1.3 Analiza lekooporności jako jedna z metod różnicowanie szczepów Escherichia coli Diagnostyka mikrobiologiczna przebiega kilkuetapowo, a następowanie po sobie kolejnych faz zależne jest od wyniku etapu poprzedniego. Jednym z najważniejszych, a zarazem początkowym etapem tej diagnostyki jest oznaczenie wrażliwości patogenu na leki. Największym problemem jest szerokie stosowanie kuracji antybiotykowych, którego konsekwencją jest stały wzrost lekooporności w przypadku wielu ważnych z klinicznego punktu widzenia drobnoustrojów. Konsekwencją szeroko stosowanej antybiotykoterapii jest także wykształcenie u bakterii nowych mechanizmów oporności na leki. W związku z powyższym praca mikrobiologa jest związana nie tylko z prawidłowym określeniem lekooporności bakterii, ale także z prawidłową interpretacją uzyskanych wyników 1. Od lat z powodzeniem stosuje się szereg odpowiednich testów wykorzystujących różne techniki począwszy od prostych testów fenotypowych po metody wykorzystujące techniki biologii molekularnej. Metody wykorzystywane w analizie lekooporności bakterii można podzielić na dwie grupy. Pierwszą grupę stanowią metody ilościowe, do których zalicza się między innymi metody rozcieńczeń w bulionie bądź agarze oraz E-testy, a do drugiej grupy metod jakościowych zalicza się przede wszystkim metodę dyfuzyjno-krążkową. Należy jednak nadmienić, że w obecnej chwili ten etap diagnostyki nie ogranicza się jedynie do wykonania pojedynczego testu, ale coraz częściej łączy kilka technik, by móc w prawidłowy sposób określić lekooporność analizowanych szczepów bakterii. W tym podrozdziale zostaną omówione sposoby analizy lekooporności, które stanowią jedną z metod różnicowania szczepów Escherichia coli 2. Zanim w sposób bardziej szczegółowy zostaną scharakteryzowane wspomniane już sposoby analizy lekooporności należy wyjaśnić kilka pojęć, które będą konsekwentnie pojawiać się w dalszej części pracy. Lekooporność bakterii w sensie farmakologicznym oznacza, że mogą one przeżyć w wyższym stężeniu leku niż jest ono możliwe do osiągnięcia w środowisku in vivo. Z kolei lekooporność kliniczna oznacza, że bakterie są oporne na każde 1 Mnichowska-Polanowska, M., M. Kaczała i S. Giedrys-Kalemba. Lekooporność oraz zwalczanie biofilmu Candida [w:] Medical Mycology/Mikologia 2009, nr 16,str. 3. 2 Chylak, J. i A. Kopka. Lekooporność gronkowców izolowanych od chorych leczonych ambulatoryjnie [w:] Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia 2002, t. 54, nr 2, str. 97-101.
testowane stężenie leku. W lekooporności bakterii analizowane jest nie tylko zjawisko oporności na konkretny antybiotyk, ale także oporność bakterii na chemioterapeutyki. Pod pojęciem antybiotyku rozumie się substancję o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, które są produkowane i wytwarzane przez bakterie oraz grzyby bądź też uzyskiwane sztucznie na drodze połowicznie bądź całkowicie syntetycznej, ale zachowujące naturalny wzorzec 3. Z kolei chemioterapeutykiem określa się substancję przeciwdrobnoustrojową, która uzyskiwana jest na drodze syntetycznej i która nie posiada naturalnego wzorca 4. Dodatkowo należy także wprowadzić pojęcie MIC (z j. ang. minimal inhibitory concentration). Jest to najmniejsze stężenie leku (w opisywanym przypadku antybiotyku bądź chemioterapeutyku), wyrażane w jednostce mg/l (miligram/litr), które określone w warunkach in vitro, ma działanie hamujące wzrost bakterii przy określonej gęstości inokulum oraz w określonym czasie 5. 