Cytotoksycznoœæ nanocz¹steczek srebra

Medycyna Wet. 2010, 66 (12) 833 Artyku³ przegl¹dowy Review Cytotoksycznoœæ nanocz¹steczek srebra JOANNA MA ACZEWSKA Katedra Mikrobiologii i Immunologii Klinicznej Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UWM, ul. Oczapowskiego 13, 10-719 Olsztyn Ma³aczewska J. Cytotoxicity of silver nanoparticles Summary Nanotechnology concerns the study, creation and manipulation of structures, devices, and systems at a nanoscale level. Such materials exhibit unique biological, physical and chemical properties compared to bulk materials, and are readily utilized in modern medicine and industry. Currently silver nanoparticles (SNP) are among the most commonly used nanomaterials due to their antimicrobial properties. Nanosilver can be found in medical devices, filters for water purification and in many consumer products as well. However, some recent studies indicate that nanosilver formulations may be cytotoxic to various types of both animal and human cells. Because their size is similar to cellular components they are able to bypass cell membranes, which results in cytotoxicity, although the exact mechanism of such an interaction is yet to be established. Several studies have reported the accumulation of SNP inside cells and their impact on cell morphology, while many of them claim that nanosilver induces cell necrosis or apoptosis due to decreasing function of mitochondria and catalyzes the production of reactive oxygen species, which leads to oxidative stress. Some reports indicate NPS can affect the physiology of immune competence and even of stem cells, which is of great importance for such crucial biological phenomena as the immunity and fertility of organisms. Taking into consideration all of the above and the fact of growing exposure of human bodies to increasing doses of nanoparticles, there is a real need for evaluating the potential risks of using nanosilver in our everyday lives. Keywords: silver nanoparticles, cytotoxicity, in vitro Nanotechnologia zajmuje siê projektowaniem, syntez¹ i manipulowaniem materia³ami o rozmiarach poni ej 100 nm. W zwi¹zku z ogromn¹ powierzchni¹ nanocz¹stek w stosunku do objêtoœci ich w³aœciwoœci fizyczne, chemiczne i biologiczne ró ni¹ siê znacz¹co od w³aœciwoœci materia³ów tradycyjnych, zaœ rozmiary zbli one do bia³ek lub sk³adników komórki umo - liwiaj¹ im penetrowanie naturalnych barier, jak b³ony biologiczne. Po ogólnoustrojowym wprowadzeniu nanocz¹stki mog¹ dotrzeæ do najdrobniejszych kapilar organizmu i dowolnych typów komórek, znalaz³y wiêc zastosowanie jako narzêdzia analityczne w biotechnologii i naukach przyrodniczych. Najnowsze badania wskazuj¹ jednak na ich niekorzystne oddzia³ywanie na organizmy ywe. Ten niezamierzony wp³yw sprowokowa³ powstanie nowej dziedziny nauki nanotoksykologii. Srebro jest obecnie najczêœciej u ywanym nanomateria³em, g³ównie dla swoich w³aœciwoœci przeciwbakteryjnych i dezynfekuj¹cych, a ³atwoœæ wbudowywania go w inne substancje czy powlekania ich powierzchni sprawia, e iloœæ jego zastosowañ roœnie w szybkim tempie. U ywane jest w medycynie, po wbudowaniu w antybakteryjne opatrunki, narzêdzia chirurgiczne i implanty, jak równie zosta³o dopuszczone, jako czynnik biobójczy, w oczyszczaniu i uzdatnianiu wody. O ile w powy szych przypadkach korzyœci stosowania wydaj¹ siê przewa aæ nad potencjalnym ryzykiem skutków ubocznych, o tyle niepokoj¹ca jest masowa ju produkcja artyku³ów codziennego u ytku, zawieraj¹cych nanosrebro tkanin, bielizny, kosmetyków, a nawet butelek i smoczków dla niemowl¹t, dziêki której wzrasta codzienna ekspozycja ludzkiego organizmu na oddzia³ywanie tego nowego materia³u (5, 10, 14, 15, 20, 21, 24). Potencjalny mechanizm cytotoksycznego dzia³ania nanocz¹stek srebra, mimo badañ prowadzonych przez liczne laboratoria, wci¹ pozostaje nie w pe³ni wyjaœniony. Przez d³ugi czas przypuszczano, e jedyn¹ toksyczn¹ form¹ srebra s¹ jony Ag +, wysoce reaktywne w zwi¹zku z posiadanym ³adunkiem. Nanocz¹stki srebra, skonstruowane przez cz³owieka z wielu atomów srebra metalicznego, jonów srebra lub zwi¹zków tego pierwiastka, maj¹ zdolnoœæ uwalniania jonów w roztworach. Dla tej w³aœciwoœci zosta³y zreszt¹ skonstruowane ich zadaniem jest dostarczenie jonów do œrodowiska komórek docelowych, czyli drobnoustro-

