TYPOWANIE MOLEKULARNE W DOCHODZENIU EPIDEMIOLOGICZNYM

TYPOWANIE MOLEKULARNE W DOCHODZENIU EPIDEMIOLOGICZNYM Stefania Giedrys-Kalemba 7 110 Podstawowym zadaniem zespołu kontroli zakażeń jest prowadzenie systematycznego nadzoru i rejestracji zakażeń w celu określenia na poszczególnych oddziałach poziomu i ryzyka zakażeń, szczególnie o charakterze epidemicznym. Analiza epidemiologiczna różnych danych zbieranych przez członków zespołu i personel oddziałów opracowana w oparciu o zalecane wskaźniki epidemiologiczne, w tym wyniki dochodzenia epidemiologicznego prowadzonego w ogniskach epidemicznych, stanowi podstawę wprowadzenia lub weryfikacji procedur eliminujących lub przynajmniej ograniczających ryzyko wystąpienia zakażenia szpitalnego. Jednym z elementów nadzoru nad zakażeniem jest nadzór mikrobiologiczny. Celem nadzoru mikrobiologicznego jest analiza czynników etiologicznych i ich wrażliwości na antybiotyki różnych form klinicznych zakażeń. Izolacja i identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia (przynajmniej do gatunku) oraz określenie jego wrażliwości na antybiotyki wraz z wykryciem mechanizmu oporności należy do podstawowych zadań laboratorium mikrobiologicznego. Obok klasycznych metod hodowli uważanych za,,złoty standard w diagnostyce mikrobiologicznej wykonywane są również badania serologiczne, polegające na wykryciu antygenu lub swoistych dla danego drobnoustroju przeciwciał, jednak w dochodzeniu epidemiologicznym mają one mniejsze znaczenie. Do dodatkowych zadań laboratorium związanych z kontrolą zakażeń szpitalnych należy przekazywanie okresowych raportów o czynnikach etiologicznych zakażeń i lekooporności drobnoustrojów w oddziałach, monitorowanie mechanizmów oporności drobnoustrojów alarmowych, udział w dochodzeniu epidemiologicznym. Do ważniejszych drobnoustrojów alarmowych należą: metycylinooporne gronkowce złociste (MRSA), enterokoki o wysokiej oporności na aminoglikozydy (HLAR) i oporne na wankomycynę (VRE), pałeczki Gram-ujemne wytwarzające β-laktamazy typu ESBL, AmpC czy metalo-

enzymy, oporne gatunki Candida. W codziennej praktyce do patogenów alarmowych można zaliczyć każdy gatunek, który w warunkach danego oddziału czy szpitala wywoła zakażenie o charakterze epidemii lub występuje endemicznie. Systematyczne narastanie oporności drobnoustrojów na antybiotyki, zmienność czynników etiologicznych zakażeń, wzrost zakażeń oportunistycznych i dodatkowych czynników ryzyka zakażenia związanych z inwazyjną diagnostyką i leczeniem wymagają obecnie prowadzenia stałej i profesjonalnej kontroli ekosystemu szpitala oraz rejestracji zakażeń, szczególnie wywołanych przez patogeny alarmowe. Ze względu na te problemy niezbędna jest ścisła współpraca laboratorium mikrobiologicznego z personelem medycznym oddziałów oraz zespołem kontroli zakażeń. Wyniki nadzoru epidemiologicznego w połączeniu z analizą czynników etiologicznych zakażenia i ich wrażliwości na leki pozwalają na ocenę zagrożenia epidemicznego w oddziale/szpitalu i wdrożenia procedur postępowania zapobiegawczego. Są także podstawą do opracowania receptariusza szpitalnego, profilaktyki okołooperacyjnej i zasad terapii empirycznej w oddziałach. Zasady doboru materiału do badań epidemiologicznych Dochodzenie epidemiologiczne w ognisku epidemicznym ma na celu określenie przyczyn powstania epidemii, wygaszenie ogniska i wprowadzenie działań zapobiegawczych. Obejmuje również mikrobiologiczne opracowanie ogniska: wykrycie czynnika etiologicznego zakażenia u chorych, ustalenie źródła i dróg szerzenia się zakażeń oraz utrzymywania się szczepów epidemicznych czy endemicznych w środowisku. Często wymaga przeprowadzenia dodatkowych badań mikrobiologicznych środowiska oraz wykrycia nosicielstwa drobnoustrojów patogennych u personelu i innych pacjentów, a następnie określenia pokrewieństwa szczepów izolowanych z różnych próbek od chorych i personelu oraz ze środowiska. Właściwe pobranie i transport materiału jako pierwszy etap badania mikrobiologicznego jest niezwykle istotnym elementem decydującym o sukcesie i wiarygodności hodowli drobnoustrojów, jednak każdy etap badania mikrobiologicznego ma wpływ na ostateczny wynik badania, jego interpretację kliniczną i epidemiologiczną. Największą wartość diagnostyczną w wykrywaniu czynnika etiologicznego zakażenia mają próbki materiałów fizjologicznie jałowych, jak: krew, płyn mózgowo-rdzeniowy i inne płyny ustrojowe (opłucnowy, stawowy, otrzewnowy), punktaty i aspiraty z ropni głębokich, bronchoaspiraty, popłuczyny oskrzelowe. Dodatnie posiewy wymazów z miejsca operowanego, miejsca wprowadzenia cewnika, górnych dróg oddecho- 111

