Ćwiczenie 2 Temat: Wpływ czynników fizyko-chemicznych na drobnoustroje Temperatura jako czynnik wzrostowy Temperatura jest jednym z najważniejszych czynników warunkujących wzrost i procesy życiowe drobnoustrojów. Działanie na mikroorganizmy może mieć charakter bezpośredni: wpływając na szybkość wzrostu, aktywność enzymów, skład chemiczny komórek, wymagania pokarmowe, lub pośredni regulując rozpuszczalność związków wewnątrzkomórkowych, transport jonów, dyfuzję substancji chemicznych i zmianę właściwości osmotycznych błon komórkowych. Każdy gatunek mikroorganizmów charakteryzuje się trzema kardynalnymi temperaturami rozwoju: minimalną, optymalną i maksymalną. W temperaturze optymalnej mikroorganizmy rozwijają się najszybciej, natomiast powyżej temperatury maksymalnej i poniżej temperatury minimalnej wzrost mikroorganizmów jest niemożliwy. Drobnoustroje ze względu na wymagania temperaturowe można podzielić na 4 grupy: termofile, mezofile, psychrofile, psychrotrofy (Rys. 1). Rysunek 1 Zakres temperaturowy wzrostu drobnoustrojów. Copyright 2011 - Mikš-Krajnik M. - 1 -
1. Drobnoustroje termofilne (termofile - ciepłolubne) to mikroorganizmy charakteryzujące się wysoką optymalną temperaturą wzrostu w granicach 45-50ºC, a niekiedy nawet wyższej od 60ºC. Większość termofili to bakterie gram-dodatnie przetrwalnikujące np. Geobacillus stearothermophilus, Bacillus coagulans przetrwalniki tych bakterii wyróżniają się wysoką ciepłoodpornością i wyznaczają parametry sterylizacji konserw produkowanych do krajów z ciepłej i gorącej strefy klimatycznej. Do drobnoustrojów termofilnych należą również niektóre gatunki bakterii fermentacji mlekowej, np. Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii stosowany w przemysłowej produkcji kwasu mlekowego oraz Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus i Streptococcus thermophilus wchodzące w skład zakwasów jogurtowych, a także bakterie stosowane w produkcji wysokodogrzewanych serów dojrzewających. 2. Drobnoustroje mezofile (mezofile obojętnolubne) to drobnoustroje rozwijające się w temperaturach umiarkowanych. Ich optymalna temperatura wzrostu mieści się zazwyczaj w zakresie od 20 do 45ºC. Wśród mezofili wyróżniamy organizmy saprofityczne i większość gatunków chorobotwórczych dla człowieka np. Salmonella sp., Staphylococcus aureus. 3. Drobnoustroje psychrofilne (psychrofile zimnolubne) to mikroorganizmy rosnące już w temperaturach od 0ºC, o temperaturze optymalnej nie wyższej niż 15ºC i maksymalnej - 20ºC. Wzrost mikroorganizmów psychrofilnych w niskich temperaturach jest uwarunkowany aktywnością enzymów katalizujących reakcje metaboliczne w tych temperaturach. Psychrofile znalazły dobre warunki do rozwoju w regionach podbiegunowych, szczytach gór, jeziorach, morzach i oceanach strefy umiarkowanej. Do tej grupy mikroorganizmów zaliczamy gatunki bakterii należące do rodzajów: Alcaligenes, Bacillus, Psudomonas, Flavobacterium, Arthrobacter. 4. Drobnoustroje psychrotrofowe (psychrotrofy) to mikroorganizmy, które bez względu na swoje temperatury kardynalne posiadają zdolność rozwoju w temperaturze 7ºC. Do psychrotrofów zaliczamy wszystkie psychrofile i część mezofili. W przemyśle spożywczym mikroorganizmy o niskich temperaturach wzrostu stanowią istotny problem w przechowalnictwie żywności. Psychrofile spotykane są najczęściej w produktach żywnościowych pochodzenia morskiego, natomiast psychrotrofy w nabiale, wędlinach, warzywach i owocach. Szczególne niebezpieczeństwo zatruć pokarmowych stwarzają patogenne psychrotrofy: Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus. Copyright 2011 - Mikš-Krajnik M. - 2 -