834 jów, w celu szybkiego i skutecznego dzia³ania biobójczego. Okaza³o siê jednak, i niekorzystne dzia³anie nanosrebra mo e byæ znacznie silniej wyra one ni dzia³anie samych jonów, uwalnianych z nanomateria- ³u. Wysnuto wiêc wniosek, e równie same nanocz¹stki wp³ywaj¹ na komórkê. Jeden z przypuszczalnych mechanizmów takiego dzia³ania wi¹ e siê z bezpoœrednim kontaktem nanocz¹stek z powierzchni¹ komórki i zaburzaniem jej czynnoœci poprzez dzia³anie na b³onê komórkow¹ i procesy z ni¹ zwi¹zane, zaœ drugi, okreœlany jako mechanizm konia trojañskiego, polega na przedostawaniu siê srebra w postaci nanocz¹steczek do wnêtrza komórki i uwalnianiu wysoce reaktywnych jonów dopiero wewn¹trz, w s¹siedztwie niezwykle wra liwych organelli. Ponadto cz¹steczki srebra, które same nie wniknê³y do komórki, mog¹ uwalniaæ jony w bezpoœrednim s¹siedztwie b³ony cytoplazmatycznej, co zwiêksza iloœæ Ag + dostaj¹cych siê do komórki niezale nie od procesu dyfuzji przez kana³y jonowe. Mechanizm wnikania nanosrebra do wnêtrza komórki jest zreszt¹ ró ny od kontrolowanego poboru jonów Ag + przez komórkê (naœladowanie jonów sodowych). Zasadnicz¹ rolê w przypadku nanocz¹stek odgrywa proces endocytozy, w rezultacie którego wnikaj¹ one do komórki zamkniête w endosomie, a ich dalsze losy mog¹ byæ ró ne. Zwykle, aby dosz³o do dzia³ania cytotoksycznego, cz¹stki musz¹ kumulowaæ siê w obrêbie komórki, a zjawisko takie w przypadku nanosrebra potwierdzaj¹ niektóre z przeprowadzonych badañ (6, 13, 14). Do tej pory opisanych zosta³o kilka efektów cytotoksycznego dzia³ania nanosrebra, choæ wyniki poszczególnych badañ nie zawsze s¹ zgodne. Przyczyn tego stanu rzeczy jest kilka. Pierwsza to brak standaryzacji metod i mo liwoœæ doboru ró nych testów, których wyniki nie musz¹ siê idealnie pokrywaæ. Drugim powodem jest stosowanie ró nych typów pod³ó biologicznych. Niektórzy badacze preferuj¹ pierwotne hodowle komórkowe, inni linie ci¹g³e. Te pierwsze, ze wzglêdu na dobre reprezentowanie tkanek, s¹ lepszym narzêdziem do badañ toksykologicznych in vitro, z drugiej strony jednak, linie komórkowe s¹ ³atwiejsze w utrzymaniu i zapewniaj¹ powtarzalnoœæ wyników, st¹d stosowane s¹ czêœciej (2). Ponadto w u yciu s¹ komórki pozyskane z ró nych tkanek, od ró nych gatunków, a nawet rodzajów krêgowców, co przek³ada siê na istotne ró nice ich wra liwoœci. Wreszcie trzecim powodem rozbie noœci s¹, niemo liwe do zbagatelizowania, ró nice dotycz¹ce u ywanych w badaniach nanocz¹steczek (ró ni producenci, cz¹steczki o ró - nym stopniu jednorodnoœci, rozmiarze, kszta³cie i sk³onnoœci do agregacji, rozpuszczane przed u yciem w ró nych mediach, czy wreszcie rozbie ne zakresy badanych stê eñ). Z drugiej jednak strony, opisana ró - norodnoœæ umo liwia szersz¹ i bardziej kompleksow¹ ocenê problemu. Do tej pory zaobserwowano nastêpuj¹ce typy zmian w komórkach poddanych dzia³aniu nanocz¹steczek srebra: Medycyna Wet. 2010, 66 (12) Odk³adanie srebra w komórce Badania dotycz¹ce tego zagadnienia nale ¹ do stosunkowo rzadkich w dostêpnej literaturze (3, 9, 10, 17, 24). Gromadzenie cz¹steczek srebra przy wy szych stê eniach (do 50 µg/ml) obserwowano w liniach szczurzych hepatocytów (BRL3A) i fibroblastów mysich (NIH3T3). W hepatocytach cz¹stki gromadzi³y siê g³ównie na powierzchni b³on komórkowych i tylko czêœæ przedostawa³a siê do wnêtrza komórek, zaœ w przypadku fibroblastów kumulacja cz¹stek zachodzi³a wewn¹trzkomórkowo, choæ w obu przypadkach autorzy nie okreœlili precyzyjnie ich lokalizacji (9, 10). Hsin i wsp. (9) wykazali ponadto ró nice w czasie gromadzenia srebra w komórce w zale noœci od badanego Ÿród³a nanocz¹stek. Bardziej toksyczny preparat powodowa³ kumulacjê cz¹steczek w komórce ju po 1 minucie, zaœ mniej toksyczny dopiero po 8 godzinach inkubacji. Arora i wsp. (3) poszli w swoich obserwacjach o krok dalej, ustalaj¹c przy u yciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego lokalizacjê nanocz¹stek srebra w pierwotnych fibroblastach i hepatocytach mysich (30 i 225 µg/ml). Agregaty cz¹stek gromadzi³y siê w mitochondriach i cytoplazmie obu typów komórek oraz w wakuolach hepatocytów. Lokalizacja srebra w mitochondriach mog³a, wed³ug autorów, prowadziæ do zaburzeñ w systemie enzymów antyoksydacyjnych i wzmo onej generacji reaktywnych form tlenu, toksycznych dla komórki. Innym typem komórek, ³atwo kumuluj¹cym w swym wnêtrzu nanocz¹stki, w