1.3.1. Metoda dyfuzyjno - krążkowa Metoda dyfuzyjno - krążkowa, nazywana także metodą Kirby - Bauera, jest jedną z najbardziej popularnych i najczęściej wykorzystywanych metod analizy lekooporności bakterii. Metoda ta wykorzystuje powstawanie w podłożu hodowlanym gradientu stężeń podczas dyfuzji substancji czynnej z krążka antybiogramowego. Lek (przyp. antybiotyk bądź chemioterapeutyk) znajduje się w krążku bibułowym, z kolei zawiesina bakteryjna o określonej gęstości jest nanoszona na podłoże stałe. W dalszej kolejności na podłożu umieszcza się wspomniany krążek bibułowy zawierający lek. Lek ten dyfunduje promieniście, tworząc gradient stężeń. W obrębie brzegów krążka występuje największa koncentracja leku, a im dalej od krążka, tym stężenie leku jest niższe, co daje określony gradient. Bakterie w sąsiedztwie gradientu stężeń leku tworzą specyficzną przestrzeń określaną mianem strefy zahamowania wzrostu bakterii. Interpretacja wyników odbywa się na podstawie wartości średnicy strefy zahamowania wzrostu bakterii. Mówiąc najprościej i najogólniej wielkość tej strefy jest wprost proporcjonalna do stopnia wrażliwości bakterii na lek znajdujący się w bibułowym krążku. Im wyższa jest wartość średnicy strefy zahamowania 3 Kurek, A. Antybiotyk: kto bierze odpowiedzialność? [w:] Top Agrar Polska 2013, nr 8, str. 4 Ciebiada-Adamiec, A., M. Górska-Ciebiada i M. Ciebiada. Nowe antybiotyki w leczeniu zapalenia płuc [w:] Przewodnik Lekarza 2010, nr 4, str. 15-36. 5 Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations [in:] Journal of antimicrobial Chemotherapy 2001, no 48 suppl 1, p. 5-16.
wzrostu, a mówiąc prościej im większa jest strefa zahamowania wzrostu tym mniej oporna na dany lek jest bakteria. Na podstawie wielkości strefy zahamowania wzrostu bakterie określa się jako wrażliwe, średnio wrażliwe lub oporne. Oczywiście wyniki są odczytywane i interpretowane w odniesieniu do przyjętych standardów (rekomendacji narzucanych przez Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów) 6. Jak już wspomniano stosuje się trzystopniową skalę oceny oporności bakterii, gdzie wrażliwy,,s oznacza, że wartość MIC oznaczona w teście dla danego szczepu bakterii, jest równa standardowych dawkom testowanego leku. Oznacza to, że bakterie są wrażliwe na standardowe dawki testowanego leku, a tym samym prawdopodobieństwo sukcesu klinicznego jest bardzo wysokie. Mianem średnio wrażliwych,,i określa się szczepy, dla których wartość MIC mieści się w zakresie między wartościami MIC dla szczepów wrażliwych i opornych, w związku z czym sukces terapeutyczny stoi pod znakiem zapytania, ale jest możliwy do osiągnięcia np. gdy testowany lek podlega procesowi zagęszczenia, np. w drogach moczowych, lub gdy podawany jest w dawkach wyższych niż wartość standardowa, przy czym jest to możliwe tylko dla leków charakteryzujących się niską toksycznością. Trzeci stopień to bakterie oporne,,r, dla których wyznaczona w teście wartość MIC jest dużo wyższa, bądź w ogóle nie mieści się w zakresie oznaczalności, co skutkuje niewielkim prawdopodobieństwem sukcesu terapeutycznego niezależnie od dawki leku i lokalizacji infekcji 7. Na wielkość strefy zahamowania, a co za tym idzie na przebieg oraz wyniki tego testu ma wpływ kilka podstawowych czynników, do których można zaliczyć między innymi gęstość inoculum bakterii, czas nakładania krążków, temperaturę i czas inkubacji, wszelkie elementy związane z podłożem hodowlanym, a także stężenie antybiotyku nakładanego w krążkach na podłoże 8. 6 Hryniewicz, W., Sulikowska, A., Szczypa, K., Skoczynska, A., Łuczak-Kadłubowska, G. M., & Gniatkowski, M. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrazliwosci bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki, Krajowy Ośrodek Referencyjny, ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów, Warszawa 2006, str. 5. 7 Fiebelkorn, K. R. I inni. Practical disk diffusion method for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci [in:] Journal of Clinical Microbiology 2003, no. 41, p. 4740-4744. 8 Tendencia, E. A. Disk diffusion method. In: Laboratory manual of standardized methods for antimicrobial sensitivity tests for bacteria isolated from aquatic animals and environment [in:] SEAFDEC Aquaculture Department 2004, p. 13-29.
