Wpływ peptydów przeciwdrobnoustrojowych na biofilm Candida

220 Alergia Astma Immunologia 2010, 15 (4): 220-225 Wpływ peptydów przeciwdrobnoustrojowych na biofilm Candida The influence of antimicrobial peptides on Candida biofilm MAŁGORZATA DAWGUL 1, WIOLETTA BARAŃSKA-RYBAK 2, SYLWIA BIELIŃSKA 1, ROMAN NOWICKI 2, WOJCIECH KAMYSZ 1 1 Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej, Wydział Farmaceutyczny Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego 2 Klinika Dermatologii i Wenerologii, Wydział Lekarski Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego Praca została sfinansowana z grantu MNiSW nr NN405630638 Streszczenie Wprowadzenie. Patogeneza zakażeń grzybiczych człowieka najczęściej związana jest z powstawaniem biofilmu Candida albicans na: skórze, błonach śluzowych oraz stosowanych materiałach medycznych, tj. cewnikach lub stentach. W warunkach naturalnych drobnoustroje przylegają do powierzchni w organizmie ludzkim i produkują zewnątrzkomórkowe polisacharydy. W efekcie powstaje zorganizowana trójwymiarowa struktura charakteryzująca się zwiększoną opornością na stosowane środki przeciwgrzybicze, co jest przyczyną szeregu komplikacji terapeutycznych. W związku z tym poszukiwanie nowych substancji aktywnych wobec zorganizowanych struktur stanowi pilną potrzebę współczesnej medycyny. Cel. Celem niniejszej pracy badawczej było oszacowanie wartości naturalnych antybiotyków peptydowych jako potencjalnych środków do zwalczania biofilmu Candida. Materiał i metody. W toku badań wykorzystano szczep referencyjny Candida albicans ATCC 10231 oraz następujące związki peptydowe: Citropinę 1.1, lipopeptydy Palm-KK-NH 2 i Palm-RR-NH 2, Tachyplezynę 3 oraz Temporynę A. Badano wpływ ww. związków na biofilm Candida oraz na zdolności adhezyjne komórek drożdżaka do fragmentów cewnika urologicznego. Wyniki. Wszystkie spośród przebadanych antybiotyków peptydowych okazały się aktywne w stosunku do komórek drożdżaka po adhezji, jak również względem dojrzałego biofilmu. Związki wykazały również zdolność zapobiegania formowaniu struktury biofilmu. Najaktywniejszymi peptydami były lipopeptydy oraz Tachyplezyna 3. Wnioski. Uzyskane wyniki zachęcają do dalszych badań aktywności peptydów przeciwdrobnoustrojowych względem biofilmu formowanego przez drożdżaki z rodzaju Candida. Słowa kluczowe: biofilm, Candida, peptydy przeciwdrobnoustrojowe Summary Introduction. The pathogenesis of human fungal infections is generally connected with biofilm formation on the surface of skin, mucosa or biomaterials, i.e. stents or catheters. In natural conditions microbes are attached to the surface in human body and produce extracellular polysaccharides. In effect a well organized three dimensional structure is created. It is characterized by a higher resistance to conventional antimicrobials, which causes numerous therapeutic complications. For this reason the search for new active agents constitutes an urgent need of the present medicine. Aim. The goal of this study was to estimate the value of antimicrobial peptides as potential agents against Candida biofilm. Material and methods. In this work the reference strain Candida albicans ATCC 10231 and the following peptides: Citropin 1.1, Palm- KK-NH 2, Palm-RR-NH 2, Tachyplesin 3 and Temporin A were used. The influence of these compounds on the Candida biofilm and on its cohesive properties were investigated. Results. All of the tested compounds were active against Candida biofilm and against Candida cells after their adhesion to the urinary