zwi¹zku ze swoj¹ naturaln¹ zdolnoœci¹ do ich aktywnego poch³aniania, s¹ komórki erne. Yen i wsp. (24) wykazali obecnoœæ cz¹stek srebra we wnêtrzu makrofagów mysich po 3 h ekspozycji komórek na ich dzia³anie. Pozostawa³y one zamkniête w pêcherzykach cytoplazmatycznych, gdzie tworzy³y zlepy i nie dociera³y do organelli komórkowych. Natomiast najnowsze badania na mysich makrofagach potwierdzi³y mechanizm konia trojañskiego w cytotoksycznoœci nanosrebra. Obecnoœæ cz¹stek obserwowano bowiem w cytozolu aktywowanych makrofagów, nie stwierdzono natomiast ich wystêpowania w komórkach martwych, co wskazuje na proces jonizacji cz¹stek wewn¹trz komórek i nastêpuj¹ce po nim uwolnienie jonów z komórek uszkodzonych do pod³o a hodowlanego. Fagocytoza nanosrebra aktywowa³a w tym przypadku odpowiedÿ zapaln¹ i stymulowa³a wydzielanie przez makrofagi TNF-á, co prowadzi³o do uszkodzenia b³ony komórkowej i apoptozy, a wszystkie te zdarzenia, wed³ug autorów, by³y bezpoœrednim nastêpstwem wewn¹trzkomórkowej jonizacji srebra (17). Zmiana morfologii komórek Ten efekt toksycznego dzia³ania nanosrebra, zale - ny od u ytego stê enia cz¹stek i manifestuj¹cy siê zmian¹ typowego kszta³tu komórek, by³ obserwowany czêsto. Zakresy dawek powoduj¹cych takie zmiany osi¹ga³y jednak znaczn¹ rozpiêtoœæ, zale nie od typu

Medycyna Wet. 2010, 66 (12) 835 komórek, a linie ci¹g³e, zgodnie z przewidywaniami, by³y bardziej wra liwe od hodowli pierwotnych. Pierwotne fibroblasty i hepatocyty mysie po 24 h ekspozycji na wysokie stê enia nanosrebra (odpowiednio: 25 i 100 µg/ml) nie zmienia³y swojego wygl¹du, choæ dochodzi³o do nieznacznego naruszenia ci¹g³oœci hodowli. Dopiero dawki 50 i powy ej 200 µg/ml wywo³ywa- ³y widoczne zmiany (3). W przypadku nowotworowych linii ci¹g³ych HT-1080 (komórki ludzkiego w³ókniakomiêsaka) i A431 (ludzkie komórki raka skóry) tylko niskie stê enia nie zaburza³y morfologii komórek, nieco wy sze, 6,25-50 µg/ml, powodowa³y ju istotne zmiany w obu liniach (2). Podobne obserwacje, przy zbli onym zakresie stê eñ, poczyniono w stosunku do linii szczurzych hepatocytów, mysich komórek macierzystych plemników czy bydlêcych komórek endotelium siatkówki (5, 10, 11). Natomiast zmiana kszta³tu i wielkoœci mysich makrofagów pod wp³ywem nanosrebra (10 ppm), obserwowana przez Yen i wsp. (24), prócz dzia³ania cytotoksycznego wskazywa³a dodatkowo równie na aktywacjê komórek. Obni enie ywotnoœci komórek Obni enie ywotnoœci lub aktywnoœci proliferacyjnej to kolejny efekt niekorzystnego oddzia³ywania nanosrebra na wiêkszoœæ badanych typów komórek, o nasileniu zwykle wprost proporcjonalnym do u ytej dawki cz¹stek i czasu ekspozycji. Ponownie obserwowano szerok¹ rozpiêtoœæ dawek LC 50 /IC 50 /EC 50 (lethal/ inhibitory/effective concentration 50%), w zale noœci od u ytej hodowli i testu, za pomoc¹ którego tê wartoœæ wyznaczano. Wspomniana dawka dla komórek linii nowotworowych wynosi³a od 10,6 µg/ml (linia HT-1080), przez 11,6 µg/ml (A431), 27 µg/ml (HT29 ludzkie komórki gruczolakoraka okrê nicy), po a 92 µg/ml (HeLa ludzkie komórki raka szyjki macicy) (2, 8, 15). Dla komórek linii nienowotworowych rozpiêtoœæ powy szych dawek by³a równie du a. Stê- enia 1-10 µg/ml hamowa³y proliferacjê komórek endotelium wieñcowego (CEC), dla rybiej linii OLHNI2 dawka LC 50 wynosi³a 0,33 µg/cm 2, dla mysich komórek macierzystych plemników (C18-4) 8,75 µg/ml, dla hepatocytów szczurzych (BRL3A) waha³a siê miêdzy 19 i 24 µg/ml, w zale noœci od rozmiarów cz¹stek, dla komórek endotelium siatkówki bydlêcej (BRECs) wynosi³a 500 nm (ok. 25 µg/ml), dla komórek nerki chomika (BHK21) 27 µg/ml, zaœ dla mysich fibroblastów (NIH3T3) i szczurzych komórek aorty (A10) by³a zbli ona do 50 µg/ml (5, 8-11, 19, 22). Ponownie, wy sze stê enia nanosrebra by³y potrzebne dla wywo³ania efektu w komórkach hodowli pierwotnych ssaków: 50% spadek ywotnoœci fibroblastów i hepatocytów mysich zanotowano dopiero przy dawkach 61 (fibroblasty) i 449 µg/ml (hepatocyty) (3). Analogicznej zale noœci nie odnotowano jednak w przypadku rybich hodowli pierwotnych: LC 50 dla hepatocytów pstr¹ga têczowego wynosi³a zaledwie 1,9 µg/ml (6). Pewne rozbie noœci wyników dotycz¹ te wp³ywu nanosrebra na aktywnoœæ proliferacyjn¹ komórek immunokompetentnych. Wed³ug Shin i wsp. (21), stê enia powy ej 15 ppm znacz¹co obni a³y ywotnoœæ jednoj¹drzastych komórek