wych, a także moczu, kału czy plwociny zawsze wymagają dokonania analizy pod kątem obecności flory fizjologicznej, nosicielstwa drobnoustrojów patogennych czy przypadkowej kolonizacji. Materiały kliniczne należy pobierać w ostrym okresie choroby lub w okresie zaostrzenia, przed podaniem antybiotyku. Badanie personelu lub innych chorych bez objawów zakażenia w kierunku nosicielstwa epidemicznych drobnoustrojów należy wykonać w możliwie jak najkrótszym czasie od momentu podejrzenia ogniska epidemicznego. Najczęściej pobiera się próbki z przedsionka nosa, jamy nosowo- -gardłowej, wybranych okolic skóry, kał. Także próbki ze środowiska, sprzętu lub pokarmu pobiera się w okresie wystąpienia zakażeń krzyżowych, ewentualnie cyklicznie w przypadku zakażeń endemicznych. Szczegółowe zasady pobierania i transportu materiałów do badań mikrobiologicznych zawarte są w licznych opracowaniach. Przygotowanie odpowiednich procedur dotyczących poszczególnych oddziałów szpitala należy do obowiązków współpracującego ze szpitalem laboratorium mikrobiologicznego. 112 Metody stosowane w dochodzeniu epidemiologicznym W dochodzeniu epidemiologicznym niezwykle ważny jest dobór właściwej techniki typowania określonego gatunku szczepów izolowanych od chorych i nosicieli oraz ze środowiska, np. szczepów MRSA. Wykazanie identycznych cech badanych szczepów MRSA pozwala zaliczyć je do tego samego klonu i potwierdza epidemiczny, krzyżowy charakter wywoływanych przez nie zakażeń. W powiązaniu z danymi klinicznymi, występowaniem u nosicieli i innymi danymi epidemiologicznymi typowanie szczepów umożliwia ustalenie potencjalnych rezerwuarów drobnoustrojów patogennych i możliwości ich rozprzestrzeniania się, a w efekcie weryfikację odpowiednich procedur postępowania. Optymalna metoda wewnątrzgatunkowego różnicowania szczepów powinna być prosta i szybka w wykonaniu, tania, w miarę uniwersalna, ale specyficzna, dawać wiarygodne wyniki, powtarzalne w różnych laboratoriach. W dochodzeniu epidemiologicznym do ustalenia pokrewieństwa szczepów wykorzystuje się klasyczne metody mikrobiologiczne oparte na ocenie cech fenotypowych drobnoustrojów oraz nowoczesne metody molekularne analizujące materiał genetyczny organizmu, unikatowy i stały w porównaniu z cechami fenotypowymi, które mogą być modyfikowane przez czynniki środowiskowe. Wszystkie metody mają swoje wady i zalety, trudno znaleźć metodę idealną.

