RENTGENOWSKA ANALIZA FLUORESCENCYJNA j o W BADANIACH TKANKI CENTRALNEGO UKŁADU NERWOWEGO I PŁYNÓW USTROJOWYCH CZŁOWIEKA io l CN j 3 Magdalena Boruchowska 17, Marek Lankosz 17, Dariusz Adamek 27, Beata Ostachowicz' 7, Jerzy Ostachowicz 17, Barbara Tomik 27 Wydział Fizyki i Techniki Jądrowej, Akademia Górniczo-Hutnicza, Krakow Instytut Neurologii, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński, Kraków Abstract X-RAY FLUORESCENCE ANALYSIS IN APPLICATION FOR STUDY OF HUMAN BRAIN TISSUE AND BODY FLUIDS Thin slices of human brain tissue and body fluids were investigated using Energy Dispersive X-Ray Fluorescence (EDXRF) spectrometry. Distribution of elements in brain tissue samples was studied using Microbeam X-Ray Fluorescence (MXRF) method. Total Reflection X-Ray Fluorescence (TXRF) analysis was applied for determination of elemental contents in cerebrospinal fluid, serum and whole blood. The main goal of the study was to optimize analytical procedures for investigation of biomedical specimens using EDXRF method. MXRF method is useful for investigation of P, S, Cl, K, Ca and Fe. Moreover, it can be also applied for distinguishing between white and gray matter of the human brain. Two sample preparation methods were applied in TXRF spectrometry with respect to detection limit. In the first method the body fluids were analysed without any sample preparation. The other measurements were performed for the body fluids digested with nitric acid. For both methods gallium was used as an internal standard. Accuracy of the TXRF method was assessed using Certified Reference Material, A- 13 (freeze-dried animal blood). High sensitivity of TXRF and proper sample preparation allowed to detect wide spectrum of elements, between Cl and Sr. Faster and easier first sample preparation method allowed to detect elements including volatile ones like Cl or Br whereas digestion of fluids with nitric acid improved the detection limits significantly. Elemental analysis of thin brain tissue samples and body fluids will be applied for study of role of trace elements in selected neurological diseases. 1. WPROWADZENIE Pierwiastki śladowe odgrywają ważną rolę w funkcjonowaniu organizmu człowieka. Są one zarówno naturalnymi składnikami żywych komórek, jak i czynnikami docierającymi do organizmu z zewnątrz, np. w postaci leków lub zanieczyszczeń. Przeprowadzane badania wskazują na obecność anomalii koncentracji niektórych pierwiastków śladowych (głównie Fe, Cu, Zn) w tkance centralnego układu nerwowego (CUN) w przypadku schorzeń neurologicznych, takich jak choroba Parkinsona, choroba Alzheimera, nowotwory mózgu i in. [1-3]. Pomimo intensywnych badań w zakresie tej tematyki, rola jaką odgrywają pierwiastki śladowe w procesach patologicznych układu ner- 320
wowego człowieka nadal nie jest całkowicie znana. Istotne z punktu widzenia przyszłych zastosowań klinicznych jest określanie zawartości pierwiastków w cienkich skrawkach tkanki, jak również sprawdzenie czy w przypadku wybranych schorzeń neurologicznych występują anomalie koncentracji pierwiastków w płynach ustrojowych. Celem niniejszej pracy było opracowanie procedur analitycznych, a następnie sprawdzenie możliwości wykorzystania rentgenowskiej analizy fluorescencyjnej z dyspersją energii (EDXRF) do badania materiałów biomedycznych dla potrzeb neurologii. W badaniach zastosowano metodę rentgenowskiej analizy fluorescencyjnej z wykorzystaniem mikrowiązki promieniowania rentgenowskiego (MXRF) oraz metodę opartą na zjawisku całkowitego zewnętrznego odbicia promieniowania X (TXRF). 