Wykład 3 Nomenklatura, podział I czynniki regulujące kinetykę procesów enzymatycznych

Transkrypt

1 ENZYMOLOGIA Kierunek: Technologia Żywności i Żywienie Człowieka semestr I Wykład 3 Nomenklatura, podział I czynniki regulujące kinetykę procesów enzymatycznych WYDZIAŁ NAUK O ŻYWNOŚCI I RYBACTWA CENTRUM BIOIMMOBILIZACJI I INNOWACYJNYCH MATERIAŁÓW OPAKOWANIOWYCH

2 Zakres materiału ENZYMOLOGIA 1. Biochemia, Autor: Jeremy Berg, Lubert Stryer, John L. Tymoczko, PWN Warszawa (2005) Rozdziały: 8. Enzymy:: podstawowe pojęcia i kinetyka 9. Strategie katalityczne 10. Strategie regulacyjne:: enzymy i hemoglobina 2. Ćwiczenia z enzymologii i technik biochemicznych. Bartoszewska, Niziołek, Paszowski, Wydawnictwo SGGW 3. Handbook of Food Enzymology ed. John R. Whitaker et al., CRC Press; (2002) 4. Enzymes in Food Technology - ROBERT J. WHITEHURST, BARRY A. LAW, Editors Sheffield Academic Press CRC Press (2002) 3. Food chemistry - Hans- Dieter Belitz, Werner Grosch, Peter Schieberle, Springer (2004)

3 Nazewnictwo enzymów Nomenklatura i systematyka enzymów 1961 pierwsze podstawowe zasady nomenklatury i klasyfikacji enzymów przez Komisję Enzymatyczną powołaną przez Międzynarodową Unię Biochemiczną i Biologii Molekularnej (IUBMB) w 1955r 1972 Komitet Nazewnictwa (ang. Nomenclature Commihee) Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej w latach opracował dla enzymów nomenklaturę naukową numer EC Nomenklatura enzymów wydana przez Komitet Enzymowy (NC) IUBMB pozycja książkowa Nomenklatura EC: Każdy enzym jest opisany przez ciąg czterech segmentów cyfr, oddzielonych od siebie kropką, poprzedzonych literami "EC" (Enzyme Commission lub Enzyme Catalogue): EC x.xx.xx.xx. Pierwsza cyfra dzieli enzymy, według mechanizmu reakcji przez nie katalizowanych Następne liczby numeru EC oddzielone kropkami klasyfikują dany enzym odpowiednio do podklasy i podpodklasy, natomiast ostatnia liczba określa miejsce enzymu w podpodklasie. Nazewnictwo zwyczajowe W nazewnictwie enzymów zaleca się stosowanie numeru EC, jednak dopuszcza się stosowanie nazw zwyczajowych z przyrostkiem - aza, gdzie pierwszy człon określa reakcję, a drugi jej substrat

4 Nazewnictwo/klasyfikacja enzymów EC Enzymy dzieli się na 6 grup (mechanizm reakcji ): EC 1 oksydoreduktazy: katalizują reakcje utleniania i redukcji, EC 2 transferazy: przenoszą grupy funkcyjne, EC 3 hydrolazy: katalizują hydrolizę różnych wiązań, EC 4 liazy: rozcinają różne wiązania na drodze innej niż hydroliza czy utlenianie, EC 5 izomerazy: katalizują zmiany izomeracyjne cząsteczek, EC 6 ligazy: łączą cząsteczki wiązaniami kowalencyjnymi. EC1 oksydoreduktazy - AH 2 + B A + BH 2 ; EC2 transferazy - AB + C A + BC; EC3 hydrolazy - AB + H 2 O A + B; EC4 liazy - AB A + B; EC5 izomerazy - AB BA; EC6 ligazy - A + B AB;

5 Enzymy katalizujące reakcje oksydoredukcyjne, polegające na przenoszeniu elektronów, protonów lub polegające na bezpośrednim włączaniu tlenu do substratu. Klasa ta obejmuje następujące grupy enzymów Dehydrogenazy odwodorowanie, utlenianie przenośniki e - i H + - NAD +, FAD Reduktazy redukcja przenośniki e- i H+ - NADP+, FAD, ferredoksyna, cytochromy Oksydazy Peroksydazy Oksygenazy (a) i hydroksylazy (b) Oksydoreduktaza β- D- glukoza: tlen nazwa systematyczna Oksydaza glukozy nazwa potoczna EC numer klasyfikacyjny 4- kolejność w podklasie 3- akceptor: tlen 1- utleniana grupa w donorze: CH- OH 1- klasa enzymu (oksydoreduktaza) 1. OKSYDOREDUKTAZY Zastosowanie oksydoreduktaz: Do usuwania glukozy i tlenu z opakowań Do stabilizacji piwa, win, soków Do odcukrzania masy jajowej przed suszeniem Do oznaczania ilościowej glukozy