catheter. Peptides have exhibited the ability to prevent the biofilm formation. The most active compounds were lipopeptides and Tachyplesin 3. Conclusions. The results encourage further investigations of the action of antimicrobial peptides against Candida biofilm. Key words: biofilm, Candida, antimicrobial peptides Alergia Astma Immunologia 2010, 15 (4): 220-225 www.alergia-astma-immunologia.eu Przyjęto do druku: 26.08.2010 Adres do korespondencji / Address for correspondence Małgorzata Dawgul Al. Gen. J. Hallera 107, 80-416 Gdańsk tel.: 58 349 32 25; 691 930 090 fax: 58 349 32 24 e-mail: mdawgul@gumed.edu.pl Grzyby, w tym Candida albicans, pełnią ważną rolę w patogenezie schorzeń atopowych. Stwierdzono udział drożdżaków w indukowaniu odczynów alergicznych, zaostrzaniu stanów zapalnych w przebiegu skazy atopowej, a także niekorzystny wpływ na leczenie chorób alergicznych wywołanych innymi alergenami. Znaczenie grzybów z rodzaju Candida w procesach alergicznych nie jest jeszcze dokładnie przebadane. Wiadomo, że mogą być przyczyną odpowiedzi typu komórkowego oraz natychmiastowego. Właściwości alergizujące warunkowane są obecnością

Dawgul M i wsp. Wpływ peptydów przeciwdrobnoustrojowych na biofilm Candida 221 grupy antygenów, zdolnych do reagowania ze swoistymi IgE człowieka. Do najlepiej poznanych antygenów Candida należą: enolaza, mannan oraz kwaśna proteinaza. Ich udział w poszczególnych manifestacjach klinicznych skazy atopowej jest zróżnicowany. Odpowiedź Th1-zależna, indukowana przez mannan, pełni istotną rolę w patogenezie atopowego zapalenia skóry, natomiast kwaśna proteinaza może być odpowiedzialna za wywoływanie skurczu oskrzeli u chorych na astmę oskrzelową [1]. Dane z ostatnich lat wskazują, że zakażenia grzybicze są coraz częściej spotykane. Są to zarówno zakażenia powierzchniowe, które obejmują błony śluzowe i skórę, jak i grzybice głębokie. Szczepy Candida albicans stanowią ponad 70% szczepów izolowanych od chorych dotkniętych drożdżycą, występują powszechnie jako czynniki etiologiczne zakażeń jamy ustnej oraz pochwy [2,3]. Infekcje drożdżakowe są ściśle związane ze zjawiskiem tworzenia przez nie biofilmu. Biofilm jest odpowiedzialny za ponad 60% infekcji o przewlekłym lub nawrotowym przebiegu oraz za zakażenia związane z implantami i innymi sztucznymi elementami (szwy, cewniki). Drobnoustroje obecne w biofilmie są chronione przed czynnikami szkodliwymi, takimi jak: antybiotyki, bakteriofagi, czynniki obrony komórkowej i humoralnej gospodarza. Często te czynniki indukują powstawanie biofilmu. Przyjmuje się, że największe znaczenie w indukcji powstawania biofilmu mają antybiotyki o szerokim spektrum działania: penicyliny, chloramfenikol, klindamycyna. W organizmie ludzkim Candida albicans nie egzystują jako pojedyncze organizmy, lecz kolonizują powierzchnie i tworzą zorganizowane struktury. Pierwszym etapem formowania biofilmu jest proces adhezji komórek drobnoustroju do powierzchni tkanek, ciał obcych lub tworzyw sztucznych, wykorzystywanych do produkcji materiałów medycznych. Po kolonizacji powierzchni komórki drożdżaka różnicują się i rozmnażają, dochodzi do zmian ekspresji poszczególnych genów. Mikroorganizmy żyjące w populacji biofilmu są zróżnicowane pod względem: metabolizmu, stopnia poboru tlenu, tempa wzrostu, syntezy składników zewnątrzkomórkowych oraz wymagań odżywczych. Grupy komórek grzybów (blastospory, pseudostrzępki, strzępki) otoczone są polisacharydową zewnątrzkomórkową macierzą i posiadają zdolność kontaktowania się między sobą przy