krwi obwodowej cz³owieka, zaœ stê enia od 10 ppm ich zdolnoœæ do proliferacji. Podobnie w badaniach Yen i wsp. (24) na mysich makrofagach, stê enie 10 ppm drastycznie obni a³o proliferacjê komórek, podczas gdy dawka 1 ppm nie wp³ywa³a na ten parametr. Z drugiej jednak strony, Park i wsp. (17) donosz¹ o toksycznym dzia³aniu na mysie makrofagi otrzewnowe nanosrebra w dawce zaledwie 1,6 ppm. Niektórzy autorzy wzmiankowali o problemach technicznych z testowaniem wysokich stê eñ nanosrebra, w zwi¹zku z tendencj¹ do koagulacji i precypitacji cz¹steczek w pod³o u hodowlanym (5, 8). Rutynowo problem ten niwelowano przez dodawanie ró nych stabilizatorów chemicznych do roztworu cz¹steczek przed wprowadzeniem go do pod³o a hodowlanego, jednak bezpieczniejsz¹ metod¹ zapobiegaj¹c¹ aglomeryzacji nanocz¹stek jest powlekanie ich powierzchni ju na etapie produkcji. Toksycznoœæ takich cz¹stek równie oznaczano. Nanocz¹stki srebra pokryte PVP charakteryzowa³a wysoka toksycznoœæ dla linii ludzkich monocytów (THP-1), z EC 50 na poziomie 2,4 µg/ml (7), natomiast Murawala i wsp. (16) wykazali nietoksycznoœæ nanocz¹stek srebra pokrytych albumin¹ bydlêc¹ (stê enia 10 4 10 7 ) w stosunku do fibroblastów mysich (NIH-3T3), wysnuwaj¹c wniosek o ich zgodnoœci biologicznej, wynikaj¹cej w³aœnie z zastosowania biokompatybilnego czynnika powlekaj¹cego (9). Szkodliwe dawki nanosrebra, wyznaczane w badaniu ostrej cytotoksycznoœci, zwykle wielokrotnie przekracza³y jego stê enia dodawane do komercyjnych produktów farmaceutycznych. Arora i wsp. (2) wykazali przy u yciu linii HT-1080 i A431, e stê enie przeciwbakteryjne nanosrebra (1,56-6,25 µg/ml), stosowane w opatrunkach na rany jest bezpieczne dla komórek. Podobnie dawka 20 µg/g, któr¹ wzbogacono el antybakteryjny na rany i oparzenia, nie dzia³a³a cytotoksycznie na pierwotne fibroblasty i hepatocyty mysie (3). W zwi¹zku z powy szym, zgo³a inaczej planowano doœwiadczenia dotycz¹ce dzia³ania in vitro dostêpnych na rynku produktów zawieraj¹cych nanosrebro. Ich zadaniem by³o okreœlenie ryzyka toksycznoœci przewlek³ej, zwi¹zanej z d³ugotrwa³¹ ekspozycj¹ tkanek na dzia³anie niskich, progowych dawek cz¹stek. Badania takie s¹ jak najbardziej zasadne, co dobitnie wykazali Wataha i wsp. (23), poddaj¹c ludzkie monocyty (THP-1) d³ugotrwa³emu dzia³aniu (do 4 tygodni) niskich stê eñ jonów srebra, odpowiadaj¹cych 1-10% dawki wywo³uj¹cej ostre dzia³anie cytotoksyczne. Okaza³o siê, e ró nice miêdzy stê eniem Ag + wywo³uj¹cym minimalny efekt biologiczny a stê eniem letalnym by³y bardzo ma³e (8 i 12 µmol/l). Celem podobnego eksperymentu, przeprowadzonego przez Santoro i wsp. (20) by³o sprawdzenie u ytecznoœci na-

836 nosrebra jako czynnika antybakteryjnego w produkcji soczewek kontaktowych. Po 3 tygodniach ekspozycji ludzkich komórek nab³onka rogówki i makrofagów na dzia³anie niskich koncentracji nanocz¹stek (2, 4, 6 µm), zwykle wykazuj¹cych dzia³anie przeciwbakteryjne, autorzy nie uzyskali obni enia ywotnoœci komórek, choæ jednoczeœnie badane stê enia okaza³y siê niewystarczaj¹ce dla uzyskania oczekiwanego efektu biologicznego w stosunku do Pseudomonas aeruginosa. Z kolei Poon i Burd (18) zbadali wp³yw komercyjnego opatrunku na rany pooparzeniowe, zawieraj¹cego nanocz¹steczki srebra (Acticoat), na komórki zaanga owane w proces gojenia keratynocyty i fibroblasty. Ku zaskoczeniu badaczy, Acticoat okaza³ siê wysoce toksyczny dla obu typów komórek. Dawka LD 50 dla keratynocytów wynosi³a 12,5 10 4 %, zaœ koncentracja 78 10 4 % ca³kowicie hamowa³a ich aktywnoœæ metaboliczn¹ i proliferacyjn¹. W przypadku fibroblastów 90% redukcjê aktywnoœci wykazano przy stê eniu 33,3 10 4 %. Dawki toksyczne dla komórek by³y zbli one do uznawanych za skuteczne w zwalczaniu bakterii, co nasunê³o autorom wniosek o koniecznoœci stosowania badanego produktu z nale- yt¹ ostro noœci¹, bowiem uwalniane z niego jony Ag + nie wywieraj¹ wybiórczego dzia³ania na same bakterie, lecz z podobn¹ si³¹ uderzaj¹ w komórki zaanga owane w proces gojenia. Co prawda, po okreœleniu wp³ywu opatrunku na komórki jednowarstwowych hodowli, cytowani badacze, dla lepszego oddania warunków in vivo, przeprowadzili dalsze doœwiadczenia na modelu hodowli tkankowej, wykazuj¹c jej mniejsz¹ wra liwoœæ, uznali jednak, e efekt ten wynika³ z ograniczonej biodostêpnoœci nanosrebra, zwi¹zanej z du ¹ koncentracj¹ bia³ek w pod³o u hodowlanym, wi¹ ¹cych srebro i redukuj¹cych jego stê enie efektywne (EC). W zwi¹zku z w¹tpliwoœciami dotycz¹cymi bezpieczeñstwa stosowania opatrunku Acticoat, Agarwal i wsp. (1) podjêli próbê opracowania podobnego, mniej toksycznego produktu. Po przygotowaniu cienkich filmów zawieraj¹cych ustalone stê enia nanosrebra (0,4- -23,6 µg/cm 2 ) badali ich aktywnoœæ przeciwbakteryjn¹ i wp³yw na mysie fibroblasty (NIH-3T3). Stê enie cz¹stek na poziomie 5 µg/cm 2 by³o ju cytotoksyczne, jednak najni sza z testowanych dawek (0,4 µg/cm 2 ), wykazuj¹ca nadal silne dzia³anie bakteriobójcze w stosunku do Staphylococcus epidermidis, nie tylko nie by³a toksyczna, lecz wrêcz wspomaga³a adhezjê i proliferacjê komórek. Jest to jedno z zaledwie dwóch doniesieñ na temat proliferacyjnego efektu dzia³ania nanosrebra. Drugie dotyczy jego wp³ywu na komórki endotelium wieñcowego (CEC), gdzie, co prawda, równie zanotowano dwojaki efekt dzia³ania w zale noœci od stê enia cz¹stek, jednak w tym przypadku niskie stê enia (1-10 µg/ml) hamowa³y proliferacjê komórek, zaœ wysokie (50-100 µg/ml) stymulowa³y, a wp³yw ten by³ odwrotnie proporcjonalny do dzia³ania cytotoksycznego (19). Medycyna Wet. 2010, 66 (12) Apoptoza/nekroza Niekorzystny wp³yw nanosrebra na ywotnoœæ komórek wi¹za³ siê z wprowadzaniem ich na drogê nekrozy lub apoptozy, zale nie od u ytego stê enia. Progowa dawka powoduj¹ca apoptozê by³a zwykle znacznie ni sza od wywo³uj¹cej nekrozê, tak w przypadku komórek prawid³owych, jak i nowotworowych. Arora i wsp. (2) wyznaczyli stê enie apoptotyczne dla linii nowotworowych HT-1080 i A431 na, odpowiednio: 0,78 µg/ml i 1,56 µg/ml, podczas gdy nekrozê obu typów komórek wywo³ywa³o dopiero stê enie 12,5 µg/ ml. W przypadku pierwotnych fibroblastów i hepatocytów mysich stê enie inicjuj¹ce apoptozê (3,12 i 12,5 µg/ml) by³o równie wielokrotnie ni sze od powoduj¹cego nekrozê (100 i 500 µg/ml) (3). Du o mniejsza rozpiêtoœæ odpowiednich stê eñ srebra dotyczy³a natomiast ludzkich monocytów (stê enia 2,5 i 5 µg/ml), komórek macierzystych plemników mysich (5 i 10 µg/ ml), komórek linii HeLa (poni ej 60 i powy ej 120 µg/ml), a tak e linii nowotworowej HT29 i komórek nerki chomika BHK21 (11 i powy ej 44 µg/ml) (5, 7, 8, 15). W cytowanych pracach, potwierdzaj¹cych proapoptotyczne dzia³anie ni szych stê eñ nanosrebra, autorzy wykazywali fragmentacjê DNA w komórkach, charakterystyczny dla komórek apoptotycznych sposób wi¹zania barwników fluorescencyjnych i aktywacjê kaspazy-3, która uwa ana jest za punkt bez powrotu w zjawisku programowanej œmierci komórki (2, 3, 7-9, 11, 15). Ponadto Park i wsp. (17), po inkubacji z nanosrebrem mysich makrofagów otrzewnowych (RAW264.7), stwierdzili zwiêkszenie liczby komórek w fazie G1, a nastêpnie ca³kowit¹ blokadê cyklu komórkowego w fazie S, równie wskazuj¹ce na apoptozê. Pojawia³y siê tak e doniesienia o wp³ywie nanosrebra na ekspresjê regulatorów apoptozy (zwiêkszona fosforylacja proapoptotycznego bia³ka p53 i kinazy JNK, blokowanie szlaku antyapoptotycznej kinazy PI3K/Akt), prowadz¹c¹ do uwalniania cytochromu c z mitochondriów do cytozolu, translokacji Bax z cytozolu do mitochondriów i aktywacji kaskady kaspazowej, uruchamiaj¹cej cykl zjawisk prowadz¹cych do zniszczenia komórki. Taki schemat oddzia³ywania nanocz¹stek œwiadczy, zdaniem autorów, o istotnej roli stresu oksydacyjnego w cytotoksycznoœci srebra i indukcji apoptozy na drodze mitochondrialnego szlaku œmierci komórki (2, 7, 9, 11). W praktyce natomiast stymulacja apoptozy bywa zjawiskiem wielce po ¹danym w przypadku leków antyangiogenetycznych, preparatów hamuj¹cych nadmiern¹ odpowiedÿ immunologiczn¹, a zw³aszcza w terapii nowotworów. Gopinath i wsp. (8) oprócz dzia³ania proapoptotycznego nanosrebra w stosunku do komórek nowotworowych HT29 stwierdzili równie, e uwra liwia³o ono komórki na dzia³anie przeciwnowotworowego 5-fluorouracylu, a dzia³anie synergistyczne obu czynników znacz¹co nasila³o apoptozê komórek w porównaniu do efektu dzia³ania pojedynczych