Metody fenotypowe W rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej różnicowanie drobnoustrojów i określenie gatunku przeprowadza się głównie na podstawie analizy cech fenotypowych. Na odpowiednich zestawach podłoży stosowanych do poszczególnych materiałów klinicznych lub innych próbek ocenia się wzrost i morfologię kolonii, ewentualnie niektóre cechy biochemiczne (podłoża wybiórczo-różnicujące) oraz morfologię komórek (wykorzystuje się głównie metodę barwienia Grama). Następnie przeprowadza się ukierunkowane badanie cech biochemicznych drobnoustroju, które często pozwala na określenie rodzaju lub gatunku. Niekiedy ustalenie gatunku wymaga dodatkowo wykonania badania serologicznego wykorzystującego swoiste surowice odpornościowe dla wybranych antygenów drobnoustroju (tzw. typowanie serologiczne), rzadziej wykrycia zdolności wytwarzania toksyny. Uznanie drobnoustroju za czynnik etiologiczny zakażenia wiąże się z określeniem jego wrażliwości na antybiotyki i mechanizmów oporności w celu zastosowania optymalnego leczenia. Wykonanie antybiogramu powinno być przeprowadzone zgodnie z obowiązującymi standardami i rekomendacjami, aktualizowanymi praktycznie każdego roku. Spośród rutynowych metod mikrobiologicznych do porównania szczepów tego samego gatunku i serotypu w dochodzeniu epidemiologicznym stosuje się najczęściej wzory antybiogramów, rzadziej profil biochemiczny. Do metod stosowanych głównie w badaniach epidemiologicznych należy typowanie fagowe, wykorzystujące odpowiednie zestawy bakteriofagów litycznych oraz typowanie bakteriocynowe, określające zdolność wytwarzania przez dany szczep bakteriocyn i wrażliwość na określone bakteriocyny. Dobre możliwości typowania i różnicowania szczepów dają metody stosowane w badaniach naukowych, jak analiza profili białkowych całych komórek, typowanie izoenzymatyczne, immunobloting. W celu dokładnego zidentyfikowania szczepów często konieczne jest korzystanie z kilku metod fenotypowych jednocześnie. Są one dość kosztowne i pracochłonne, mają różną powtarzalność wyników i możliwości różnicowania. Mogą być trudne i niejednoznaczne w interpretacji, szczególnie w przypadku szczepów o charakterze endemicznym oraz izolowanych z różnych oddziałów lub szpitali. Powszechnie obserwuje się zjawisko zmienności fenotypowej szczepów obecność lub brak danej cechy fenotypowej jako ekspresji genu może być modyfikowana przez warunki środowiskowe (specyfika oddziału, wykonywane zabiegi, stosowane środki dezynfekcyjne, antybiotyki), a także czynniki związane z chorym (miejsce zakażenia, obecność konkurującej flory fizjologicznej, mechanizmy obronne, stosowane leki). 113

114 Metody genotypowe Rozwój biologii molekularnej w ostatnich dziesięcioleciach stał się znakomitym uzupełnieniem, a nawet alternatywą dla tradycyjnej diagnostyki mikrobiologicznej. Metody genetyczne umożliwiają znaczne skrócenie czasu trwania tradycyjnego postępowania diagnostycznego, a co najważniejsze, pozwalają nie tylko na dokonanie bardziej precyzyjnego i jednoznacznego różnicowania gatunkowego, ale również na wykazanie zróżnicowania szczepów w obrębie gatunku. Opierają się na poszukiwaniu lub analizie unikatowych sekwencji DNA lub RNA charakterystycznych dla określonego drobnoustroju. Różnorodność układu fragmentów kwasów nukleinowych tworzących polimorfizm wewnątrzgatunkowy wynika z powszechnie zachodzących w naturze procesów rearanżacji sekwencji nukleotydowych, insercji lub delecji pojedynczych par zasad. Metody genotypowe są niezależne od warunków środowiskowych, bardziej powtarzalne i wykazują większą zdolność różnicującą w obrębie gatunku niż metody fenotypowe. Metody genetyczne stosuje się wróżnych celach: do identyfikacji bakterii, wirusów, grzybów, pierwotniaków w materiale klinicznym in situ lub po izolacji (Mycobacterium, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Borrelia burgdorferi, Legionella pneumophila, Clostridium difficile, Ehrlichia, Candida, HBV, HCV, CMV, HSV), do identyfikacji genów oporności na antybiotyki (meca, ermb, mefa, gyra, kata, rpob), do identyfikacji genów kodujących czynniki wirulencji (toksyny Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Clostridium difficile, Escherichia coli, Bacillus anthracis, Helicobacter pylori), do precyzyjnej analizy ewolucyjnej i filogenetycznej oraz ostatecznej taksonomii drobnoustrojów, w epidemiologii szpitalnej do typowania szczepów w obrębie gatunku w celu ustalenia źródła zakażenia i transmisji szczepów epidemicznych/endemicznych na oddziale, również do porównywania szczepów izolowanych od tego samego chorego z różnych materiałów lub wróżnym czasie. Techniki biologii molekularnej wykorzystywane w badaniach epidemiologicznych Metody genotypowania szczepów do celów epidemiologicznych wykorzystują najczęściej techniki oparte na analizie restrykcyjnej całego materiału genetycznego drobnoustroju lub polegające na amplifikacji (powieleniu)