pomocy systemu quorum-sensing [4,5]. Charakterystyczną cechą struktury biofilmu jest zmniejszona wrażliwość na środki przeciwdrobnoustrojowe. W niektórych przypadkach stężenie antybiotyku lub środka przeciwgrzybiczego niezbędne do eradykacji biofilmu ponad tysiąckrotnie przekracza stężenie aktywne wobec hodowli planktonowej. Wykazano, że komórki Candida albicans, rosnące w postaci biofilmu, charakteryzują się zwiększoną opornością na działanie powszechnie stosowanych środków przeciwgrzybiczych, tj. nystatyny, amfoterycyny B, flukonazolu, ketokonazolu oraz terbinafiny w porównaniu z komórkami wolnopływającymi [6,7]. Oporność struktury biofilmu jest związana ze zmianami metabolizmu komórek żyjących wewnątrz populacji. Polisacharydowe matrix może utrudniać dyfuzję leku, prawdopodobnie dochodzi również do aktywacji genów kodujących enzymy rozkładające leki. W przypadku oporności na pochodne azolowe mamy do czynienia z aktywnością drug efflux pumps wypompowujących leki z komórek. Istotna jest także zdolność biofilmu do generowania populacji komórek przetrwałych (persister cells). Stanowią one około 1% drobnoustrojów w dojrzałym biofilmie i charakteryzują się dużą tolerancją w stosunku do wysokich stężeń stosowanych środków przeciwgrzybiczych. Po zakończonym leczeniu komórki przetrwałe umożliwiają rozwój nowego biofilmu [8,9]. Szacuje się, że ponad 60% zakażeń w środowisku szpitalnym jest związanych z biofilmem. Liczba ta niewątpliwie będzie rosła z powodu coraz powszechniejszego stosowania przyrządów medycznych wykonywanych z tworzyw sztucznych. Zakażenia najczęściej rozwijają się drogą egzogenną i stanowią istotny problem terapeutyczny. W związku z tym potrzeba poszukiwania nowych skutecznych wobec biofilmu związków jest oczywista. Potencjalnym narzędziem do walki z biofilmem mogą być endogenne antybiotyki peptydowe (peptydy przeciwdrobnoustrojowe). Są to związki pochodzenia naturalnego, charakteryzujące się bardzo szerokim spektrum działania przeciwdrobnoustrojowego, które obejmuje bakterie, wirusy, grzyby oraz niektóre pierwotniaki. Peptydy przeciwdrobnoustrojowe stanowią istotny element układu odpornościowego wszystkich organizmów eukariotycznych. W organizmie ludzkim są produkowane w dużych ilościach w miejscu stanu zapalnego indukowanego infekcją. Wykazują zdolność do eradykacji drobnoustrojów w wyniku oddziaływań z ich błoną komórkową, prowadzących do lizy komórki mikroorganizmu. Oprócz typowego działania przeciwdrobnoustrojowego peptydy posiadają również zdolności immunomodulujące, stymulujące procesy gojenia, a także mogą hamować niszczenie tkanek ludzkich poprzez blokowanie enzymów proteolitycznych wydzielanych przez liczne mikroorganizmy [10-12]. Zwiększona ekspresja peptydów przeciwdrobnoustrojowych w łuszczycy koreluje w tej chorobie z małą podatnością zmian skórnych na infekcje bakteryjne i grzybicze. Diametralnie różna sytuacja jest obserwowana u pacjentów z atopowym zapaleniem skóry, u których obniżony poziom ludzkiej katelicydyny LL-37 i defensyny hbd-2 sprzyja częstym infekcjom bakteryjnym, grzybiczym i wirusowym. Z obserwacji powstawania biofilmu wynika, że na cewnikach dożylnych w pierwszych dziesięciu dniach powstaje biofilm na powierzchni zewnętrznej, natomiast na dłużej utrzymywanych cewnikach na ich powierzchni wewnętrznej. Dlatego też najczęściej mamy do czynienia z kolonizacją kateterów drobnoustrojami pochodzącymi ze skóry pacjenta [13,14]. Obecnie wiele zespołów naukowych podejmuje tematykę peptydów przeciwdrobnoustrojowych pod kątem ich