Temperatura jako czynnik zabójczy W temperaturze przekraczającej maksymalną temperaturę wzrostu drobnoustrojów następuje ich termiczna inaktywacja. Pod wpływem ogrzewania zachodzi mechanizm śmierci cieplnej drobnoustrojów. Prowadzi on do powstania letalnych, nieodwracalnych zmian w komórce. Zniszczeniu ulega głównie struktura przestrzenna białek komórkowych oraz kwasów nukleinowych (DNA, RNA). Wzrost temperatury prowadzi również do obniżenia aktywności, dezaktywacji enzymów podtrzymujących metabolizm komórki, a następnie zahamowania przemian wewnątrzkomórkowych. Wysoka temperatura uszkadza funkcjonowanie błony cytoplazmatycznej, która staje się przepuszczalna dla białek, kwasów nukleinowych i innych substancji wewnątrzkomórkowych. Ze względu na specyficzną oporność mikroorganizmów na działanie wysokiej temperatury wyróżnia się mikroorganizmy ciepłooporne i ciepłowrażliwe. Najbardziej ciepłooporną grupą mikroorganizmów są formy przetrwalne (spory) laseczek z rodzaju Bacillus i Clostridium. Mniejszą ciepłoopornością w porównaniu z przetrwalnikami wykazują komórki wegetatywne (rys. 2). Mikroorganizmy Ciepłooporne Bakterie przetrwalnikujące Formy przetrwalne (spory) Ciepłowrażliwe Bakterie nie-przetrwalnikujące Komórki wegetatywne Rysunek 2 Podział mikroorganizmów na bakterie ciepłooporne i ciepłowrażliwe. Pasteryzacja może być jest stosowana w mikrobiologii do badania zdolności przetrwalnikowania (pasteryzacja 80ºC przez 10 min) oraz ciepłooporności mikroorganizmów (pasteryzacja 63,5ºC przez 30 min). Działanie temperatury 80ºC przez 10 min ma charakter letalny w stosunku do komórek wegetatywnych, oporne są tylko przetrwalniki bakterii z rodzajów Bacillus i Clostridium. Działanie temperatury 63,5ºC przez 30 min przetrzymują tzw. bakterie ciepłooporne np. komórki wegetatywne Enterococcus, Corynebacterium, Micrococcus oraz przetrwalniki Bacillus i Clostridium. Copyright 2011 - Mikš-Krajnik M. - 3 -
Stężenie jonów wodorowych (ph) środowiska Drobnoustroje posiadają zdolność wzrostu i spełniania swoich funkcji życiowych tylko w określonym zakresie wartości ph środowiska. Przedział ph, w którym mogą się rozwijać, wyznaczają wartości minimalne i maksymalne, natomiast wartość ph, przy której szybkość wzrostu jest najwyższa, nazywamy optymalną. Drobnoustroje acydofilne (acydofile, kwasolubne) - charakteryzujące się zdolnością wzrostu w środowisku przy niskiej wartości ph (ph < 4.0), Ich optymalny wzrost obserwuje się w zakresie ph od 2.0 do 5.0. Do typowej mikroflory acydofilnej zaliczamy m.in. bakterie fermentacji mlekowej (do ph =3.5), bakterie octowe, a także termoacydofilne bakterie należące do rodzaju Alicyclobacillus (ich wzrost odnotowano w pasteryzowanych sokach owocowych). Wśród acydofili występują liczne gatunki drożdży i grzybów strzępkowych, np. gatunki należące do rodzajów: Saccharomyces, Aspergillus, Penicillium. Drobnoustroje neutrofile (neutrofile, obojętnolubne) odznaczające się optymalnym wzrostem w środowisku o ph bliskim obojętnemu (ph 6.0-7.5). Większość bakterii należy do tej grupy