Medycyna Wet. 2010, 66 (12) 837 substancji, co w praktyce klinicznej mog³oby pozwoliæ na zminimalizowanie skutków ubocznych terapii. Z drugiej jednak strony, w dostêpnej literaturze jest te doniesienie dotycz¹ce antyapoptotycznego efektu dzia- ³ania nanosrebra na komórki nowotworowe HCT 116 (ludzkie komórki raka okrê nicy), polegaj¹cego na wzmo onej ekspresji antyapoptotycznego bia³ka Bcl, co mo e œwiadczyæ o zmiennej aktywnoœci nanosrebra w zale noœci od rodzaju komórek nowotworowych (9). Stres oksydacyjny/generacja ROS Wiêkszoœæ znanych nanocz¹stek po wnikniêciu do komórki dostaje siê do mitochondriów, powoduj¹c ich prze³adowanie lub interferuj¹c z obron¹ antyoksydacyjn¹, co prowadzi do wzmo onej generacji reaktywnych form tlenu (ROS), której rezultatem jest brak równowagi, okreœlany jako stres oksydacyjny. Konsekwencje tego stanu s¹ wielokierunkowe i obejmuj¹ procesy takie, jak peroksydacja lipidów (zmiana w³aœciwoœci b³on biologicznych), modyfikacja lipoprotein czy wreszcie uszkodzenie bia³ek (utrata aktywnoœci enzymatycznej) i kwasów nukleinowych. Te zmiany przyczyniaj¹ siê do rozwoju schorzeñ zapalnych i degeneracyjnych, natomiast na poziomie samej komórki mog¹ skutkowaæ apoptoz¹ lub nekroz¹ na drodze mitochondrialnego szlaku œmierci komórki (4). Wzrost poziomu ROS, zale ny od stê enia nanosrebra, zanotowano w liniach szczurzych hepatocytów BRL3A i ludzkich monocytów THP-1, a najwy sze jego nasilenie w obu przypadkach wystêpowa³o po 6 godzinach ekspozycji komórek na dzia³anie srebra (7, 10). Równie Rosas-Hernandez i wsp. (19) w doœwiadczeniu na komórkach endotelium naczyñ wieñcowych i izolowanym pierœcieniu aorty uzyskali stymulacjê wytwarzania NO przez endotelium pod wp³ywem wysokich stê eñ srebra, zaœ podniesiony poziom tego wolnego rodnika dzia³a³ rozkurczaj¹co na pierœcieñ aorty. Dzia³ania takiego nie potwierdzili natomiast Farkas i wsp. (6) w pierwotnej hodowli hepatocytów pstr¹ga têczowego. Pojawienie siê zwiêkszonego poziomu reaktywnych form tlenu w komórce pocz¹tkowo skutkuje uruchomieniem komórkowej obrony antyoksydacyjnej, której wa nymi sk³adowymi s¹: dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) i wewn¹trzkomórkowy glutation (GSH). Badania Arora i wsp. (3) na pierwotnych hodowlach fibroblastów i hepatocytów albinotycznych myszy typu Swiss wskazuj¹ na sprawne uruchomienie tej obrony, wystarczaj¹ce, w przypadku badanych komórek, dla powstrzymania rozwoju stresu oksydacyjnego pod wp³ywem nanosrebra. Autorzy wykazali wzrost poziomu GSH i obni enie peroksydacji lipidów w fibroblastach, zaœ w komórkach w¹troby wzrost poziomu SOD i GSH. Co prawda, dawka nanosrebra, przy której uzyskali taki efekt, by³a stosunkowo niewysoka (1/2 IC 50 ), jednak podobna dawka w liniach HT-1080 i A431 wywo³a³a ju powa ne objawy stresu oksydacyjnego (2). Dopiero po wyczerpaniu mo liwoœci systemu ochronnego dochodzi do uruchomienia kaskady kaspaz i apoptozy komórki. Na taki z kolei scenariusz wskazuje wyraÿne obni enie poziomu SOD i GSH pod wp³ywem nanosrebra w linii mysich makrofagów i liniach nowotworowych HT-1080 i A431, zwiêkszona peroksydacja lipidów w liniach HT-1080 i A431, spadek poziomu GSH w linii szczurzych hepatocytów, zwiêkszony poziom metaloproteinaz, uczestnicz¹cych w degradacji komórek pod wp³ywem stresu oksydacyjnego w mysich makrofagach, czy wreszcie wzrost ekspresji genów stresu oksydacyjnego mt-2a i ho-1 w linii nowotworowej HeLa (2, 10, 15, 17). Zaburzenia metabolizmu i naruszenie integralnoœci b³on komórkowych Te dwa zjawiska s¹ bezpoœrednim nastêpstwem stresu oksydacyjnego, a standardowe testy szacuj¹ce ywotnoœæ komórek MTT i LDH opieraj¹ siê w³aœnie na okreœleniu nasilenia metabolizmu na poziomie mitochondriów (MTT) i stopnia integralnoœci b³on komórkowych (LDH). Autorzy wiêkszoœci cytowanych prac pos³ugiwali siê tymi testami przy szacowaniu ywotnoœci komórek, choæ stosunkowo nieliczni wspominali o ich bezpoœrednim znaczeniu. Znacz¹cy spadek funkcji mitochondriów wypunktowany zosta³ w przypadku hepatocytów szczurzych (BRL3A), pierwotnej hodowli hepatocytów pstr¹ga têczowego, keratynocytów, fibroblastów i mysich komórek macierzystych plemników (C18-4), zaœ znacz¹cy wyciek LDH z komórek, œwiadcz¹cy o uszkodzeniu b³on komórkowych tylko w przypadku linii BRL3A i hepatocytów pstr¹ga têczowego (5, 6, 10, 18). Ostatnie zjawisko zaobserwowali tak e Braydich-Stolle i wsp. (5) w linii C18-4, jednak niewielki stopieñ jego nasilenia wskazywa³ raczej, ich zdaniem, na oddzia³ywanie nanocz¹steczek na metabolizm komórek, nie zaœ na b³onê cytoplazmatyczn¹. Wp³yw na produkcjê cytokin (dzia³anie pro/przeciwzapalne) Najmniej zgodne s¹ natomiast wyniki badañ wp³ywu