potencjalnego zastosowania w terapii zakażeń związanych z biofilmem. Wyniki badań nad ludzką Katelicydyną LL-37 oraz prób stosowania peptydów, takich jak Citropina 1.1, Temporyna A, czy IB-367 na modelach zwierzęcych infekcji związanych z biofilmem potwierdzają zasadność tego kierunku badań naukowych [15-18]. Dobre rezultaty badań aktywności peptydów przeciwdrobnoustrojowych wobec biofilmów bakteryjnych oraz ich wysoka aktywność przeciwgrzybicza [19] skłoniły nasz zespół do podjęcia tematu peptydów przeciwdrobnoustrojowych pod kątem ich zastosowania w walce z biofilmem Candida. Celem pracy było ustalenie wpływu wybranych antybiotyków peptydowych na procesy adhezji oraz powstawania bioflimu Candida albicans na fragmentach

222 Alergia Astma Immunologia 2010, 15 (4): 220-225 cewnika urologicznego, który jest doskonałym modelem do badań nad biofilmem. Przebadano także aktywność związków wobec komórek po adhezji do cewnika oraz wobec dojrzałego biofilmu. MATERIAŁ I METODY Wykorzystane w badaniach płytki polistyrenowe 96- oraz 24-dołkowe pochodziły z Greiner Bio-one (USA). Jako modelowy materiał medyczny posłużył lateksowy silikonowany cewnik urologiczny Foley a. Szczep referencyjny Candida albicans ATCC 10231 pochodził z Polskiej Kolekcji Drobnoustrojów Państwowej Akademii Nauk we Wrocławiu. Pożywka płynna Sabouraud broth oraz podłoże stałe Sabouraud agar pochodziły z firmy Sigma-Aldrich (Szwajcaria), natomiast resazuryna oraz konwencjonalne związki przeciwgrzybicze wykorzystane w badaniach (Amfoterycyna B, Nystatyna) zostały zakupione od Sigma-Aldrich (USA). Antybiotyki peptydowe: Citropina 1.1, Palmitoilo-lizyno-lizyna (Palm-KK-NH 2 ), Palmitoilo-arginino-arginina (Palm-RR-NH 2 ), Tachyplezyna 3 oraz Temporyna A zostały zsyntetyzowane w laboratorium syntezy Katedry i Zakładu Chemii Nieorganicznej Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego. Synteza związków została przeprowadzona metodą Merriefielda na stałym nośniku polimerowym z wykorzystaniem metodologii Fmoc. Po syntezie związki poddano procesowi oczyszczania za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) lub za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE). Czystość związków została potwierdzona analizami HPLC, natomiast tożsamość za pomocą spektrometrii mas z jonizacyjną metodą desorpcji laserowej na matrycy (MALDI-TOF) [20]. Dla peptydów oraz konwencjonalnych związków przeciwgrzybiczych określono minimalne stężenie hamujące wzrost badanego szczepu (MIC) za pomocą metody seryjnych mikrorozcieńczeń w bulionie Sabouraud na 96-dołkowych płytkach polistyrenowych. Oceny wyników dokonywano wizualnie po 48-godzinnej inkubacji w temperaturze 25 C. Za MIC uznawano stężenie, przy zastosowaniu którego nie obserwowano wzrostu mikroorganizmów. Następnie stężenia MIC oraz dwa kolejne wyższe posiewano na podłoża stałe Sabouraud, po 48-godzinnej inkubacji odczytywano minimalne stężenie grzybobójcze (MFC) związków w stosunku do badanego szczepu. Po uzyskaniu wyników MIC i MFC, na 24-dołkowych płytkach polistyrenowych przeprowadzono badania wpływu peptydów przeciwdrobnoustrojowych na proces adhezji komórek Candida albicans do fragmentów cewnika urologicznego oraz ich zdolności do eradykacji po adhezji. W badaniu pierwszym jałowe fragmenty cewnika Foley a inkubowano przez godzinę w temperaturze 35 C w zawiesinie komórek drożdżaka w pożywce płynnej o gęstości 0,5 McF z dodatkiem środków przeciwgrzybiczych w odpowiednich stężeniach. Następnie fragmenty cewników płukano za pomocą buforu fosforanowego i