Badanie długości czynników sieciujących metodami symulacji komputerowych Agnieszka Obarska-Kosińska Prof. dr hab. Bogdan Lesyng Promotorzy: Dr hab. Janusz Bujnicki Zakład Biofizyki, Instytut Fizyki Doświadczalnej, UW Pracownia Bioinformatyki i InŜynierii Białka, IIMCB
Metody badania struktur białek i oddziaływań białko-białko Doświadczalne: Krystalografia rentgenowska NMR Teoretyczne: Modelowanie ab initio Modelowanie homologiczne Modelowanie de novo Dokowanie
Modelowanie teoretyczne Problemy: DuŜy koszt obliczeniowy Niedoskonała funkcja pseudoenergii Alternatywne modele de novo Alternatywne modele dimeru
Sieciowanie molekularne (ang. molecular cross-linking) Grupy funkcyjne białek: -NH 2, -COOH, -SH Sieciowanie wewnątrz- i między- molekularne Reszty lizynowe Reszty Glu i Asp Reszty cysteinowe
Czynniki sieciujące I rodzaju (ang. bridge type cross-linkers) BIAŁKO A BIAŁKO B CZYNNIK SIECIUJĄCY I RODZAJU homo-dwufunkcyjne hetero-dwufunkcyjne MTS-11-O3-MTS
Czynniki sieciujące II rodzaju (ang. zero-length cross-linkers) CZYNNIK SIECIUJĄCY II RODZAJU BIAŁKO A BIAŁKO B Np.: karbodiimidy, Cu2+-o-fenantrolina
Sieciowanie zdefiniowanych miejsc BIAŁKO A MUTAGENEZA MUTANTY JEDNOCYSTEINOWE BIAŁKO B CZYNNIKI SIECIUJĄCE + ELEKTROFOREZA śelowa (SDS-PAGE)
Sieciowanie nieznanych miejsc CZYNNIKI SIECIUJĄCE BIAŁKO A BIAŁKO B TRAWIENIE WIDMO MASOWE SPEKTROMETRIA MAS I m/z
Grupy funkcyjne czynników sieciujących Reaktywne wobec grupy aminowej: Estry N-hydroksysukcynoimidylowe (estry NHS) i ich pochodne sulfo-nhs. Estry kwasu imidowego Reaktywne wobec grupy sulfhydrylowej: Maleimidy. Disulfidy.
Zalety metody sieciowania molekularnego MoŜliwość badania białek w ich stanie natywnym białka błonowe i inne, które nie ulegają krystalizacji regiony ruchliwe, niewidoczne w strukturach krystalograficznych Wielkość białka teoretycznie nieograniczona Analiza wyników sieciowania: Elektroforeza Ŝelowa szybka i prosta Spektrometria mas szybka i czuła DuŜa róŝnorodność czynników sieciujących: Szeroki zakres długości Szeroki zakres specyficzności grup reaktywnych
Określanie długości czynników sieciujących Sumowanie długości wiązań Symulacje dynamiki stochastycznej: Green i wsp. 2001 32 popularne homo-dwufunkcyjne czynniki sieciujące
Metody przeszukiwania przestrzeni konformacyjnej Przeszukiwanie konformacyjne systematyczne i losowe Metoda symulacji Monte Carlo Metoda symulacji Dynamiki Molekularnej i Stochastycznej Metoda mieszana MC/SD
Cel pracy Obliczenie długości 16 homo-dwufunkcyjnych czynników sieciujących metodą MC/SD pracownia dr. hab. J. Bujnickiego IIMCB, Warszawa pracownia dr. hab. P. Friedhoffa Uniwersytet Giessen, Niemcy
Materiały Obliczenia: Klaster halo Oprogramowanie firmy Schrodinger: Maestro budowa modelowych cząsteczek Jaguar obliczenia ab initio MacroModel minimalizacja energii, symulacje MC/SD Analiza danych: Statistica