drobnoustrojów. Drobnoustroje alkalifilne (alkalifile, zasadolubne) mikroorganizmy, których wzrost występuje w środowiskach alkalicznych o ph > 9.0, o optymalnej dla wzrostu wartości ph od 8.0 do 11.0. Do alkalifili zaliczamy m.in. Vibrio cholerae (przecinkowiec cholery), Streptococcus pneumoniae (paciorkowiec zapalenia płuc), bakterie nitryfikacyjne z rodzajów Nitrosomonas i Nitrobacter oraz Enterococcus faecalis, wybrane gatunki Bacillus sp. Aktywność wody w środowisku (a w ) Wzrost mikroorganizmów jest możliwy tylko w obecności wody. Do określenia zapotrzebowania na wodę drobnoustrojów przyjęto termin aktywność wody w środowisku (a w ). Czysta chemicznie woda ma aktywność wody równą 1, ze wzrostem stężenia związków rozpuszczalnych a w maleje poniżej tej wartości. Aktywność wody, przy której szybkość wzrostu mikroorganizmów jest najwyższa nazywany optymalną. Spadek a w poniżej wartości optymalnej powoduje spowolnienie wzrostu i wydłużenie fazy adaptacyjnej. A w, poniżej której zostaje zahamowany wzrost drobnoustrojów, nazywamy minimalną. Dla większości bakterii optymalna wartość a w mieści się w zakresie 0.96-0.99. Najniższą a w, przy której stwierdzono wzrost bakterii to 0.75. Są to organizmy halofilne, które wykazują wyraźne zapotrzebowanie na NaCl np. Vibio, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus. Grzyby w porównaniu z bakteriami mogą rozwijać się przy niższych wartościach a w, grzyby strzępkowe między 0.91-0.80, drożdże do a w =0.88. Stwierdzono jednak wzrost kserofilnych grzybów strzępkowych przy a w =0.65 (Rys. 3). Copyright 2011 - Mikš-Krajnik M. - 4 -
Rysunek 3 Aktywność wody (a w ) a wzrost różnych grup drobnoustrojów. Promieniowanie UV W praktyce mikrobiologicznej wykorzystuje się najczęściej hamujące lub zabójcze działanie na mikroorganizmy nadfioletowej części widma słonecznego o długości fali 250-260 nm, a więc tą część widma, która jest najsilniej absorbowane przez kwasy nukleinowe (DNA, RNA). Promieniowanie UV jest wykorzystywane do niszczenia mikroorganizmów występujących w powietrzu i na odkrytych powierzchniach zamkniętych pomieszczeń o niewielkim zapyleniu (silosów, magazynów i chłodni, laboratoriów). Najbardziej efektywnie działa promieniowanie o długości fali 260 nm, które jest pochłaniane przez zasady purynowe i pirymidynowe oraz promieniowanie o długości fali 280 nm - pochłaniane przez aminokwasy aromatyczne (tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina). Następuje również unieczynnienie enzymów, surowic i toksyn. Czynniki chemiczne Środki dezynfekcyjne - Patrz chemiczne metody wyjaławiania (patrz: ćwiczenie 1 przewodnik dla studentów studiów stacjonarnych). Obowiązuje również treść przewodnika do ćwiczenia 4 i 5 dla studentów studiów stacjonarnych. Copyright 2011 - Mikš-Krajnik M. - 5 -
1. Posiewy celem wyizolowania z materiału Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Saccharomyces cerevisiae Materiał stanowią 3 kultury A, B i C każde stanowisko bada jedną kulturę. Posiewy wykonać do następujących podłóż: Kultura A bulion z glukozą posiew ezą, agar odżywczy posiew metodą izolacyjną, YGC-agar posiew metodą izolacyjną, inkubacja w temp. 25ºC przez 96 godzin. Kultura B pożywka z żółcią, zielenią brylantową, laktozą i rurką Dürhama posiew ezą, agar odżywczy posiew metodą izolacyjną, podłoże VRBL-agar posiew metodą izolacyjną, inkubacja w temp. 37ºC przez 48 godzin. Kultura C pożywka wg Burzyńskiej z azydkiem sodu, glukozą, fioletem krystalicznym i purpurą bromokrezolową posiew ezą, agar odżywczy posiew metodą izolacyjną, podłoże Slanetza i Bartleya posiew metodą izolacyjną, inkubacja w temp. 37ºC przez 48 godzin. 