Gęstość inoculum jest jednym z głównych czynników, które decydują o uzyskiwanych w wyniku tego test rezultatach. W przypadku, kiedy na podłoże agarowe zostanie nałożona inoculum o zbyt małej gęstości, niezależnie od gatunku oraz szczepu danego mikroorganizmu strefa zahamowania będzie mniejsza. Może to prowadzić do uzyskiwania przekłamanych wyników, gdyż strefa zahamowania wzrostu bakterii będzie mieć duże rozmiary, co może doprowadzić do tego, że szczepy, które są oporne na testowany lek zostaną opisane jako wrażliwe. Z kolei w przypadku nałożenia na podłoże i testowania inoculum o zbyt dużej gęstości efekt może być odwrotny. Wielkość uzyskanej dla bakterii strefy zahamowania wzrostu będzie mniejsza, co oznacza możliwość zaklasyfikowania szczepów wrażliwych jako szczepów opornych 9. Drugim czynnikiem mającym bezpośredni wpływ na wyniki uzyskiwane w teście dyfuzyjno-krążkowym jest czas pomiędzy posiewem bakterii na podłoże hodowlane, a czasem nałożenia krążków zawierających lek, na który oporność u danego szczepu bakterii jest analizowana. Posiane płytki, które zostały pozostawione w temperaturze pokojowej dłużej, niż wynikało to z protokołu stosowanego do tego testu, mogły stać się podłożem do namnożenia szczepów bakteryjnych. W wyniku czego strefy zahamowania wzrostu mogą mieć mniejsze rozmiary, a co za tym idzie szczepy mogą zostać opisane jako oporne 10. Kolejną grupę czynników mających wpływ na wynik są temperatura oraz czas inkubacji. Chodzi tutaj o warunki inkubacji posianych na podłożu bakterii z nałożonym na nie krążkiem uwalniającym lek. W przypadku temperatury inkubacji optymalny wzrost bakterii na podłożu w obecności krążka zaleca się temperaturę 35 C. W przypadku niższej temperatury wydłuża się optymalny czas inkubacji, a uzyskiwane strefy zahamowania wzrostu są większe. Jeżeli temperaturę się podnosi, sytuacja przebiega odwrotnie. Z kolei w przypadku czasu inkubacji większość metod zakłada czas inkubacji między 16, a 18 godzinami. Czasami zdarza się, że odczyty są wykonywane już po 6 godzinach, ale są to sytuacje wyjątkowe, przy czym i tak w tak wykonywanym odczycie należy dokonać 9 HO, P. L. i inni. Comparison of a novel, inhibitor-potentiated disc-diffusion test with other methods for the detection of extended-spectrum beta-lactamases in Escherichia coli and Klebsiella pneumonia [in:] Journal of Antimicrobial Chemotherapy 1998, no. 42, p. 49-54. 10 Derbyshire, H. I inni. A simple disc diffusion method for detecting AmpC and extended-spectrum β- lactamases in clinical isolates of Enterobacteriaceae [in:] Journal of antimicrobial chemotherapy 2009, no. 63, p. 497-501.
