BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. XL, 2007, 4, str. 375 379 Anna Rybarczyk, Ryszard Amarowicz CHROMATOGRAFIA KOLUMNOWA ZWIA ZKÓW FENOLOWYCH SŁODKIEGO ŁUBINU NA ŻELU KRZEMIONKOWYM Zakład Analizy Żywności Oddziału Nauki o Żywności Instytutu Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności Polskiej Akademii Nauk w Olsztynie Kierownik: doc. dr hab. R. Amarowicz Z nasion słodkiego łubinu uzyskano ekstrakt zwia zków fenolowych stosuja c 80% metanol. W wyniku chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z faza ruchoma chloroform-metanol-woda (35:65:10; v/v/v) wyodrębniono cztery frakcje (I IV) zwia zków fenolowych. Zawartość fenoli ogółem wahała się w nich od 32 do 112 mg/g. Widmo UV wskazuje na obecność izoflawonów we frakcjach I i II oraz fenolokwasów, flawonoli lub flawonów we frakcjach III i IV. Hasła kluczowe: słodki łubin, związki fenolowe, chromatografia kolumnowa, żel krzemionkowy. Key words: sweet lupin, phenolic compounds, column chromatography, silica gel. Nasiona łubinu charakteryzują się wysoką wartością odżywczą ze względu na zawartość białka, składników mineralnych, błonnika, oligocukrów i związków polifenolowych. Łubin może być uprawiany na obszarach o zmiennych warunkach klimatycznych i glebowych (1). Zainteresowanie łubinem w obszarze nauki o żywności wzrosło z chwilą wyhodowania niskoalkaloidowych odmian łubinu (2). Podobnie jak nasiona innych roślin strączkowych, nasiona łubinu są bogatym źródłem związków fenolowych. Obecność izoflawonów i flawan-3-oli w łubinie zanotowali Stobiecki i Popenda (3). Zawarość proantocyjanidyn badali Ricardo da Silva i współpr. (4). Flawonoidy ekstrahowane z nasion łubinu benzenem, eterem etylowym i octanem etylu analizowali Merino i współpr. (5). Występowanie 2 -OH-genisteiny, genisteiny i licoizoflawonu-a w różnych częściach anatomicznych Lupinus albus zostało potwierdzone przez Baer i współpr. (6). W cytowanej pracy izoflawony łubinu wykazywały efekt grzybotoksyczny. Efekt antybakteryjny związków fenolowych z nasion wąskolistnego łubinu zanotowano względem Lactobacillus acidophilus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis i Staphylococcus aureus (7). Aktywność przeciwutleniająca związków fenolowych z nasion łubinu opisana została w kilku pracach naukowych (1, 7, 8, 9). W świetle powyżej przytoczonych informacji zasadne wydają się dalsze badania nad bliższym poznaniem związków fenolowych łubinu. W procesie oczyszczania związków fenolowych podstawowe zastosowanie znajduje chromatografia kolumnowa. W niniejszej pracy do rozfrakcjonowania związków fenolowych z nasion słodkiego łubinu zastosowano żel krzemionkowy.