nanosrebra na odpowiedÿ komórek immunokompetentnych in vitro. Shin i wsp. (21), badaj¹c wp³yw nietoksycznych stê eñ srebra na jednoj¹drzaste leukocyty cz³owieka, stymulowane PHA, stwierdzili jego dzia³anie przeciwzapalne, manifestuj¹ce siê hamowaniem produkcji IL-5, IFN-ã i TNF-á, co, zdaniem autorów, mo e pozwoliæ na jego u ycie w terapii schorzeñ immunologicznych i zapalnych. Tego korzystnego dzia³ania nie potwierdzi³y jednak inne doœwiadczenia. Yen i wsp. (24) wykazali, co prawda, aktywacjê mysich makrofagów pod wp³ywem nanosrebra, nie wp³ywa³o ono jednak na ekspresjê genów cytokin prozapalnych: IL-1, IL-6 i TNF-á. Z kolei brak statystycznie istotnego wp³ywu na wytwarzanie IL-1â, IL-4, IL-6 i IL-8 przez ludzkie komórki rogówki i mysie monocyty/makrofagi wi¹za³ siê ju z pewnym wzrostem poziomu cytokin prozapalnych (20), a jednoznaczne

838 dzia³anie prozapalne nanosrebra wykazali Park i wsp. (17) w linii mysich makrofagów, notuj¹c wzmo on¹ produkcjê NO, zwiêkszony poziom TNF-á oraz nasilon¹ ekspresjê genów TNF-á. Dzia³anie genotoksyczne Ten ostatni rodzaj oddzia³ywania nale y do najbardziej niepokoj¹cych, gdy mo e stanowiæ zagro enie dla samoodnawialnoœci organizmów, byæ przyczyn¹ zaburzeñ p³odnoœci, muta-, kancero- lub teratogenezy. Co wiêcej, zjawisko to dotyczy nie tylko komórek zwierzêcych. Kumari i wsp. (12), badaj¹c wp³yw nanosrebra (50-100 ppm) na komórki sto ka wzrostu korzenia cebuli zwyczajnej (Allium cepa), stwierdzili obni enie indeksu mitotycznego, pojawienie siê aberracji chromosomowych i zaburzenie metafazy. Obserwowane zmiany, zdaniem autorów, wynikaæ mog³y z degradacji lub depolimeryzacji chromosomowego DNA i prawdopodobnie by³y nieodwracalne. Ponadto najwy sza dawka cz¹stek powodowa³a dezintegracjê œciany komórkowej w wiêkszoœci komórek. Wyniki te jednoznacznie wskazuj¹ na zdolnoœæ nanocz¹stek srebra do penetrowania, wchodzenia w interakcje ze sk³adnikami komórek roœlinnych i zaburzania ich podzia³ów, co pozwala dodatkowo domniemywaæ o ich ekotoksycznoœci. Podobny efekt oddzia³ywania nanosrebra na komórki zwierzêce, polegaj¹cy na zaburzeniu metafazy, powstawaniu aberracji chromosomowych i aneuploidalnoœci komórek, zanotowali Wise i wsp. (22) w stosunku do rybiej linii komórkowej OLHNI2. Ry ówka japoñska, której komórek u yto w doœwiadczeniu, jest organizmem modelowym w badaniach maj¹cych odniesienie do organizmu cz³owieka, st¹d uzyskane wyniki nie dotycz¹ wy³¹cznie wra liwoœci organizmów wodnych. Równie komórki ssaków nie by³y obojêtne na oddzia³ywanie nanosrebra w opisywanym zakresie Park i wsp. (17) po inkubacji mysich makrofagów ze srebrem stwierdzili zwiêkszenie liczby komórek w fazie G1cyklu komórkowego, a nastêpnie ca³kowit¹ blokadê cyklu w fazie S, co jest, zdaniem autorów, typowe dla czynników hamuj¹cych syntezê DNA. Reasumuj¹c, coraz chêtniej wykorzystywane w yciu codziennym nanosrebro mo e nie byæ tak dobrotliw¹ i obojêtn¹ dla organizmu cz³owieka substancj¹, jak do tej pory przypuszczano. Trudno oczekiwaæ pe³nego prze³o enia wyników badañ przeprowadzonych in vitro na skomplikowany uk³ad biologiczny, jakim jest ywy organizm, powinny one jednak wzbudziæ pewn¹ ostro noœæ. Szybki rozwój nanotechnologii wi¹- e siê ze sta³¹ ekspozycj¹ konsumentów na wzrastaj¹ce dawki nanocz¹stek. Bior¹c zaœ pod uwagê zdolnoœæ nanosrebra do penetrowania b³on biologicznych, wp³ywania na sprawne funkcjonowanie mitochondriów i zwi¹zan¹ z nimi ochronê antyoksydacyjn¹ komórki, a tak e jego potencjalne dzia³anie genotoksyczne, przy jednoczesnej zdolnoœci do kumulowania siê w komórce, mo na spodziewaæ siê niekorzystnych, d³ugofalowych efektów tej ekspozycji. Rozwa ny bilans Medycyna Wet. 2010, 66 (12) zysków i strat przed u yciem modnych i intensywnie promowanych nanoproduktów w yciu codziennym wydaje siê odpowiednim wyborem. Piœmiennictwo 1.Agarwal A., Weis T. L., Schurr M. J., Faith N. G., Czuprynski C. J., McAnulty J. F., Murphy C. J., Abbott N. L.: Surfaces modified with nanometr-thick silver- -impregnated polymeric films that kill bacteria but support growth of mammalian cells. Biomaterials 2010, 31, 680-690. 2. Arora S., Jain J., Rajwade J. M., Paknikar K. M.: Cellular responses induced by silver nanoparticles: In vitro studies. Toxicol. Lett. 2008, 179, 93-100. 