kolejnego odczytu po optymalnym czasie inkubacji. Zarówno skrócenie jak i wydłużenie czasu inkubacji posianych na podłożu bakterii z krążkiem, z którego dyfunduje testowany lek powoduje przekłamanie otrzymywanych wyników 11. Do czynników mających wpływ na przebieg testów zaliczyć można także rozmiar płytek, w których znajduje się podłoże hodowlane, skład podłoża, grubość warstwy tego podłoża, a także sposób w jaki rozmieszczane są krążki z lekiem. Skład podłoża, na których prowadzi się posiew bakterii jest ściśle ustalony, ponieważ w bezpośredni sposób ustala on warunki wzrostu bakterii, decydując o ich stopniu wzrostu, wielkości ewentualnej strefy zahamowania tego wzrostu, a także o współczynniku dyfuzji i aktywności leku, który uwalniany jest z krążka. Podłoża charakteryzujące się małą grubością z dużym prawdopodobieństwem może wytwarzać się strefa zahamowania wzrostu o rozmiarach większych niż w przypadku standardowej grubości podłoża. Zakłada się, że na płytkach o średnicy między 9, a 10 cm nie powinno się umieszczać więcej niż 5 krążków z lekiem. Zachowanie optymalnej ilości krążków umieszczanych na podłożu zapobiega nakładaniu się poszczególnych stref zahamowania wzrostu bądź też powstawaniu zniekształceń tych stref w obrębie brzegów płytki. Ostatnim, jednak nie mniej ważnym czynnikiem jest stężenie leków w krążkach. Wprost proporcjonalnie zależy średnica zahamowania wzrostu bakterii od stężenia, im większe stężenie leku w krążku, tym większa będzie obserwowana strefa zahamowania wzrostu bakterii 12. Metoda krążkowa - dyfuzyjna charakteryzuje się wysoką powtarzalnością, względnie niskimi kosztami, a także wysokim poziomem standaryzacji. Jeśli chodzi o jej ograniczenia to do tej grupy należy zaliczyć przede wszystkim małą wiarygodność w przypadku testowania lekooporności szczepów wolno - rosnących, a także nieprzydatnością w analizie lekooporności bakterii bezwzględnie beztlenowych. Ponadto należy wspomnieć, że niektóre rodzaje antybiotyków słabo dyfundują w agarze, co powoduje, że obserwuje się niewielkie różnice w strefach zahamowania wzrostu dla bakterii wrażliwych i opornych, co prowadzi do 11 Zaidan, M. R. i inni. In vitro screening of five local medicinal plants for antibacterial activity using disc diffusion method [in:] Trop Biomed 2005, no. 22, p. 165-170. 12 Boyanova, L. Activity of Bulgarian propolis against 94 Helicobacter pylori strains in vitro by agar-well diffusion, agar dilution and disc diffusion methods [in:] Journal of medical microbiology 2005, no. 54, p. 481-483.
błędnie wysnutych wniosków dotyczących lekooporności szczepów bakteryjnych. Do tego typu leków zaliczyć można m. in. glikopeptydy, czy też polimyksynę B 13. 1.3.2. Metody rozcieńczeniowe Metody rozcieńczeniowe, które zostaną opisane w niniejszym podrozdziale pozwalają na wyznaczenie wartości MIC, czyli minimalnego stężenia leku, które powoduje hamowanie wzrostu danego szczepu bakterii. Metody rozcieńczeniowe są metodami pracochłonnymi, w związku z czym najczęściej wykorzystuje się je w analityce powiązanej z badaniami naukowymi. Metoda rozcieńczeniowa jest zwykle przygotowywana przy pomocy sporządzania seryjnych rozcieńczeń (Rys. 1.1). W przypadku analizy lekooporności szczepów bakteryjnych tą metodą sporządza się dwa szeregi rozcieńczeń leku, jeden dla leku, na którego oporność u bakterii podlega analizie oraz drugi szereg, dla leku wzorcowego, którym jest lek o znanym stężeniu hamującym wzrost bakterii. W tym wypadku rozpuszczalnikiem jest specjalne podłoże bulionowe bądź agarowe. Podłoże zależy od tego, czy analiza będzie dokonywana metodą rozcieńczeń w bulionie czy w agarze, przy czym zasada tworzenia szeregów rozcieńczeń leku jest taka sama w obu przypadkach. Należy jednak pamiętać, że podłoże musi umożliwić wzrost wykorzystywanego w badaniach szczepu bakterii 14. 13 Łętowska, I. i A. Olender. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Oznaczanie wrażliwości pałeczek Gram-dodatnich z rodzaju Corynebacterium, Krajowy Ośrodek ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów 2010, str. 3. 14 Wiegand, I. i inni. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances [in:] Nature protocols 2008, no. 3, p. 163-175.