Metody Zbudowanie modelowych cząsteczek Minimalizacja energii metoda najszybszego spadku 100 kroków metodą sprzęŝonych gradientów RMS gradientu energii 0,05 kj*mol -1 * Å -1 Model rozpuszczalnika GB/SA Pole siłowe AMBER* Obliczenia ładunków atomowych ESP Obliczenia ab initio B3LYP (metoda DFT) Baza funkcyjna 6-31G** Model Poissona-Boltzmanna dla wody Symulacje MC/SD Pole siłowe AMBER* Model rozpuszczalnika GB/SA Temperatura 300 K Krok czasowy 1,5 fs Stosunek kroków SD : MC wynosił 1:1 Faza równowaŝenia 50 ps Czas symulacji 100 ns Monitorowanie długości co 1 ps
Homo dwufunkcyjne czynniki sieciujące MTS owe -SH -NH 2 MTS-1-MTS MTS-8-O2-MTS MTS-pX-MTS MTS-2-MTS MTS-11-O3-MTS MTS-3-MTS MTS-14-O4-MTS MTS-4-MTS MTS-17-O5-MTS MTS-5-MTS MTS-6-MTS maleimido-azobenzen (AzoMal) maleimidowe MTS-8-MTS zawierające grupę sulfo NHS MTS-10-MTS BS3 DTSSP
Cząsteczki modelowe -SH -NH 2 MTS owe maleimidowe zawierające grupę sulfo NHS
Wyniki MTS-pX-MTS 2000 8.2 8.9 9.0 9.8 1800 1600 1400 liczba konformacji 1200 1000 800 600 400 200 0 4.0 4.7 5.4 6.1 6.8 7.5 8.2 8.9 9.6 10.3 11.0 11.7 odległość S [Å]
MTS-owe czynniki sieciujące
Homo-dwufunkcyjne MTS-owe czynniki sieciujące
Homo-dwufunkcyjne maleimidowe czynniki sieciujące AzoMal-cis AzoMal-trans O O O N N O N N 1800 10.1 11.6 11.7 13.2 2600 17.7 18.2 18.3 18.7 1600 2400 2200 1400 2000 liczba konformacji 1200 1000 800 600 liczba konformacji 1800 1600 1400 1200 1000 800 400 600 200 400 200 0 3.4 4.6 5.8 7.0 8.2 9.4 10.6 11.8 13.1 14.3 15.5 16.7 odległość S [Å] 0 13.3 13.9 14.5 15.0 15.6 16.2 16.8 17.4 18.0 18.5 19.1 19.7 odległość S [Å]
Homo-dwufunkcyjne maleimidowe czynniki sieciujące 6000 AzoMal 5000 liczba konformacji 4000 3000 2000 cis trans 1000 0 3.4 4.9 6.3 7.8 10.7 12.1 13.6 15.0 16.4 17.9 19.3 odleg S [Å]
Homo-dwufunkcyjne czynniki sieciujące zawierające grupę sulfo-nhs BS3 DTSSP 2600 8.5 9.1 9.4 9.9 2000 8.2 9.0 9.1 9.9 2400 2200 2000 1800 1600 1800 1400 liczba konformacji 1600 1400 1200 1000 liczba konformacji 1200 1000 800 800 600 600 400 200 400 200 0 3.3 4.1 4.8 5.5 6.2 6.9 7.6 8.3 9.0 9.8 10.5 11.2 odległość S [Å] 0 3.1 4.2 5.2 6.3 7.3 8.4 9.4 10.4 11.5 odległość S [Å]
Testy zbieŝności
Porównanie otrzymanych długości z wartościami uŝywanymi w publikacjach {Green, 2001 #15},{Guan, 2002 #31},{Grintsevich, 2008 #11},{Ermolova, 2003 #32},{Loo, 2001 #33} (Pierce Chemical, Rockford IL, 2008), (Pierce Chemical, 1999)
Czynniki sieciujące jako linijki molekularne
Doświadczalna weryfikacja wyników 2600 9.2 8.7 8.9 9.4 2400 2200 2000 1800 liczba konformacji 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 3.4 4.1 4.8 5.5 6.2 6.9 7.6 8.3 9.0 9.7 10.4 11.1 odległość S [Å]
Dziękuję za uwagę.