376 A. Rybarczyk, R. Amarowicz Nr 4 MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiły nasiona słodkiego, białego łubinu odmiany Pikador zakupionego w Ośrodku Hodowli Roślin w Olsztynie. Zmieloną próbkę nasion o masie 40 g przesypaną do kolby okrągłodennej o obj. 500 cm 3 zalano 80% (v/v) roztworem metanolu przy stosunku materiału stałego do solwentu 1:8 (w/v) (10). Następnie szczelnie zamkniętą kolbę umieszczono w łaźni wodnej z wytrząsaniem. Ekstrakcję prowadzono przez 15 min. w temp. 60 C. Po schłodzeniu metanolowy supernatant filtrowano przez bibułę Whatman 1. Pozostały na sączku materiał przenoszono z powrotem do kolbki. Ekstrakcję przeprowadzono trzykrotnie, a uzyskane przesącza łączono. Z tak uzyskanego materiału oddestylowano metanol w wyparce rotacyjnej w temp. 40 C, pozostałą zaś wodę usunięto na drodze liofilizacji. Kolumnę chromatograficzną wypełnioną żelem krzemionkowym (40 63 μm; Merck) przemyto najpierw w kolejności trzema objętościami metanolu i fazy ruchomej chloroform-metanol-woda (35:65:10; v/v/v) (11). Ekstrakt (500 mg) rozpuszczono w 5 cm 3 metanolu i naniesiono na kolumnę. Eluat zbierano za pomocą kolektora frakcji (4 cm 3 /probówkę). Rozdział chromatograficzny monitorowano poprzez pomiar gęstości optycznej eluatu w UV przy dł. fali 270 i 330 nm. W oparciu o wykreślony chromatogram uzskany eluat połączono w główne frakcje. Po odparowaniu rozpuszczalnika w wyparce rotacyjnej w temp. 45 C uzyskany materiał zważono. Zawartość fenoli ogółem w tak uzyskanych frakcjach oznaczono kolorymetrycznie z odczynnikiem fenolowym Folina-Ciocalteu a (12). Kwas sinapowy przyjęto w niniejszej pracy jako substancję wzorcową. Widmo w UV związków fenolowych zawartych w poszczególnych frakcjach zarejestrowano za pomocą spektrofotometru Beckman DU 7500. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W wyniku chromatografii kolumnowej na żelu krzmionkowym z fazą ruchomą chloroform-metanolwoda (35:65:10; v/v/v) z ekstraktu metanolowego nasion słodkiego łubinu uzyskano cztery frakcje (I IV) zawierające związki fenolowe (ryc. 1). Frakcja I charakteryzowała się największym udziałem Ryc. 1. Rozdział ekstraktu związków fenolowych z nasion słodkiego łubinu na kolumnie z żelem krzemionkowym. Fig. 1. Silica gel column chromatography of phenolic compounds from the extract of sweet lupin seeds.
Nr 4 Chromatografia kolumnowa związków fenolowych 377 masowym w ekstrakcie (tab. I). Zawartość zwiazków fenolowych w niej była jednak najmniejszą (32.6 mg/g). Masy frakcji II i III były podobne, jednak zawartość fenoli we frakcji III była wyraźnie wyższa niż we frakcji II (odpowiednio 55 i 91 mg/g). Masa uzyskanej frakcji IV była wprawdzie najniższa, jednak zawartość w niej związków fenolowych była najwyższa (112 mg/g). Tabela I Charakterystyka frakcji zwia zków fenolowych uzyskanych w wyniku chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym Table I Characteristic of the fractions of phenolic compounds obtained using a silica gel column chromatography Frakcja Masa (mg) Zawartość fenoli ogółem (mg/g) Maksimum w widmie UV (nm) I 230 32 ± 1 271, 279, 286 II 103 55 ± 2 270 III 100 91 ± 3 271, 331 IV 18 112 ± 4 275, 327 Ryc. 2. Widma UV związków fenolowych w frakcjach uzyskanych w wyniku chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Fig. 2. UV spectra of phenolic compounds found in fractions obtained using a silica gel column chromatography.
378 A. Rybarczyk, R. Amarowicz Nr 4 Uzyskane w pracy zawartości związków fenolowych we frakcjach II IV uznać należy za wysokie. Są one wyższe lub zbliżone do zawarości jakie stwierdzono w przypadku frakcji uzyskanych z nasion roślin strączkowych i oleistych za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu Sephadex LH-20 z metanolem lub etanolem jako fazami ruchomymi (13 16). W chromatografii na żelu krzemionkowym w odróżnieniu od chromatografii na lipofilnym Sephadeksie dominujący pik odpowiadający związkom fenolowym charakteryzuje się większą objętością elucji. Widmo UV związków fenolowych zawartych we frakcjach I IV było zróżnicowane (ryc. 2). W przypadku frakcji I i II zanotowano silne pasma absorpcji przy krótszych długościach fali (tab. I). Ich źródłem mogły być izoflawony (17). Obecność tej grupy flawonoidów w