Rysunek 1.1. Schemat przygotowania serii rozcieńczeń w metodzie rozcieńczeniowej Na rysunku 1.1. został zaprezentowany schemat wykonania rozcieńczeń. Należy zwrócić uwagę, że wychodząc z rozcieńczenia początkowego antybiotyku, w każdej następnej probówce rozcieńczenie rośnie dwukrotnie. Do przygotowanych w tek sposób serii rozcieńczeń wprowadza się inoculum bakteryjne o określonej gęstości, które w dalszej kolejności jest inkubowane przez określony czas i w odpowiedniej temperaturze inkubacji, która sprzyja optymalnemu wzrostowi bakterii. W probówkach, w których stężenie antybiotyku było odpowiednio niskie obserwuje się wzrost bakterii, z kolei w probówkach w których stężenie antybiotyku było wysokie wzrostu bakterii się nie obserwuje. Należy jednak zauważyć, że jest to pierwsza część analiz, która wyznacza jedynie granicę rozcieńczenia, a zatem granicę stężenia danego leku, przy której obserwuje się zahamowanie wzrostu szczepu bakterii. Ponieważ rozstrzał wartości między kolejnymi rozcieńczeniami jest stosunkowo duży po ustaleniu granicy rozcieńczeń należy przygotować drugą serię rozcieńczeń analizowanego leku, która będzie zawężać analizowany przedział. Na przykład w przypadku określenia rozcieńczenia 1:8 jako rozcieńczenia hamującego wzrost powinno się sporządzić w drugiej serii rozcieńczenia 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12 W ten sposób ogranicza się
możliwość popełnienia błędu w analizie. Po ustaleniu rozcieńczenia, w którym dochodzi do hamowania wzrostu bakterii, w dalszej kolejności rozcieńczenie przeliczane jest na wartość stężenia ponieważ znając najmniejsze stężenie hamujące wzrost bakterii dla leku wzorcowego możliwe jest określenie ile antybiotyku znajdowało się w 1 ml próbki 15. Jak już wspomniano metoda może być wykonywana w bulionie bądź w agarze. Metoda rozcieńczeń w bulionie jest przeprowadzana albo w probówkachi jest to tak zwana metoda makrorozcieńczeń (zwykle 2 ml bulionu) albo w specjalnych płytkach titracyjnych i wtedy metodę określa się metodą mikrorozcieńczeń (o pojemności 0,1ml). Metoda makrorozcieńczeń wykorzystywana jest w przypadku, kiedy konieczne jest przeprowadzenie analizy oporności dla pojedynczego szczepu bakterii. W przypadku metody rozcieńczeń w bulionie obserwowany jest stopień zmętnienia próby. Z kolei metoda rozcieńczeniowa w agarze dotyczy sytuacji, kiedy lek o malejących wartościach stężenia dodawany jest do podłoża stałego, na które następnie posiewana jest zawiesina bakteryjna. Obserwacji podlega ilość kolonii bakteryjnych wyrosłych na wszystkich podłożach podłożu 16. Do czynników limitujących użyteczność tej metody należy zaliczyć przede wszystkim pracochłonność, a co za tym idzie także i czasochłonność metody i relatywnie długi czas oczekiwania na wyniki analizy, co w niektórych przypadkach może być głównym czynnikiem limitującym użyteczność tej metody. Z powodzeniem metoda ta może być stosowana dla określenia oporności na leki drobnoustrojów, które wolno rosną na podłożach stałych, np. dla prątków gruźlicy 17. 1.3.3. E - testy E - testy określane też z języka angielskiego Epsilometer test są metodą, która łączy obu wcześniej zaprezentowanych metod, tzn. metody rozcieńczeniowej oraz metody dyfuzyjno - krążkowej. Metoda ta opiera się na wytwarzaniu w podłożu agarowym ciągłego, a 15 Luber, P. Comparison of broth microdilution, E Test, and agar dilution methods for antibiotic susceptibility testing of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli [in:] Journal of clinical microbiology 2003, no. 41, p. 1062-1068. 16 Karlsson, M. i inni. Antimicrobial susceptibility testing of Australian isolates of Brachyspira hyodysenteriae using a new broth dilution method [in:] Veterinary microbiology 2002, no. 84, p. 123-133. 17 Alexander, B. Comparative evaluation of E-test and Sensitive Yeast One panels against the Clinical and Laboratory Standards Institute M27-A2 reference broth microdilution method for testing Candida susceptibility to seven antifungal agents [in:] Journal of clinical microbiology 2007, no. 45, p. 698-706.