umieszczano w bulionie Sabouraud na 24 godziny, po upływie których dodawano roztworu resazuryny. Odczytu wyników dokonywano wizualnie po 24- godzinnej inkubacji na podstawie zmiany barwy odczynnika wywołującego. Resazuryna w formie niezredukowanej ma barwę niebieską, w kontakcie z żywymi komórkami ulega redukcji pod wpływem dehydrogenaz komórkowych do różowej rezorufiny. Kontrolnie wykonywano badania dla próbek zawierających zawiesinę Candida bez dodatku badanych związków oraz dla próbek niezawierających drobnoustrojów. Za stężenia aktywne uznawano odpowiadające kolorem kontroli jałowości. W badaniu eradykacji komórek po adhezji do cewnika postępowano analogicznie, z tą różnicą, że pierwsza inkubacja (1-godzinna) była przeprowadzana bez dodatku środka przeciwgrzybiczego, który dodawano przed następną inkubacją (24-godzinną). Badania aktywności związków wobec dojrzałego biofilmu oraz ich wpływu na proces powstawania biofilmu przeprowadzono również z użyciem 24-dołkowych płytek polistyrenowych. Celem wyhodowania biofilmu Candida na fragmentach cewników umieszczano je w zawiesinie komórek C. albicans w bulionie Sabouraud o gęstości 0,5 McF i inkubowano przez 3 doby w temperaturze 35 C. Co 24 godziny fragmenty cewnika płukano buforem fosforanowym i umieszczano w świeżej pożywce płynnej. Po upływie 72 godzin fragmenty cewników przenoszono do roztworów badanych związków w bulionie Sabouraud celem oznaczenia stężeń aktywnych wobec powstałych struktur. Po 24-godzinnej inkubacji dodawano roztworu resazuryny. Odczytu wyników dokonywano po upływie kolejnych 24 godzin. Wpływ związków na proces tworzenia biofilmu określono, przeprowadzając 4-dobową inkubację cewników w zawiesinie komórek Candida z dodatkiem substancji przeciwgrzybicznych. Każdego dnia fragmenty cewnika płukano za pomocą buforu fosforanowego i umieszczano w świeżej pożywce z dodatkiem badanych związków. Po 98 godzinach dodawano roztworu resazuryny, po 24-godzinnej inkubacji dokonywano odczytu wyników. Wszystkie eksperymenty były powtarzane trzykrotnie (ryc. 1). Ryc. 1. Ocena aktywności Palm-KK-NH2 1. Badanie zdolności do eradykacji po adhezji: 1A kontrola jałowości (zabarwienie niebieskie z.n.); 1B stężenie MIC (z.n.); 1C 2MIC (z.n.); 1D 4MIC (z.n.); 1E 8MIC (z.n.); 1F kontrola pozytywna (zabarwienie różowe) 2. Badanie zdolności do zapobiegania adhezji: 2A kontrola jałowości (z.n.); 2B stężenie MIC (zabarwienie różowo-fioletowe); 2C 2MIC (z.n.); 2D 4MIC (z.n.); 2E 4MIC (z.n.); 2F kontrola pozytywna (zabarwienie różowe)

Dawgul M i wsp. Wpływ peptydów przeciwdrobnoustrojowych na biofilm Candida 223 WYNIKI Peptydy przeciwdrobnoustrojowe wykazują aktywność hamowania wzrostu oraz aktywność grzybobójczą w stosunku do komórek planktonowych badanego szczepu w stężeniach znacznie wyższych niż wykorzystane w badaniach konwencjonalne środki przeciwgrzybicze. W badaniach nad procesami adhezji oraz nad biofilmem różnice aktywności nie są tak znaczne. Wszystkie spośród przebadanych związków wykazały zdolność eradykacji komórek drobnoustrojów po adhezji na cewniku. Peptydy były aktywne w stężeniach wielokrotnie niższych niż ich wartości MIC, natomiast konwencjonalne środki przeciwgrzybiczne działały na komórki Candida po adhezji do cewnika w stężeniach odpowiadających ich wartościom MIC. Do eradykacji dojrzałego biofilmu potrzebne były nieco wyższe stężenia Citropiny oraz Temporyny A w porównaniu z badaniem poprzednim. Pozostałe peptydy przeciwdrobnoustrojowe oraz Amfoterycyna B wykazywały aktywność w stosunku do dojrzałego biofilmu