6 1. Klasa ta obejmuje enzymy katalizujące przeniesienie grup chemicznych pomiędzy poszczególnymi związkami i to zwykle przy udziale specyficznych koenzymów. 2. W zależności od rodzaju przenoszonych grup lub rodników wyróżniamy m.in.: - Aminotransferazy: przenoszą grupą aminową- NH 2 - Fosfotransferazy (kinazy): przenoszą grupy fosforanowe z udziałem ATP - Metylotransferazy: przenoszą grupę- CH 3 - Glikozylotransferazy: przenoszą grupy cukrowe - Acylotransferazy: przenoszą grupy acylowe 2,4,6- węglowe 6- fosfotransferaza ATP - enzym katalizujący przeniesienie fosforanu z ATP na grupę hydroksylową przy 6 at. węgla D- heksoza nazwa systematyczna Heksokinaza nazwa potoczna 2. TRANSFERAZY EC numer klasyfikacyjny 1- kolejność w podklasie 1- grupa akceptorowa: grupa alkoholowa 7- przenoszona grupa: grupa zawierająca fosfor 2- klasa enzymu

7 3. HYDROLAZY 1. Enzymy katalizujące reakcję hydrolizy, czyli rozkładu wiązań z udziałem cząsteczki wody. 2. Jest to jedna klasa enzymów, która nie wymaga obecności koenzymów 3. W zależności od rodzaju atakowanych wiązań rozróżniamy hydrolazy m.in.: - Etsterazy - rozkładające wiązania estrowe - Lipazy (hydrolazy estrów karboksylowych) - Fosfatazy (hydrolazy monoestrów fosforanowych) - Glikozydazy - hydrolizujące wiązania glikozydowe - np. amylazy, celulazy - Peptydazy - Hydrolizujące wiązania peptydowe np. trypsyna, pepsyna, chymotrypsyna - Amidohydrolazy - rozkładające wiązanie C- N inne niż peptydowe np. w amidach Galaktohydrolaza β-d-galaktozydu nazwa systematyczna β-d-galaktozydaza, laktaza nazwa potoczna EC kolejność w podklasie 1- hydrolizowane wiązanie dokładniej O- lub S- glikozylowe 2- hydrolizowane wiązanie: wiązanie glikozydowi 3- klasa enzymu

8 LAKATAZA produkcja mleka przy nietolerancji laktozy, hydroliza laktozy do glukozy i galaktozy polepsza rozpuszczalność, zmniejsza koncentrację sacharydów w produktach koncentratów z mleka i serwatki (łatwa produkcja lodów, deserów) glukoza słodsza od laktozy 3. HYDROLAZY (cz. II) rozkład glukozy przyspiesza fermentację mleka w technologii napojów fermentowanych, twarogów, serów SACHARAZA inwertaza (sacharaza, β- fruktofuranozydaza) hydrolizuje wiązanie α- 1,4- glikozydowe i powstaje α- D- glukoza i β- D- fruktoza produkcja cukru inwertowanego otrzymywanie fruktozy Fruktoza: najlepiej rozpuszczalna w wodzie słodzenie soków (nie krystalizuje w czasie przechowywania) higroskopijna zapobiega utracie wilgoci z żywności, np. owoce kandyzowane syropy fruktozowe (dla diabetyków)

9 Enzymy katalizujące odwracalne lub nieodwracalne rozerwanie różnych wiązań bez udziału wody, przy czym z substratu, na który działa enzym, odłączane są pewne grupy (np. CO 2, H 2 O, NH 3, aldehydy). Ze względu na rodzaj rozszczepianych wiązań wyróżniamy m.in. liazy: - dekarboksylazy - rozrywające wiązanie C- C - uwalniają CO 2 z substratów - aldolazy uwalniają aldehydy z substratu - dehydratazy - działające na wiązanie C- O odłączają cząsteczkę wody - hydratazy przyłączają i odłączają cząsteczkę wody - deaminazy - rozszczepiające wiązanie C- N odłączają NH 3 Do klasy tej należą SYNTAZY, które nie wymagają nakładu energii do syntezy wiązań. PRZYKŁAD: karboksyliaza 2- oksokwasów dekarboksylaza pirogronianowa 4. LIAZY EC numer klasyfikacyjny 1 - kolejność w podklasie 1 - odszczepiana grupa: grupa COO rozszczepiane wiązanie: wiązanie C- C 4 - klasa enzymu!