2. MATERIAŁ I METODY Do analizy cienkich skrawków tkanki mózgu metodą MXRF wykorzystano próbki materiałów autopsyjnych lub śródoperacyjnych pobranych z obszarów istoty białej i szarej mózgu. W tym celu wycinki z okolic ośrodkowego układu nerwowego zamrażano (bez utrwalania) w temperaturze -30 C i krojono na kriostacie. Skrawki tkanki o grubości ok. 20 (im nakładano bezpośrednio na folię API i suszono w temperaturze -20 C. Ponadto, przeprowadzono przy wykorzystaniu metody TXRF analizę składu pierwiastkowego próbek płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), surowicy oraz krwi. W badaniach użyte zostały płyny ustrojowe pobrane uprzednio do rutynowych badań diagnostycznych. Opracowanie procedur analitycznych wykonano na próbkach CSF, surowicy oraz krwi pobranych od jednego pacjenta. W celu analizy TXRF zastosowano dwie metody preparatyki próbek. W pierwszej z nich do próbki płynu ustrojowego dodawano standard wewnętrzny w postaci roztworu galu, uzyskując finalne stężenie pierwiastka standardowego równe l mg/kg dla CSF i surowicy oraz 10 mg/kg dla próbki krwi. Z każdej próbki pobierano 2 ul płynu, nakrapiano na szkiełko krzemowe i suszono w temperaturze 40 C. W drugiej metodzie próbki płynów ustrojowych poddawano mineralizacji na mokro w kwasie azotowym zgodnie z następującą procedurą: do 200 ul płynu ustrojowego dodawano 0,5 ml 65% HNOa. Roztwór umieszczano w bombie" teflonowej (PTFE) i ogrzewano w temperaturze 180 C przez 18 godz. W celu standaryzacji wewnętrznej, po ostudzeniu dodawano roztwór galu uzyskując stężenie 10 mg/kg Ga w próbce. Próbki rozcieńczano wodą bidestylowaną, a następnie nakrapiano 2 ul płynu na szkiełko i suszono. Dokładność metody sprawdzano przy wykorzystaniu materiału referencyjnego IAEA, A-13 (krew zwierzęca). W tym celu 262 mg próbki poddawano mineralizacji na mokro w kwasie azotowym stosując 321
przedstawioną uprzednio procedurę. Z otrzymanego roztworu finalnego sporządzono 5 próbek pomiarowych. Analiza pierwiastkowa tkanki mózgu i płynów ustrojowych prowadzona była przy wykorzystaniu rentgenowskiego spektrometru fluorescencyjnego z dyspersją energii [4]. Jako źródło promieniowania wzbudzającego stosowano dyfrakcyjną lampę rentgenowską z anodą molibdenową. Pomiary prowadzano w powietrzu. W pomiarach MXRF wiązkę promieniowania X kolimowano przy wykorzystaniu szklanej kapilary o średnicy wyjściowej ok. 250 (im. Stosowany układ pomiarowy wyposażony jest w kamerę CCD współpracującą z mikroskopem optycznym, jak również w stolik do mocowania próbek posiadający możliwość translacji (w kierunkach XYZ) oraz rotacji. Pozwoliło to na wybór właściwego obszaru próbki oraz precyzyjne pozycjonowanie wiązki na próbce. Pomiary w płaszczyźnie XY wykonywano co 300 um w każdym kierunku. Czas pomiaru w każdym punkcie wynosił 600 s. Wzbudzone w próbce promieniowanie X rejestrowano detektorem półprzewodnikowym Si(Li) o zdolności rozdzielczej 170 ev dla energii 5,9 kev. Pomiary płynów ustrojowych wykonano metodą TXRF w warunkach opisanych szczegółowo w pracy [4]. Detektor półprzewodnikowy Si(Li) o zdolności rozdzielczej 170 ev dla energii 5,9 kev wykorzystywano do rejestracji promieniowania charakterystycznego pierwiastków. Czas pomiaru każdej próbki wynosił 1000 s. Widma uzyskiwane w pomiarach EDXRF ar lizowano przy wykorzystaniu programu komputerowego AXIL-QXAS [5]. Program ten był również stosowany w metodzie TXRF do wyznaczenia zawartości pierwiastków w płynach ustrojowych w oparciu o wewnętrzną standaryzację próbki. 3. WYNIKI BADAŃ I DYSKUSJA Skolimowana wiązka promieniowania X z lampy rentgenowskiej została zastosowana do analizy skrawków tkanki mózgu. Wielkościami wykorzystywanymi w analizie były linie promieniowania charakterystycznego pierwiastków (K-L2.3), jak również natężenie rozproszenia niekoherentnego linii Mo-K-L2,3. Pomiar natężenia rozproszenia niekoherentnego linii Mo-K-L2,3 pozwolił na oszacowanie masy powierzchniowej próbki. Umożliwiło to identyfikację w próbce obszarów anatomicznych, takich jak istota biała i szara, które poprzez różny stopień uwodnienia (odpowiednio 70 i 85%) po wysuszeniu próbki charakteryzują się różnymi masami powierzchniowymi [6]. Rozkład natężenia rozproszenia niekoherentnego linii Mo-K-L2,3 przedstawiono na rys. la. Pomiar promie- 322