fragmentu DNA metodą PCR (polymerase chain reaction łańcuchowa reakcja polimerazy) z odpowiednimi starterami (primers). Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych metoda RFLP z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych (endonukleazy) Każdy enzym ma zdolność rozpoznawania i trawienia charakterystycznej dla siebie sekwencji DNA. Otrzymuje się mniejsze fragmenty, które rozdzielane są w żelu agarozowym. Powstaje odpowiedni układ prążków, charakterystyczny dla szczepu. Metoda RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) może dotyczyć polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych DNA chromosomalnego (restriction endonuclease analysis REA), DNA plazmidowego (restriction endonuclease analysis of plasmid REAP), poszczególnych genów (locus specific RFLP, np. gen meca i spa u szczepów MRSA), a także genów kodujących rrna tworzących operony (rybotypowanie). W analizie restrykcyjnej DNA chromosomalnego endonukleazy z wysoką częstością rozpoznają miejsce trawienia, na które składają się sekwencje co 4 6 par zasad. Powstają fragmenty o długości około 50 50 000 pz. Metoda może być stosowana dla każdego drobnoustroju hodowlanego, ma bardzo dobrą zdolność różnicującą. Otrzymuje się dużą liczbę fragmentów DNA różniących się kilkoma parami zasad, co może utrudniać interpretację otrzymanych wzorów. Analiza restrykcyjna DNA plazmidowego polega na wyizolowaniu plazmidów z poszczególnych szczepów,rozdzieleniu w żelu agarozowym, a następnie trawieniu enzymami restrykcyjnymi. Jest to metoda prosta i szybka, jedna z najwcześniej stosowanych. Może być wykorzystana jedynie do badania szczepów posiadających plazmidy (gronkowce, enterokoki, pałeczki Gram-ujemne). Plazmidy jako pozachromosomalne DNA należą do elementów ruchomych komórki. Są wymieniane w procesach koniugacji, mogą ulec transpozycji do chromosomu, komórka może,,zgubić plazmid. Zmienność bakterii w tym zakresie powoduje, że analizę plazmidową stosuje się do porównywania szczepów izolowanych w zbliżonym okresie. Metoda nie nadaje się do długoterminowych badań porównawczych. Analiza makrorestrykcyjna chromosomalnego DNA połączona z elektroforezą w zmiennym polu elektrycznym REA-PFGE (restriction enzyme analysis pulse field gel electrophoresis) jest odmianą metody RFLP. Izoluje się cały materiał genomowy drobnoustroju, zatapia w bloczku agarozowym chroniących DNA drobnoustroju przed naruszeniem i poddaje trawieniu rzadko tnącymi endonukleazami (np. SmaI Staphylococcus, Streptococcus pneumoniae, XbaI Klebsiella, SfiI Proteus, Candida). Otrzymuje się 10 30 dużych fragmentów, charakterystycznych dla danego mikroorganizmu, większych niż w klasycznej 115

116 metodzie RFLP, o długości od 20 30 kpz do 1000 kpz, które następnie rozdziela się w zmiennym polu elektrycznym (elektroforeza pulsacyjna). Wzory polimorfizmu długości dużych fragmentów restrykcyjnych są łatwiejsze do interpretacji niż w klasycznej metodzie RFLP. Analizę pokrewieństwa otrzymanych wzorów genetycznych niewielkich grup (około 30 szczepów) z minimalną liczbą 10 prążków w rozdziale elektroforetycznym można przeprowadzić wizualnie według kryteriów Tenovera. Szczepy niewykazujące różnic w liczbie i układzie prążków określa się jako identyczne, wykazujące różnice w 1 3 prążkach blisko spokrewnione, 4 5 prążkach potencjalnie spokrewnione, > 6 prążków różne, niespokrewnione. Do analizy pokrewieństwa większych grup szczepów służą rozbudowane techniki komputerowe. Metodę PFGE charakteryzuje bardzo wysoka zdolność różnicująca (siła dyskryminacji), duża powtarzalność i możliwość porównywania wyników pomiędzy laboratoriami. Powszechne stosowanie techniki PFGE ogranicza konieczność posiadania specjalnej aparatury oraz kosztownych odczynników. Metoda jest pracochłonna, analiza trwa kilka dni. Obecnie jest to metoda szeroko wykorzystywana w typowaniu szczepów różnych drobnoustrojów, uznana za,,złoty standard w epidemiologii szpitalnej. Przykłady wykorzystania metody PFGE w dochodzeniu epidemiologicznym: Analiza ogniska epidemicznego przeprowadzona na oddziale neonatologicznym z powodu wystąpienia w ciągu jednego tygodnia u sześciu noworodków objawów liszajca pęcherzowego (impetigo bullosa). Typowaniu poddano szczepy Staphylococcus aureus wyizolowane ze zmian skórnych lub pępka noworodków oraz z przedsionka nosa od nosicieli wśród personelu (u matek nie stwierdzono nosicielstwa) ryciny 7.1a i 7.1b. Porównanie uzyskanych wzorów genetycznych wykazało, że wszystkie noworodki uległy zakażeniu identycznym typem genetycznym gronkowca, który oznaczono jako typ A. Został on równocześnie zidentyfikowany u jednej osoby z personelu położnej, która odbierała poród pierwszego z zakażonych noworodków. U pozostałych nosicieli izolowano inne typy genetyczne: B (2 pracowników oddziału położniczego), C (7 pracowników oddziału położniczego, izolacyjnego i noworodkowego), D (2 pracowników oddziału położniczego) oraz 9 różnych wzorów unikatowych. Metoda PFGE pozwoliła potwierdzić transmisję zakażenia na oddziale i wskazała prawdopodobne źródło zakażenia. Wykazano także zróżnicowanie populacji Staphylococcus aureus wśród nosicieli oraz transmisję szczepów pomiędzy oddziałami (typ C). Wyniki podkreślają znaczenie znanej od dawna zasady przestrzegania higieny i mycia rąk pomiędzy każdym nowym kontaktem z pacjentem. Analiza zakażeń w oddziale neonatologicznym i oddziale intensywnej terapii noworodka.