2. Badanie stosunku do tlenu szczepów Materiał stanowią 3 szczepy: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Clostridium butyricum każde stanowisko bada jeden szczep. posiew metodą kłutą hodowli do słupka bulion agar bez glukozy 3. Badanie właściwości gazotwórczych szczepów Materiał stanowią 3 szczepy: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Clostridium butyricum każde stanowisko bada jeden szczep. posiew 1 cm 3 hodowli do upłynnionego słupka bulion agar z glukozą 4. Badanie oddziaływania wybranych środków chemicznych na wzrost drobnoustrojów Zaobserwować oddziaływanie hamujące/stymulujące lub brak oddziaływania wybranych środków chemicznych na szczepy: Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis Copyright 2011 - Mikš-Krajnik M. - 6 -
i Candida lipolytica w posiewach metodą powierzchniową z zastosowaniem metody dyfuzyjno-krążkowej. Wyniki zestawić w tabeli 1. Tabela 1 Szczep Escherichia coli Enterococcus faecalis Bacillus subtilis Candida lipolytica środek dezynfekcyjny nadtlenek wodoru kwas mlekowy kwas octowy alkohol etylowy 5. Badanie wrażliwości szczepów na antybiotyki Zaobserwować stopień wrażliwości szczepów badanych na wybrane antybiotyki (metoda dyfuzyjno-krążkowa). Wyniki zestawić w tabeli 2. Tabela 2 Szczep Escherichia coli Enterococcus faecalis Bacillus subtilis Candida lipolytica penicylina Średnice stref zahamowania wzrostu [mm] dla poszczególnych antybiotyków 6. Badanie oddziaływania ph środowiska i temperatury na wzrost drobnoustrojów Wykonać posiewy badanych szczepów oczkiem ezy do bulionu z glukozą (każde stanowisko bada jeden szczep): o ph 7,0 próba kontrolna; inkubacja w temp. optymalnej o ph 4,5 i 9,6 badanie oddziaływania ph środowiska na wzrost szczepów; inkubacja w temp. optymalnej o ph 7,0 następnie spasteryzować w temp. 63,5ºC przez 30 min + 5 min na ogrzanie; inkubacja w temp. optymalnej o ph 7,0 następnie spasteryzować w temp. 80ºC przez 10 min + 5 min na ogrzanie; inkubacja w temp. optymalnej o ph 7,0; inkubacja w temp. 7 ºC Copyright 2011 - Mikš-Krajnik M. - 7 -
Warunki inkubacji badanych na ćwiczeniach szczepów: Pseudomonas fluorescens - 30ºC przez 48 godzin, Escherichia coli - 37ºC przez 48 godzin, Clostridium butyricum - 37ºC przez 48 godzin, Enterococcus faecalis - 37ºC przez 48 godzin, Bacillus subtilis - 30ºC przez 48 godzin, Candida lipolytica - 25ºC przez 96 godzin. 7. Poprawa kolokwium 1 Copyright 2011 - Mikš-Krajnik M. - 8 -
Odczyty na ćwiczeniu 3 1. Odczytać wyniki posiewów, zestawić je w tabelach i zinterpretować Tabela 1 Kultura A bulion z glukozą pożywka z żółcią, laktozą i zielenią brylantową pożywka wg Burzyńskiej agar odżywczy YGCagar VRBLagar podłoże Slanetz a B C Tabela 2 Szczep Właściwości gazotwórcze Stosunek do tlenu Pseudomonas fluorescens Escherichia coli Clostridium butyricum Tabela 3 Szczep Escherichia coli Enterococcus faecalis Bacillus subtilis Candida lipolytica Wzrost po pasteryzacji wzrost Wzrost w ph w temp. 63,5ºC/30min. 80ºC/10min. 7,0 4,5 9,6 7ºC Copyright 2011 - Mikš-Krajnik M. - 9 -