3.Arora S., Jain J., Rajwade J. M., Paknikar K. M.: Interactions of silver nanoparticles with primary mouse fibroblasts and liver cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2009, 236, 310-318. 4. Bogacka A., Kucharska E.: Wp³yw hemodializy na produkcjê wolnych rodników i nasilenie stresu oksydacyjnego. Immunologia kliniczna: wybrane aspekty. EDYCJA s.c., Olsztyn 2010, 193-202. 5. Braydich-Stolle L., Hussain S., Schlager J. J., Hofmann M. C.: In vitro cytotoxicity of nanoparticles in mammalian germline stem cells. Toxicol. Sci. 2005, 2, 412-419. 6. Farkas J., Christian P., Gallego Urea J. A., Roos N., Hassellöv M., Tollefsen K. E., Thomas K. V.: Effects of silver and gold nanoparticles on rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hepatocytes. Aquat. Toxicol. 2010, 96, 44-52. 7.Foldbjerg R., Olsen P., Hougaard M., Dang D. A., Hoffmann H. J., Autrup H.: PVP-coated silver nanoparticles and silver ions induced reactive oxygen species, apoptosis and necrosis in THP-1 monocytes. Toxicol. Lett. 2009, 190, 156-162. 8. Gopinath P., Gogoi S. K., Chattopadhyay A., Ghosh S. S.: Implications of silver nanoparticle induced cell apoptosis for in vitro gene therapy. Nanotechnology 2008, 19, 1-10. 9.Hsin Y. H., Chen C. F., Huang S., Shih T. S., Lai P. S., Chueh P. J.: The apoptotic effect of nanosilver is mediated by a ROS- and JNK-dependent mechanism involving the mitochondrial pathway in NIH3T3 cells. Toxicol. Lett. 2008, 179, 130-139. 10.Hussain S. M., Hess K. L., Gearhart J. M., Geiss K. T., Schlager J. J.: In vitro toxicity of nanoparticles in BRL3A rat liver cells. Toxicol. in Vitro 2005, 19, 975-983. 11. Kalishwaralal K., Banumathi E., Ram Kumar Pandian S., Deepak V., Muniyandi J., Eom S. H., Gurunathan S.: Silver nanoparticles inhibit VEGF induced cell proliferation and migration in bovine retinal endothelial cells. Colloids Surf. B 2009, 73, 51-57. 12.Kumari M., Mukherjee A., Chandrasekaran N.: Genotoxicity of silver nanoparticles in Allium cepa. Sci. Total Environ. 2009, 407, 5243-5246. 13.Lubick N.: Nanosilver toxicity: ions, nanoparticles or both? Environ. Sci. Technol. 2008, 42, 8617. 14.Luoma S. N.: Silver nanotechnologies and the environment: old problems or new challenges? PEN 15, september 2008 (report by Project on Emerging Nanotechnologies; http://www.nanotechproject.org/publications/). 15.Miura N., Shinohara Y.: Cytotoxic effect and apoptosis induction by silver nanoparticles in HeLa cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009, 390, 733-737. 16.Murawala P., Phadnis S. M., Bhonde R. R., Prasad B. L.: In situ synthesis of water dispersible bovine serum albumin capped gold and silver nanoparticles and their cytocompatibility studies. Colloids Surf. B 2009, 73, 224-228. 17.Park E. J., Yi J., Kim Y., Choi K., Park K.: Silver nanoparticles induce cytotoxicity by a Trojan-horse type mechanism. Toxicol. in Vitro 2010, 24, 872-878. 18.Poon V. K., Burd A.: In vitro cytotoxicity of silver: implication for clinical wound care. Burns 2004, 30, 140-147. 19.Rosas-Hernandez H., Jimenez-Badillo S., Martinez-Cuevas P. P., Gracia- -Espino E., Terrones H., Terrones M., Hussain S. M., Ali S. F., Gonzalez C.: Effects of 45-nm silver nanoparticles on coronary endothelial cells and isolated rat aortic rings. Toxicol. Lett. 2009, 191, 305-313. 20.Santoro C. M., Duchsherer N. L., Grainger D. W.: Minimal in vitro antimicrobial efficacy and ocular cell toxicity from silver nanoparticles. Nanobiotechnol. 2007, 3, 55-65. 21.Shin S. H., Ye M. K., Kim H. S., Kang H. S.: The effects of nano-silver on the proliferation and cytokine expression by peripheral blood mononuclear cells. Int. Immunopharmacol. 2007, 7, 1813-1818. 22.Sir Wise J. P., Goodale B. C., Wise S. S., Craig G. A., Pongan A. F., Walter R. B., Thompson W. D., Ng A.-K., Aboueissa A. M., Mitani H., Spalding M. J., Mason M. D.: Silver nanospheres are cytotoxic and genotoxic to fish cells. Aquat. Toxicol. 2010, 97, 34-41. 23.Wataha J. C., Lockwood P. E., Schedle A., Noda M.: Ag, Cu, Hg and Ni ions alter the metabolizm of human monocytes during extender low-dose exposures. J. Oral Rehabil. 2002, 29, 133-139. 24.Yen H. J., Hsu S. H., Tsai C. L.: Cytotoxicity and immunological response of gold and silver nanoparticles of different sizes. Small 2009, 5, 1553-1561. Adres autora: dr Joanna Ma³aczewska, ul. Oczapowskiego 13, 10-957 Olsztyn; e-mail: j.malaczewska7@wp.pl