10 1. Klasa enzymów katalizujących przekształcenia wewnątrzcząsteczkowe. 2. Może to być przegrupowanie atomów bądź grup. 3. Skład chemiczny związku nie ulega zmianie. Należą tutaj enzymy katalizujące różne reakcje izomeryzacji, m.in.: - racemazy i epimerazy odpowiedzialne za zmianę konfiguracji przy węglu asymetrycznym (wzajemne przekształcenia konfiguracji L i D lub formy α i β) - mutazy odpowiedzialne za przemieszczenie grup wewnątrz cząsteczki - izomerazy cis- trans izomeria geometryczna (cis- trans) - izomerazy odpowiedzialne za wewnątrzcząsteczkowe przemiany oksydoredukcyjne (przesunięcie atomów H+) PRZYKŁAD: ketolo- izomeraza D- ksylozy izomeraza ksylozowa (glukozowa) 5. IZOMERAZY EC numer klasyfikacyjny 5 - kolejność w podpodklasie 1 - przekształcenie: przemiana aldoza ketoza 3 - typ przekształcenia: przegrupowanie atomów H 5 - klasa enzymu!

11 6. LIGAZY 1. Enzymy (pot. syntetazy) katalizujące syntezę powstanie nowych wiązań: C- O, C- S, C- N, C- C. 2. Wszystkie reakcje katalizowane przez ligazy zachodzą z udziałem ATP lub innego związku makroergicznego. Syntetazy katalizujące dołączenie do substratu CO 2 nazywamy potocznie karboksylazami. PRZYKŁAD: ligaza octan: CoA (AMP) syntetaza acetylo- CoA EC numer klasyfikacyjny 1 - kolejność w podklasie 1- substraty syntezy: kwas - vol 2 - powstające wiązanie: C- S 6 - klasa enzymu Ligaza DNA!

12 PORÓWNANIE KATALIZY I BIOKATALIZY PORÓWNYWANY CZYNNIK temperatura ph wrażliwość na zatrucia BIOKATALIZA Duże ograniczenie, potrzeba ścisłego kontrolowania warunków mniejsza (trucizny, inhibitory) KATALIZA Duży zakres temperatur stosowanych, mniej wrażliwe na zmiany warunków duża ( zatrucia) specyficzność duża w zależności od procesu selektywność duża w zależności od procesu żywotność duża mniejsza w porównaniu do biokatalizatorów możliwość aktywacji koenzymy, aktywatory promotory zakres stężeń reagentów nieduże różne

13 Czynniki regulujące szybkość działania enzymów 1. kinetyczne: temperatura, ph, dyfuzja, kształt, lepkość roztworu stężenie substratów obecność enzymatycznych aktywatorów i enzymatycznych inhibitorów czynniki pośrednie: czynniki allosteryczne, sprzężenie zwrotne, przemiana proenzymu w enzym 2. strukturalne: powiązanie enzymów z określonymi strukturami i ich rozgraniczenie błonami wewnątrzkomórkowymi regulowany transport przez błony komórkowe i cytoplazmatyczne szybkość odprowadzania produktów

14 KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH 1. Kinetyka badanie szybkości, z jaką przebiega reakcja oraz czynników wpływających na tą czynność reakcji. Nie zajmuje się naturą chemiczną zmian. 2. Kinetyczny opis aktywności enzymów jest konieczny do zrozumienia działania enzymów. Czynniki: - stężenie enzymów i substratu - występowanie i stężenie kofaktorów, inhibitorów i aktywatorów - temperatura - stężenie H + (ph) - oddziaływania allosteryczne, modyfikacje kowalencyjne, aktywacja proteolityczna Wpływ stężenia enzymu na szybkość reakcji enzymatycznej V Zależność wprost proporcjonalna 2x większe stężenie E => 2x szybsza reakcje ALE Substrat w nadmiarze! [E]