w stężeniach odpowiadającym MIC lub niższych, natomiast w przypadku Nystatyny konieczne było użycie stężenia 4-krotnie wyższego od MIC. Najniższą aktywność badane związki prezentowały w badaniu zdolności do zapobiegania adhezji, w którym ekspozycja cewnika na drobnoustroje i substancje przeciwgrzybiczne trwała 1 godzinę, po czym przenoszono je do czystego podłoża płynnego. Citropina 1.1 oraz Temporyna A nie wykazały aktywności w stosowanych stężeniach. Lipopeptydy, Tachyplezyna 3 oraz Nystatyna działały w podobnym zakresie stężeń. Najaktywniejszym związkiem była Amfoterycyna B. Podczas badania zdolności zapobiegania powstawaniu biofilmu ekspozycja na związki przeciwdrobnoustrojowe trwała przez cały czas przeprowadzania badania. W badaniu tym niezbędne było użycie najniższych stężeń badanych związków. Palm-RR-NH2, Tachyplezyna 3 oraz Amfoterycyna B były aktywne w stężeniach wielokrotnie niższych niż ich stężenia MIC. Pozostałe związki wykazały aktywność w zakresie stężeń odpowiadających ich stężeniom aktywnym wobec komórek po adhezji na cewniku (tabela I i II). DYSKUSJA Narastanie oporności drobnoustrojów na klasyczne leki przeciwgrzybicze nasuwa potrzebę poszukiwania nowych leków do monoterapii, jak również substancji mających potencjalne zastosowanie w terapii skojarzonej. Innym, bardziej nowoczesnym kierunkiem jest poszukiwanie związków posiadających zdolności stymulujące układ odpornościowy organizmu ludzkiego. Peptydy przeciwdrobnoustrojowe mają ogromny potencjał, ponieważ mogą znaleźć zastosowanie do wszystkich wymienionych celów. Wiele prac doświadczalnych potwierdza wysoką aktywność peptydów przeciwdrobnoustrojowych wobec szerokiego spektrum mikroorganizmów. Coraz częściej podejmuje się temat peptydów przeciwdrobnoustrojowych pod kątem ich zastosowania w zakażeniach związanych z biofilmem. Udowodniono, że Katelicydyna Tabela I. Wyniki badań wpływu badanych związków na proces adhezji oraz bioflim Candida albicans Związek/stężenie [µg/ml] Eradykacja po adhezji Zapobieganie adhezji Eradykacja biofilmu Zapobieganie formowaniu biofilmu Citropina 1.1 32-64 >512 96 32-64 Palm-KK-NH 2 32 128-256 32 32 Palm-RR-NH 2 32 128-256 32 16 Tachyplezyna 3 32 256 32 16 Temporyna A 128 >512 256 64 Amfoterycyna B 2 2 2 0,5 Nystatyna 4 128-256 16 4 Tabela II. Wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost badanego szczepu (MIC) oraz minimalnego stężenia grzybobójczego (MFC) Związek/stężenie [µg/ml] MIC MFC Citropina 1.1 64 128 Palm-KK-NH 2 128 256 Palm-RR-NH 2 128 256 Tachyplezyna 3 32 64 Temporyna A 64 128 Amfoterycyna B 2 4 Nystatyna 4 8

224 Alergia Astma Immunologia 2010, 15 (4): 220-225 ludzka LL-37 wykazuje zdolności zapobiegania formowaniu się struktury biofilmu w stężeniach znacznie niższych niż stężenia hamujące wzrost wolnopływających komórek [13-15]. Dobrze poznana została aktywność przeciwgrzybicza Aureiny 1.2, Citropiny 1.1, Temporyny A oraz Uperyny 3.6, syntetycznych peptydów przeciwdrobnoustrojowych, które pierwotnie izolowano ze skóry płazów. W naturze stanowią główny element ochrony delikatnej skóry żab w bogatym w drobnoustroje środowisku wodnym. Oprócz właściwości przeciwgrzybiczych wykazują również szeroki zakres aktywności przeciwbakteryjnej. W dotychczas przeprowadzonych badaniach aktywne wobec Candida albicans okazały się również: a) Iseganan (IB-367), analog Protegryny naturalnie znajdowanej m.in. w neutrofilach ludzkich; b) Omiganan, analog Indolicydyny pierwotnie wyizolowanej z bydlęcych neutrofili; c) Pexiganan, analog Magaininy pozyskiwanej