), dane wpisać do tabeli 5, obliczyć ilość moli p-nitrofenolu w każdej próbie (przedstawić obliczenia dla dowolnej próby, uwzględniając przeliczenie jednostek), obliczyć całkowitą ilość moli zhydrolizowanego p-nitrofenylofosforanu w każdej próbie oraz ilość moli p-nitrofenylofosforanu jaka została zhydrolizowana w czasie jednej minuty. sporządzić wykres zależności objętości homogenatu od ilości zhydrolizowanego p-nitrofenolanu sodu w czasie 1 minuty (wykres 2), odkładając na osi odciętych µmole zhydrolizowanego substratu/min, a na osi rzędnych ilość dodanego homogenatu w ml. Należy pamiętać, że krzywa hydrolizy to linia prosta przechodząca przez punkt (0,0) oraz przez jak największą ilość punktów pomiarowych lub w ich pobliżu (jest to tzw. linia trendu). 5. Aktywność fosfatazy kwaśnej: na podstawie wykresu 2, wyznaczyć objętość homogenatu, w której zawiera się 1 jednostka enzymu fosfatazy kwaśnej (należy wykorzystać do tego celu definicję jednostki enzymu).

18 obliczyć, ile jednostek enzymu znajduje się w 1 ml homogenatu. obliczyć masę kiełków, w których znajduje się 1 jednostka enzymu. 6. Odpowiedz na pytanie: w spektrofotometrze mierzy się wartość ekstynkcji, która odpowiada stężeniu anionu p-nitrofenolanowego (intensywnośći barwy żółtej). Dlaczego tę wartość możemy również odnieść do stężenia p-nitrofenolu czy stężenia zhydrolizowanego p-nitrofenylofosforanu?