niowania rozproszonego niekoherentnie umożliwia ponadto właściwą selekcję próbek i obszarów tkanki, co jest istotne przed planowanymi, precyzyjnymi pomiarami z \\ykorzystaniem wiązki promieniowania synchrotronowego o rozmiarach kilku (im. 132SO 12500 11750 11000 b) 3000 10250 9500 IfOO «««tooo 12SO c) 6 2, 3000 6500 O 1000 2000 Xpołożenie mikrohiąiki [[im] d) 3000 g a 8- O 1000 2000 X położę nie mikrowiązki [\im] 1500 1500 O 1000 2000 Xpołożenie mikrowiązki \\irn] 1000 2000 Xpołożenie mikro wiąiki [)im] Rys. 1. Rozkład (a) natężenia rozproszonego niekoherentnie promieniowania X Mo oraz (b-d) wybranych pierwiastków (Ij/I n i e koh) w skrawku tkanki mózgu. Uzyskane rezultaty pokazują, że analiza MXRF, przy zastosowanych warunkach pomiarowych, daje możliwość detekcji pierwiastków, takich jak P, S, Cl, K, Ca i Fe. Ze względu na zbyt niskie zawartości nie jest możliwe oznaczanie pozostałych pierwiastków śladowych, w rym Cu i Zn. Stosunek natężenia promieniowania charakterystycznego pierwiastków do natężenia promieniowania rozproszonego niekoherentnie (Ij/I n iekoh) wykorzystano jako miarę stężenia pierwiastków w analizowanym punkcie próbki. Wykonana analiza pokazuje, że znacząco wyższe zawartości S, Cl, K i Ca obserwowane sąw istocie szarej mózgu, podczas gdy poziom P jest porównywalny w obu istotach. Rozkład Fe w badanych próbkach nie jest jednorodny, jednak zmiany natężeń promieniowania charakterystycznego nie pokrywają się w tym przypadku z topografią badanych obszarów anatomicznych. Rozkład wybranych pierwiastków w próbce 323
tkanki mózgu przedstawiono na rys. Ib-d. Analiza zawartości Fe w tkankach ustrojowych wymaga szczególnej uwagi ze względu na możliwość detekcji Fe pochodzącego z naczyń krwionośnych występujących w badanym obszarze. Wykonane badania pozwoliły stwierdzić, że wysokiemu poziomowi Fe w obrębie naczynia krwionośnego towarzyszy istotne obniżenie zawartości P w porównaniu z obszarem tkanki mózgu. Właściwość ta może więc stanowić podstawę do jednoznacznego określania czy Fe obecne w badanym materiale pochodzi z krwi czy też ze struktur tkanki nerwowej. 100000 l 10000 1000-100 - bea preparatyki min*r&]i3łcj4 w kw&sie O 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Energia Rys. 2. Widma uzyskane z próbki płynu mózgowo-rdzeniowego metodą TXRF (linia K-L 2,3 pierwiastków, t=1000 s). Analiza TXRF płynów ustrojowych przy zastosowaniu dwóch metod preparatyki próbek pozwoliła na rejestrację szerokiego spektrum pierwiastków zawartych pomiędzy S a Rb. Typowe widmo uzyskane dla próbki płynu mózgowo-rdzeniowego przedstawia rys. 2. Porównanie widm uzyskanych dla próbki bez wstępnej preparatyki oraz próbki po mineralizacji pokazuje wyraźną redukcję tła w pomiarze materiału zmineralizowanego. Rezultatem tego jest możliwość rejestracji dodatkowo pierwiastków śladowych takich, jak np. Cr, Ni, Cu i Zn, ważnych z punktu widzenia neurologii. Ten sposób preparatyki próbek uniemożliwia jednak oznaczanie pierwiastków lotnych, takich jak Cl czy Br (rys. 2) oraz w pewnym stopniu również S. Z tego względu dla potrzeb kompleksowej analizy pierwiastkowej płynów ustrojowych konieczne jest stosowanie uzupełniających się metod preparatyki próbek. Wyniki analizy ilościowej dla CSF, surowicy oraz krwi, jak również wartości granic wykrywalności pierwiastków dla CSF zestawiono w tabeli 1. Granice wykrywalności pierwiastków dla surowicy oraz krwi są porównywalne. Dokładność oraz powtarzalność metody sprawdzono przez zastosowanie materiału referencyjnego IAEA, A-13. Porównanie wyników doświadczalnych fejl 324