a) b) Rycina 7.1a i 7.1b. Analiza makrorestrykcyjna chromosomalnego DNA szczepów Staphylococcus aureus izolowanych ze zmian skórnych od noworodków oraz od nosicieli wśród personelu metoda REA-PFGE (ze zbiorów katedry Mikrobiologii i Immunologii PAM). Objaśnienia: 7.1a: M marker masy molekularnej; 1 6, 11 typ genetyczny A; 7, 10 typ genetyczny D; 7, 9 wzory unikatowe. 7.1b: M marker masy molekularnej; 1, 2, 8 11 wzory unikatowe; 6, 7, 12, 13 typ genetyczny C. Wciągu kilku miesięcy od 8 noworodków o małej lub bardzo małej urodzeniowej masie ciała z objawami zakażenia wyizolowano z materiałówklinicznych 12 szczepów Serratia marcescens. Analiza genetyczna wykazała, że szczepy pochodzące od 5 noworodków z oddziału intensywnej terapii noworodka i 2 z oddziału neonatologicznego miały identyczny układ prążków oraz fenotyp ESBL-dodatni potwierdza to obecność epidemicznego klonu 117

Rycina 7.2. Analiza makrorestrykcyjna chromosomalnego DNA szczepo w Serratia marcescens izolowanych z zakaz en od noworodko w z oddziału neonatologicznego oraz intensywnej opieki noworodka metoda REA-PFGE (ze zbioro w katedry Mikrobiologii i Immunologii PAM). odpowiedzialnego za zakaz enia; od jednego noworodka izolowano szczep o wzorze unikatowym (zakaz enie pochodza ce z innego z ro dła) rycina 7.2. Rycina 7.3 przedstawia przykłady wzoro w restrykcyjnych 29 szczepo w Klebsiella pneumoniae izolowanych w cia gu roku od noworodko w. Rycina 7.3. Wzory restrykcyjne wybranych szczepo w Klebsiella pneumoniae izolowanych od noworodko w skolonizowanych, z zakaz eniami nabytymi oraz wrodzonymi metoda REA-PFGE (ze zbioro w katedry Mikrobiologii i Immunologii PAM). Objas nienia: M marker masy molekularnej, A, B, C, D typ genetyczny, U wzo r unikatowy. 118