ze skóry płazów; d) Demegen, analog Histatyny obecnej w ślinie ssaków, obecnie na etapie badań klinicznych prowadzonych w celu sprawdzenia zasadności jego zastosowania w zapaleniu dziąseł, infekcjach drożdżakowych jamy ustnej [19,21]. Badania aktywności względem biofilmu częściej dotyczą problemu biofilmów bakteryjnych. Wykazano, że Temporyna A jest skuteczna w leczeniu zainfekowanych ran przewlekłych, natomiast Citropina 1.1 wykazuje synergizm z Rifampicyną oraz Minocykliną w leczeniu gronkowcowych infekcji odcewnikowych. IB-367 okazał się być aktywny w stosunku do biofilmów formowanych przez bakterie gram-dodatnie. Wyniki prezentowanej pracy korespondują z doniesieniami literaturowymi na ten temat i zachęcają do kontynuacji badań nad aktywnością peptydów wobec biofilmu formowanego przez drożdżaki z rodzaju Candida [16-18]. Na uwagę zasługuje fakt, iż antybiotyki peptydowe prezentowały aktywność wobec biofilmu w stężeniach odpowiadających ich stężeniom MIC. Sugeruje to, że substancje te dobrze penetrują przez polisacharydowe matrix oraz nie ulegają w nim inaktywacji. Cechy te są bardzo pożądane w przypadku potencjalnych środków do zwalczania biofilmu. Dla porównania, w przypadku Nystatyny do eradykacji biofilmu potrzebne było stężenie 4-krotnie wyższe od aktywnego wobec komórek wolnopływających. Amfoterycyna B, podobnie jak peptydy, była aktywna wobec struktury biofilmu w stężeniu odpowiadającemu MIC. Było to stężenie znacznie niższe niż w przypadku peptydów. Niewątpliwie związek ten należy do bardzo aktywnych związków przeciwgrzybiczych, przy czym jest także jednym z najbardziej toksycznych środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych w lecznictwie. Bezpieczeństwo stosowania peptydów przeciwdrobnoustrojowych nie zostało jak dotąd ostatecznie potwierdzone, jednakże naturalne pochodzenie oraz fakt, że ich bardzo wysokie stężenia osiągane w organizmie ludzkim w miejscu infekcji nie powodują destrukcji tkanek ani innych reakcji niepożądanych, pozwalają spodziewać się niskiej toksyczności tych związków. Wykorzystane w niniejszej pracy antybiotyki peptydowe nie wykazują właściwości hemolitycznej w stężeniach aktywnych wobec drobnoustrojów, w tym biofilmu [22,23]. Konieczne jest jeszcze przeprowadzenie wielu badań dotyczących bezpieczeństwa stosowania oraz aktywności peptydów przeciwdrobnoustrojowych, zanim będą mogły znaleźć zastosowanie w lecznictwie. Jeśli tak się stanie, istnieje duża szansa na to, że wskazaniem do stosowania tych związków będą zakażenia związane z biofilmem. Peptydy mogłyby być stosowane jako samodzielne leki przeciwgrzybicze, jak również uzupełnienie terapii lekami konwencjonalnymi. Związki te posiadają także ogromny potencjał w profilaktyce takich zakażeń. Stężenia peptydów, niezbędne dla uzyskania aktywności zapobiegania tworzeniu biofilmu, były wielokrotnie niższe od ich wartości MIC. Powlekanie materiałów medycznych powłokami zawierającymi peptydy przeciwdrobnoustrojowe pozwoliłoby ograniczyć rozwój infekcji towarzyszących stosowaniu materiałów medycznych i w związku z tym zaoszczędzić ogromne sumy pieniędzy wydawanych na leczenie takich zakażeń. Wnioski, wyciągnięte na podstawie wyników otrzymanych podczas przygotowywania niniejszej pracy, zachęcają do kontynuacji badań nad aktywnością peptydów wobec biofilmu Candida, a także do podjęcia tematu biofilmów formowanych przez inne drobnoustroje. Piśmiennictwo 1. Kasperska-Zając A, Rogala E. Candida albicans czynnik przyczynowy chorób alergicznych. Alergia Astma Immunologia 2002; 7(4): 170-173. 