15 KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH 1. Oznaczanie aktywności enzymatycznej wykonuje się na początku reakcji enzymatycznej, ponieważ może dojść do: - hamowania aktywności enzymatycznej produktem na drodze hamowania zwrotnego, - enaturacji białka enzymatycznego. Wpływ temperatury V Działa na cząsteczki S i E. temp. => en. kinetycznej cz. S Cząsteczki substratu szybciej się poruszają, zderzają się częściej, więcej z nich może osiągnąć stan przejściowy. [ C] 1. W pewnym momencie osiągnięta zostaje temp. optymalna dla działania enzymu. 2. Temperatura optymalna temperatura, przy której szybkość reakcji enzymatycznej biegnie z maksymalną szybkością, a nie ma miejsca jeszcze denaturacja białka enzymatycznego. 3. Zbyt wysoka temperatura powoduje drgania w cząsteczkach enzymu i dochodzi do rozerwania wiązań w enzymie.

16 Reguła van Hoffa Wzrost temperatury o 10 C powoduje: krotny wzrost szybkości reakcji nieenzymatycznej krotny wzrost szybkości reakcji enzymatycznej Równanie Arrheniusa KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Opvmum temperatury zależy od czasu przyjętego do obliczenia szybkości reakcji. Termostabilność enzymu możemy określić podając najwyższą temperaturę, w której jeszcze nie dochodzi do termicznej inaktywacji enzymu. Badanie wpływu temperatury na aktywność enzymu: - przygotowuje się mieszaninę reakcyjną S + E, ph, bufor; mieszaninę przenosi się do określonej temperatury i reakcja enzymatyczna zachodzi właśnie w takiej określonej temperaturze, następnie zatrzymujemy reakcję i mierzymy szybkość reakcji enzymatycznej.

17 Badanie termostabilności białka: KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH - Badanie temperatury, w której enzym zachowuje aktywność. - Białko enzymatyczne poddaje się traktowaniu różnymi temperaturami badamy, jak ten enzym zachowuje się w różnych temperaturach. - Białko enzymatyczne przenosi się do temperatury optymalnej i dodaje pozostałe składniki reakcyjne. - Reakcja enzymatyczna biegnie w temperaturze optymalnej. Termostabilność celulaz różne mikroorganizmy

18 Kinetyka reakcji enzymatycznych - wpływ ph ph środowiska wpływa na: wiązanie substratu przez E, aktywność katalityczną E, stan jonizacji substratu, zmiany w strukturze przestrzennej E. ph wpływa na stopień zdysocjowania (uprotonowania): - grup funkcyjnych centrum aktywnego, - grup funkcyjnych, które uczestniczą w katalizie, - grup funkcyjnych substratu, które uczestniczą w wiązaniu do enzymu, - grup funkcyjnych leżących w pobliżu centrum aktywnego, które decydują o konformacji tego centrum aktywnego. Optymalne ph działania wartość ph, przy której szybkość katalizowanej reakcji jest maksymalna. Krzywe zależności v/ph mogą być też prostoliniowe. Niewielkie odchylenie ph od wartości optymalnych powoduje nagły spadek szybkości reakcji enzymatycznej.

19 Kinetyka reakcji enzymatycznych optymalne ph Optymalne ph reakcji jest różne dla różnych enzymów. Dla większości mieści się w granicach odczynu obojętnego (ph 6-9). pepsyna 1,8 proteinaza kwaśna 3,5 trypsyna 8 arginaza 10

20 Kinetyka reakcji enzymatycznych - wpływ ph

21 Kinetyka reakcji enzymatycznych wpływ podstawowych czynników

22 WPŁYW ŚRODOWISKA NA SZYBKOŚĆ REAKCJI

23 STĘŻENIE SOLI

24 Kinetyka reakcji enzymatycznych wpływ innych czynników Inne czynniki szybkość dyfuzji jest odwrotnie proporcjonalna od wielkości cząsteczek (dla wody w temp C wynosi 2, cm/s), kształt i wielkość cząsteczek, lepkość roztworu. Działanie czynników regulujących potencjał oksydoredukcyjny środowiska - aktywacja enzymów zawierających w centrum katalitycznym wolne grupy hydrosulfidowe SH - aktywatory: substancje o niskim potencjale oksydoredukcyjnym (reduktory) zwykle zawierające grupy SH, np.: cysteina, glutavon, merkaptoetanol - enzymy: papaina, dehydrogenaza alkoholowa i inne