Stwierdzono 4 typy genetyczne oraz kilka wzorów unikatowych. Szczepy należące do najczęściej izolowanego typu genetycznego A miały różne fenotypy: ESBL-dodatni i ESBL-ujemny. Te same typy genetyczne Klebsiella pneumoniae izolowano od noworodków skolonizowanych (głównie dzieci donoszone) oraz z zakażeniami nabytymi i wrodzonymi (dzieci z czynnikami ryzyka zakażenia). Badania genetyczne potwierdziły selekcję opornych szczepów o charakterze epidemicznym w środowisku i ich transmisję między oddziałami, prawdopodobnie także kolonizację u matek (zakażenie wrodzone). Utrzymywanie się szczepów szpitalnych o epidemicznym charakterze na oddziałach wymaga zwiększenia reżimu sanitarnego oraz weryfikacji standardów postępowania profilaktycznego oraz terapeutycznego. Analiza zmienności materiału genetycznego z wykorzystaniem techniki PCR Podstawą reakcji PCR jest zasada komplementarności, czyli zdolność łączenia się wybranego odcinka DNA (1000 2000 pz) z dwoma odpowiednio dobranymi oligonukleotydami (starter). Odnajdują one miejsca wiązania na obu niciach DNA i ograniczają fragment wybrany do amplifikacji. Reakcję amplifikacji katalizuje termostabilna polimeraza DNA. Reakcja PCR składa się z 30 40 cykli. Każdy cykl zachodzi w trzech różnych temperaturach i obejmuje kilka etapów: denaturację (temperatura 90 95 C) rozdzielenie podwójnej nici matrycowego DNA, przyłączenie starterów (temperatura 40 60 C) wiążących się komplementarnie z pojedynczymi nićmi DNA wyznaczenie regionu do powielenia, syntezę nowych nici (temperatura około 70 C) komplementarne przyłączanie nukleotydów w obecności polimerazy. Produkty amplifikacji (zwielokrotnione kopie poszukiwanego fragmentu DNA) można rozdzielić elektroforetycznie w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym, wykryć metodą hybrydyzacji ze swoistą sondą, a nawet odczynem ELISA. Istnieje wiele odmian wykorzystania metody PCR do typowania epidemiologicznego. Techniki PCR wymagaja ce znajomości amplifikowanej sekwencji Do technik tych zalicza się PCR-RFLP i Rep-PCR. PCR-RFLP polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych otrzymany w wyniku trawienia produktu PCR endonukleazami. Amplifikacja dotyczy charakterystycznego, specyficznego dla gatunku fragmentu DNA o znanej sekwencji nukleotydów (np. gen reca u Acinetobacter). Produkty reakcji PCR poddaje się następnie trawieniu enzymami restrykcyjnymi i rozdziałowi w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym. Powstają charakterystyczne dla każdego izolatu wzory prążków, wykazu- 119

120 jące polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych DNA. Technikę PCR-RFLP można stosować dla większości drobnoustrojów (Pseudomonas, Acinetobacter, Xanthomonas, Staphylococcus, Streptococcus, a także Neisseria meningitidis, Helicobacter pylori, Listeria monocytogenes, Chlamydia trachomatis, Borrelia). Technikę PCR-RFLP wykorzystywano do analizy wysoce zakonserwowanych genów, kodujących rybosomalne RNA rybotypowanie. Występują one u wszystkich organizmów bakteryjnych, zlokalizowane są w operonach rm i rozdzielone polimorficznymi regionami o dużym zróżnicowaniu. Amplifikację określonego fragmentu DNA, połączoną dodatkowo z analizą restrykcyjną ARDRA (amplified ribosomal DNA restriction), stosowano do różnicowania szczepów Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecium, Serratia marcescens, Listeria monocytogenes. Rep-PCR (repetitive extragenic palindromic pozagenowe sekwencje powtórzone). Wykorzystuje się występowanie u drobnoustrojów znanych powtórzonych fragmentów DNA, rozrzuconych po całym genomie. Najwcześniej wykryto je u pałeczek Gram-ujemnych (38-nukleotydowe sekwencje REP u E. coli, 126-nukleotydowe ERIC u Enterobacteriaceae), należą do nich stałe sekwencje kodujące trna. Amplifikacja powtarzających się fragmentów, w zależności od użytych starterów, pozwala uzyskać dużą liczbę produktów o różnej wielkości i ilości u poszczególnych szczepów. Startery oparte na sekwencjach REP i ERIC wykorzystywano do typowania szczepów Enterobacter, Citrobacter, Acinetobacter, MRSA, Streptococcus pneumoniae, Neisseria, a także grzybów Aspergillus fumigatus. Do niedawno odkrytych powtarzających się sekwencji, wykazujących polimorfizm długości indywidualny dla organizmu należą krótkie sekwencje nukleotydowe VNTR (Variable Number Tandem Repeat), wykorzystywane do różnicowania Staphylococcus aureus, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, a także typu DR (Direct Repeats) stosowane do genotypowania Mycobacterium tuberculosis complex na całym świecie (metoda spoligotyping). Techniki niewymagaja ce znajomości amplifikowanej sekwencji Określa się je angielskim terminem fingerprinting, co tłumaczy się jako,,genetyczny odcisk palca lub nazwą MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling wielokrotna i przypadkowa analiza fragmentów polimorficznych). Polegają na amplifikacji polimorficznych fragmentów DNA komplementarnych do starterów o,,przypadkowo dobranej sekwencji. Niespecyficzne startery przyłączają się w różnych miejscach chromosomalnego DNA, co powoduje, że otrzymuje się indywidualny dla każdego szczepu,,odcisk palca, złożony z fragmentów DNA o różnej wielkości