2. Kollia K, Velegraki A. Candidemia. Arch Hellen Med. 2008; 25(1): 41-59. 3. Seferyńska I, Pałynyczko G, Warzocha K. Układowe zakażenia grzybicze: etiologia, rozpoznanie i nowe możliwości lecznicze. Acta Haematol Pol. 2005; 36(1): 45-54. 4. Zhu W, Filler SG. Interactions of Candida albicans with epithelial cells. Cell Microbiol. 2010; 12(3): 273-282. 5. Xu KD, McFeters GA, Stewart PS. Biofilm resistance to antimicrobial agents. Microbiology 2000; 146: 547-549. 6. Chandra J, Mukhejree PK, Leidich S i wsp. Antifungal resistance of candida biofilms fordem on denture acrylic in vitro. J Dent Res. 2001; 80: 903-908. 7. Mnichowska-Polanowska M, Kaczała M, Giedrys-Kalemba S. Lekooporność oraz zwalczanie biofilmu Candida, Mikologia Lekarska 2009; 16(3): 165-169. 8. Mah TF, O Toole GA. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 2001; 9: 34-39. 9. Lewis K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr Top Microbiol Immunol. 2008; 322: 107-131. 10. Metz-Boutigue MH, Shooshtarizadeh P, Prevost G i wsp. Antimicrobial peptides present in mammalian skin and gut are multifunctional defence molecules. Curr Pharm Des. 2010; 16(9): 1024-1039. 11. Boman HG. Antibacterial peptides: basic facts and emerging concepts. J Internal Med. 2003; 254: 197-215. 12. Hancock REW, Diamond G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences., Trends Microbiol. 2000; 8: 402-410.

Dawgul M i wsp. Wpływ peptydów przeciwdrobnoustrojowych na biofilm Candida 225 13. Tecle T, Tripathi S, Hartshorn KL. Defensins and cathelicidins in lung immunity. Inn Immun. 2010; 16(3): 151-159. 14. Bowdish DME, Davidson DJ, Lau YE i wsp. Impact of LL-37 on antiinfective immunity., J Leukoc Biol. 2005; 77: 451-459. 15. Overhage J, Campisano A, Bains M, i wsp. Human host defense peptide LL-37 prevents bacterial biofilm formation. Inf Immun. 2008; 76: 4176-4182. 16. Simonetti O, Cirioni O, Goteri G i wsp. Temporin A is effective in MRSA-infected wounds through bactericidal activity and acceleration of wound repair in a murine model. Peptides 2008; 29: 520-528. 17. Cirioni O, Giacometti A, Ghiselli R i wsp. Citropin 1.1-treated central venous catheters improve the efficacy of hydrophobic antibiotics in the treatment of experimental staphylococcal catheter-related infection., Peptides 2006; 27: 1210-1216. 18. Ghiselli R, Giacometti A, Cirioni O i wsp. Pretreatment with the Protegrin IB-367 affects gram-positive biofilm and enhances the therapeutic efficiacy of linezolid in animal models of central venous catheter infection., J Parent Ent Nutr. 2007; 31(6): 463-468. 19. Kamysz W, Nadolski P, Kędzia A i wsp. In vitro activity of synthetic antimicrobial peptides against Candida. Pol. J. Microb. 2006; 55: 303-307. 20. Fields GB, Noble RL. Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acides. Int J Pept Protein Res. 1990; 35: 161-214. 21. Paquette DW, Simpson DM, Friden P i wsp. Safety and clinical effects of topical histatin gels in humans with experimental gingivitis. J Clin Peridontol. 2002; 29: 1051-1058. 22. Barchiesi F, Giacometti A, Cirioni O i wsp. In vitro activity of the synthetic lipopeptide PAL-Lys-Lys-NH(2) alone and in combination with antifungal agents against clinical isolates of Cryptococcus neoformans. Peptides 2007; 28(8): 1509-1513. 23. Simonetti O, Arzeni D, Ganzetti G. i wsp. In vitro activity of the lipopeptide derivative (Pal-Lys-Lys-NH), alone and in combination with antifungal agents, against clinical isolates of dermatophytes. Br J Dermatol. 2009; 161(2): 249-252.