Tabela 1. Wyniki analizy TXRF płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), surowicy oraz krwi. Pierwiastek K Ca Cr Fe Ni Cu Zn Br Rb CSF C [mg/kg] 127 (3) 67(2) 0,7 (0,2) 0,68 (0,03) 0,41 (0,08) 0,93 (0,08) 1,60 (0,06) 0,62 (0,06) 0,18(0,05) Surowica C [mg/kg] 182(5) 117(2) 12,2(0,5) 5,5 (0,5) 3,2(0,1) 1,6(0,1) 1,7(0,1) 2,42 (0,05) 0,20 (0,05) Krew C [mg/kg] 1560(20) 64(3) 2,7 (0,4) 418(4) 0,4(0,1) 1,5(0,1) 6,3 (0,2) 1,5(0,1) 2,3(0,1) CSF, granica wykrywalności [mg/kg] bez preparatyki 3,22 2,18 0,34 0,27 0,25 0,21 0,22 mineralizacja w kwasie 1,17 0,77 0,21 0,12 0,12 0,10 0,090 0,098 Wartości w nawiasach reprezentuj ą niepewności każdej wielkości na poziomie ufności 95%. z wartościami certyfikowanymi zamieszczono w tabeli 2. Uzyskane reziitaty wykazują dużą zgodność wartości eksperymentalnych i certyfikowanych. Ponadto, względna powtarzalność metody jest zawsze lepsza niż 10%. Tabela 2. Porównanie zmierzonych (TXRF) i certyfikowanych udziałów wagowych pierwiastków w materiale referencyjnym IAEA, A-13. Pierwiastek K Ca Fe Cu Zn Rb Eksperyment C [mg/kgl 2620(130) 260 (22) 2260 (78) 4,80 (0,62) 16,8(3,3) 2,61 (0,36) Certyfikat C [mg/kg] CL [mg/kg] 2500 2100-^2800 286 226-H332 2400 2200^-2500 4,3 3,7-1-4,8 13 12-1-14 2,3 1,7^3,1 C - udział wagowy pierwiastka; CL - przedział ufności na poziomie istotności 0.05; wartości w nawiasach reprezentują niepewności C na poziomie ufności 95%. 4. WNIOSKI Przeprowadzone badania pokazują, że spektrometria EDXRF może być wykorzystywana do analizy tkanki CUN, jak również płynów ustrojowych. Metoda MXRF umożliwia badanie rozkładu pierwiastków głównych oraz Fe w cienkich skrawkach tkanki CUN. Wykorzystanie natężenia niekoherentnego rozproszenia linii Mo-K-L/u umożliwia ocenę grubości 325
próbki oraz jakości preparatyki. Ponadto, analiza MXRF może być stosowana do rozróżniania obszarów istoty białej i szarej w badaniach mózgu i rdzenia kręgowego. Porównanie natężeń promieniowania charakterystycznego Fe i P może posłużyć do identyfikacji Fe pochodzącego z naczyń krwionośnych. Wykonane badania pokazały, że metoda TXRF jest użyteczna w badaniach płynów ustrojowych o bardzo niskich zawartościach pierwiastków śladowych. Szybsza i prostsza metoda bez wstępnej preparatyki próbki pozwala na detekcję pierwiastków głównych, jak również pierwiastków lotnych. Mineralizacja na mokro w kwasie azotowym znacząco poprawia granice wykrywalności, co umożliwia oznaczanie dodatkowo pierwiastków śladowych. Spektrometria EDXRF, jak również zastosowane procedury analityczne będą w przyszłości wykorzystywane w badaniach materiałów biomedycznych mających na celu poznanie roli pierwiastków głównych i śladowych w wybranych schorzeniach neurologicznych. LITERATURA [1]. Kienzl E., Jellinger K., Stachelberger H., Linert W.: Iron as a Catalyst for Oxidative Stress in the Pathogenesis of Parkinson's Disease? Life Sci., 65 (18-19), 1973-1976 (1999). [2]. Uitti R., Rajput A., Rozdilsky B., Bickis M., Wollin T., Yuen W.: Regional Metal Concentrations in Parkinson's Disease, Other Chronic Neurological Diseases, and Control Brain. The Canadian Journal of Neurological Science, 16, 310-314 (1989). [3]. Lovell M.A., Robertson J.D., Teesdale W.J., Campbell J.L., Markesbery W.R.: Copper, iron and zinc in Alzheimer's disease senile plaques. J. Neurol. Sci., 158 (1), 47-52 (1998). [4]. Holynska B., Ostachowicz B., Ostachowicz J., Ostrowski A., Ptasinski J., Wegrzynek D.: Multifunctional system for energy dispersive X-ray fluorescence analysis. J. Trace and Microprobe Techniques, L3 (2), 163-175 (1995). [5]. Van Espen P., Nullens H., Adams F.: A computer analysis of X-ray fluorescence spectra. Nucl. Instr. Methods, 142, 243-250 (1977). [6]. Frisell W.: Human Biochemistry. Collier Macmillan Publishers, London 1982, s. 470-495. 326