i ilości. Rozdział elektroforetyczny losowo uzyskanych produktów PCR daje charakterystyczny wzór prążków i umożliwia wykrycie polimorfizmu pomiędzy badanymi izolatami jednego gatunku. Metody PCR fingerprinting występują w wielu odmianach. Różnice dotyczą m.in. długości startera, warunków amplifikacji, sposobu rozdziału produktów. Techniki te mają duże możliwości dyskryminacyjne, jednak ich wykorzystanie ogranicza lub uniemożliwia kryterium powtarzalności. Możliwość uzyskania powtarzalnych wyników w obrębie jednego laboratorium jest zwykle określana jako umiarkowana, w obrębie kilku jako słaba. Ze względu na szybkość i łatwość wykonania metody te są często stosowane w analizie zakażeń szpitalnych dotyczących jednego oddziału lub szpitala. Badanie zawsze powinno być poprzedzone dokładnym ustaleniem warunków reakcji optymalizacja metody. Najczęściej stosowane techniki to PC-RAPD, AP-PCR i DAF. PCR-RAPD (random amplified polymorphic DNA przypadkowa amplifikacja polimorficznych odcinków DNA). Startery mają długość 10 20 pz, otrzymane produkty amplifikacji są rozdzielane w żelu agarozowym. Jest to metoda najchętniej wykorzystywana w badaniach epidemiologicznych. Stosowano ją w typowaniu różnych drobnoustrojów, gronkowców, enterokoków, pałeczek Gram-ujemnych z rodziny Enterobacteriaceae oraz pałeczek niefermentujących, a także grzybów drożdżopodobnych z rodzaju Candida. Na rycinach 7.4a i 7.4b przedstawiono wyniki typowania metodą PCR- -RAPD grzybów drożdżopodobnych z gatunku Candida albicans izolowanych od pacjentów z oddziału intensywnej terapii z różnych materiałów klinicznych oraz z miejsc fizjologicznego występowania (ontocenoza). Przeprowadzenie wstępnej standaryzacji metody PCR-RAPD według schematu zaproponowanego przez Taguchi i Wu oraz zastosowanie kombinacji dwóch starterów pozwoliło ustalić optymalne stężenia substratów reakcji i umożliwiło precyzyjną identyfikację wewnątrzgatunkową badanych szczepów. Stwierdzono duże zróżnicowanie wewnątrzgatunkowe w obrębie analizowanego gatunku, co wskazuje na endogenne pochodzenie większości szczepów. Wykazano transmisję szczepów pomiędzy ontocenozami u tej samej osoby oraz transmisję międzyosobniczą szczepy o identycznych lub podobnych genotypach izolowano z ontocenoz i materiałów klinicznych od różnych chorych. Niektóre typy genetyczne Candida albicans utrzymywały się na oddziale intensywnej terapii przez kilka, kilkanaście miesięcy. U jednych chorych odpowiedzialne były jedynie za kolonizację, u innych wywoływały zakażenia. Biorąc pod uwagę fakt, że chory na oddziale intensywnej terapii jest pacjentem leżącym, najprawdopodobniej personel ułatwia transmisję szczepów pomiędzy pacjentami, a także pomiędzy ontocenozami u tego samego pacjenta. Stan taki wymaga zwrócenia większej uwagi na system kontroli zakażeń szpitalnych i zaostrzenia reżimu sanitarnego wśród personelu. 121

a) b) Rycina 7.4. Wzory restrykcyjne grzybo w z gatunku Candida albicans izolowanych od pacjento w z OIT metoda PCR-RAPD (ze zbioro w katedry Mikrobiologii i Immunologii PAM); a ro z ne wzory restrykcyjne szczepo w izolowanych z materiało w klinicznych oraz z miejsc fizjologicznego wyste powania u czterech pacjento w, b identyczne wzory restrykcyjne szczepo w (typy genetyczne: C, B, H) izolowane od ro z nych pacjento w Objas nienia: p pacjent, ju jama ustna, plw plwocina, BAL popłuczyny pe cherzykowo-oskrzelowe, odb odbyt, m mocz, pal okolica mie dzypalcowa stopy. 122