co ważne stabilnego gradientu stężeń danego leku. Podobnie jak w przypadku poprzednich metod, zastosowanie E - testu pozwala na ustalenie najmniejszego stężenia danego leku, które powoduje hamowanie wzrostu danego szczepu bakterii. E - test jest to plastikowy pasek nasączony odpowiednim antybiotykiem w gradiencie stężeń. Zwykle pasek ten jest plastikowy i ma zdefiniowaną ilość stężeń danego antybiotyku oraz wartości tych stężeń. Test jest przeprowadzany na płytce agarowej, na której umieszcza się inoculum bakteryjne o odpowiedniej gęstości, a następnie nakłada pasek E-testu. W dalszej kolejności następuje inkubacja w odpowiedniej temperaturze i przez odpowiedni okres czasu. Po okresie inkubacji na płytce pojawia się elipsa, która przecina pasek testowy w punkcie wartości MIC (wyrażonej w μg/ml). Jest to wartość stężenia, która spowodowała zahamowanie wzrostu tych bakterii 18. Jak już wspomniano metoda łączy metodą dyfuzyjną oraz rozcieńczeniową. Z metody rozcieńczeniowej zapożyczone zostały różne stężenia danego leku, przy czym w tej metodzie znajduję się one na jednym pasku, a nie każde w osobnej probówce. Z kolei z metody dyfuzyjnej pozostaje pomysł posiewania bakterii na podłoże stałe i nakładania na nie określonych elementów, uwalniających antybiotyk w wyniku można obserwować zróżnicowany wygląd kolonii bakteryjnych w zależności od stężenia antybiotyku. Także i w tym przypadku można mówić o strefie zahamowania wzrostu bakterii. Obecnie na rynku dostępne są komercyjnie przygotowane paski nasączone w odpowiednich roztworach leków. Ze względu na koszt, jest to metoda przeznaczona do analiz, kiedy wcześniejsze wyniki wskazują na całkowitą oporność danego szczepu bakteryjnego na wszystkie leki 19. E - testy do analizy lekooporności bakterii z powodzeniem mogą być stosowane w określaniu wartości MIC mikroorganizmów charakteryzujących się wysokimi wymaganiami wzrostowymi, wolnorosnącymi bądź występującymi u pacjentów ze specyficzną infekcją. Ponadto zastosowanie dostępnych komercyjnie E-testów pozwala na oznaczanie niskich poziomów oporności szczepów bakteryjnych na dany lek, a także testowanie nowych leków, 18 Arroyo, L. A. I inni. Reliability of the E-test method for detection of colistin resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii [in:] Journal of clinical microbiology 2005, no. 43, p. 903-905. 19 Lu, J. In vitro antifungal susceptibility testing of Candida blood isolates and evaluation of the E-test method [in:] Journal of microbiology, immunology, and infection 2004, no. 37, p. 335-342.
bądź też takich, które nie są wykorzystywane w standardowym leczeniu pacjentów. Ponadto metoda ta ze względu na swoją wysoką czułość z powodzeniem może być wykorzystywana do potwierdzenia wcześniej uzyskanych wyników 20. 20 Orhan, G. Synergy tests by E test and checkerboard methods of antimicrobial combinations against Brucella melitensis [in:] Journal of clinical microbiology 2005, no. 43, p. 140-143.