AP-PCR (arbitrary primed PCR PCR z użyciem starterów o sekwencjach przypadkowych). Równocześnie stosowane mogą być dwa różne startery o wielkości około 7 10 pz, produkty amplifikacji rozdzielane są w żelu poliakrylamidowym, uzyskany profil jest bardziej skomplikowany niż w przypadku RADP. DAF (DNA amplification fingerprinting amplifikacja polimorficznych odcinków DNA). Zastosowanie starterów o długości 5 15 pz w stężeniach dziesięciokrotnie wyższych umożliwia uzyskanie najbardziej skomplikowanego profilu. Inne metody Są to techniki oparte na ligacji adaptorów oligonukleotydowych LM- -PCR (Ligation Mediated PCR). W reakcji PCR wykorzystuje się adaptory oligonukleotydowe, które dołącza się do fragmentów restrykcyjnych DNA. Znajomość analizowanej sekwencji nie jest wymagana. AFLP (amplified fragment lenght polymorphism polimorfizm długości amplifikowanego fragmentu DNA). Metoda jest połączeniem techniki PCR i RFLP. Polega na wybiórczej amplifikacji odpowiednio przygotowanych fragmentów DNA genomowego. Kolejne etapy to: trawienie całego DNA z użyciem odpowiednio dobranych enzymów restrykcyjnych, ligacja otrzymanych fragmentów DNA z zaprojektowanym odpowiednio adaptorem, selektywna amplifikacja produktów ligacji z zastosowaniem dwóch starterów homologicznych do sekwencji adaptor miejsce restrykcyjne, elektroforeza produktów i autoradiografia otrzymanych rozdziałów. Metodę cechuje duża powtarzalność i siła dyskryminacyjna. Bardziej jest przydatna w badaniach taksonomicznych. ADSRRS (amplification of DNA fragments surrounding rare restriction sites amplifikacja fragmentów DNA otaczających miejsca dla enzymów restrykcyjnych rzadko tnących). Stosuje się dwa enzymy restrykcyjne: często tnący i rzadko tnący, dwa adaptory:,,długi i,,krótki oraz odpowiednio zaprojektowane startery, co powoduje, że tylko niewielka część fragmentów genomowego DNA ulega amplifikacji. Po rozdziale elektroforetycznym w żelu poliakrylamidowym i barwieniu bromkiem etydyny niewielka liczba produktów PCR jest łatwa w interpretacji. Raz ustalone enzymy restrykcyjne i adaptory mogą być stosowane do badań DNA spokrewnionych ze sobą gatunków. Metoda była stosowana w badaniach epidemiologicznych Acinetobacter baumannii, Serratia marcescens, Enterococcus faecium. PCR-MP (PCR melting profile profile fragmentów DNA o różnych temperaturach topnienia). W metodzie wykorzystuje się adaptory oligonukleotydowe oraz różnice w temperaturach topnienia fragmentów restrykcyjnych DNA zależne od zawartości par GC i ich długości. Obniżenie temperatury denaturacji 123

w cyklach PCR powoduje dodatkowo zmniejszenie liczby amplifikowanych fragmentów. W wyniku rozdziału elektroforetycznego otrzymuje się charakterystyczny dla szczepu wzór prążków. Metoda jest powtarzalna, ma wysoki potencjał różnicujący. Te same enzymy restrykcyjne, adaptory i startery mogą być wykorzystane do analizy różnych drobnoustrojów, co obniża koszty. Metodę stosowano do typowania szczepów Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus. MLST (multilocus sequence typing). Metoda polega na sekwencjonowaniu fragmentów wybranych genów i ustaleniu typu sekwencyjnego, który identyfikuje się z wykorzystaniem internetowej bazy danych. Profile MLST lepiej określają przynależność do międzynarodowych klonów epidemicznych, słabiej różnicują szczepy w lokalnych badaniach epidemiologicznych. W dochodzeniu epidemiologicznym niezwykle ważny jest właściwy dobór technik typowania badanych szczepów, który w powiązaniu z danymi klinicznymi pozwala na prawidłową interpretację wyników. Przy wyborze metody typowania genetycznego szczepów w celach epidemiologicznych należy przede wszystkim uwzględnić, czy spełnia ona kryteria pozwalające na jej pełną wiarygodność. Istotne cechy wiarygodności metody stanowią: typowalność otrzymywanie wyniku dla każdego izolatu danego gatunku, powtarzalność kilkakrotne uzyskanie identycznych wyników z tej samej próbki, siła dyskryminacyjna rozróżnianie szczepów epidemiologicznie niespokrewnionych (szczepy unikatowe). Wykonanie analizy spełniającej powyższe kryteria wymaga przeprowadzenia optymalizacji zastosowanej metody. Brak standaryzacji badań jest najczęstszą przyczyną uniemożliwiającą uzyskanie powtarzalności wyników, powoduje błędną ich interpretację i ogranicza szersze zastosowanie metod genetycznych w epidemiologii szpitalnej.