nasionach łubinu opisana jest w piśmiennictwie (18). Maksimum w widmie frakcji III i IV wskazuje o zawartości w tych frakcjach fenolokwasów (19). Stosunkowo wysokie odczyty absorbancji w obszarze 340 360 nm przemawiają o obecności w tych frakcjach najprawdopodobniej również flawonoli lub flawonów (17). WNIOSKI Zastosowana metoda chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym pozwala wyodrębnić z ekstraktu metanolowego z nasion łubinu słodkiego frakcje różniące się zawartością i składem związków fenolowych. Ten rodzaj chromatografii może być stosowany w uzyskiwaniu czystych związków fenolowych nasion słodkiego łubinu jako etap poprzedzający semipreparatywną metodę HPLC w układzie odwróconych faz. Należy podkreślić, że koszt żelu krzemionkowego jest wielokrotnie niższy niż żelu Sephadex LH-20, który najczęściej jest stosowany w chromatografii kolumnowej ekstraktów związków fenolowych z surowców roślinnych. A. R y b a r c z y k, R. A m a r o w i c z SILICA GEL COLUMN CHROMATOGRAPHY OF PHENOLIC COMPOUNDS IN SWEET LUPIN SEEDS EXTRACT Summary Extract of sweet lupin seeds was prepared using 80% methanol. Four fractions (I-IV) were separated from the crude extract on a silica gel column using chloroform-methanol-water (35:65:10; v/v/v/) as the mobile phase. The content of total phenolics in the resultant fractions ranged from 32 to 112 mg/g. Results of UV spectroscopy show the presence of isoflavones in fractions I and II, and phenolic acids, flavonols or flavones in fractions III and IV. PIŚMIENNICTWO 1. Tsaliki E., Lagouri G., Doxastakis L.G.: Evaluation of the antioxidant activity of lupin seed flour and derivatives (Lupinus albus ssp. Graecus). Food Chem., 1999; 65: 71-75. 2. Gladstones J.S.: Development of lupins as new crop legume. Food Australia, 1990; 42: 270-276. 3. Stobiecki M., Popenda M.: Flavan-3-ols from seeds of Lupinus augustifolius. Phytochemistry, 1994; 37: 1707-1711. 4. Ricardo da Silva J.M., Laureano O., Beiaro da Costa M.L.: Total phenol and proanthocyanidin evaluation of Lupinus species. Materiały z konferencji: 7 th International Lupin Conference, Evora, Portugal, 250-254. 5. Merino E.F., Fuentes E., Plnchuelo A.M.: Phytochemical characterization of lupin species of South America. Materiały z konferencji: 9 th International Lupin Conference, International Lupin Association, Canterbury, New Zeland, 1999; 291-293. 6. Baer D., Saelzer R., Vega M., Ibieta P., Molina L., Baer E., Ibanez Hashagen U.: Isoflavones and anthracnose in Lupinus albus and L. Angustifolius. Materiały z konferencji: 9 th International Lupin Conference, International Lupin Association, Canterbury, New Zeland, 1999; 26-32. 7. Bielecka M., Gulewicz K., Kozłowska H., Łatosz A., Starzyk-Tyllo K., Stobiecki M.: Przeciwutleniające i antybakteryjne właściwości ekstraktu nasion
Nr 4 Chromatografia kolumnowa związków fenolowych 379 łubinu wąskolistnego (Lupinus angustifolius L.). Materiały z konferencji: Łubin we współczesnym rolnictwie, Olsztyn, 1997. 8. Lampart-Szczapa E., Korczak J., Nogala-Kalucka M., Zawirska- Wojtasik R.: Antioxidant properties of lupin seed products. Food Chem., 2003; 83: 279-285. 9. Frijas J., Miranda M.L., Doblado R., Vidal-Valverde C.: Effect of germination and fermentation on the antioxidant vitamin content and antioxidant capacity of Lupinus albus L. var. Multolupa. Food Chem., 2005; 92: 211-220. 10. Amarowicz R., Piskuła M., Honke J., Rudnicka B., Troszyńska A., Kozłowska H.: Extraction of phenolic compounds from lentil (Lens culinaris) with various solvents. Pol. J. Food Nutr. Sci., 1995; 45: 53-62. 11. Amarowicz R., Wanasundara J.K.J.P.D., Shahidi F.: Chromatographic separation of flaxseed phenolics. Nahrung, 1994; 38: 520-526. 12. Naczk M., Shahidi F.: The effect of methanol-ammoniawater treatment on the content of phenolic acids of canola. Food Chem., 1998; 31: 159-164. 13. Amarowicz R., Karamać M., Kmita-Głażewska H., Troszyńska A., Kozłowska H.: Antioxidant activity of phenolic fractions of everlasting pea, faba bean and broad bean. J. Food Lipids, 1998; 3: 199-211. 14. Amarowicz R., Naczk M., Shahidi, F.: Antioxidant activity of various fractions of non-tannin phenolics of canola hulls. J. Agric. Food Chem., 2000; 48: 2755-2759. 15. Chavan U.D., Amarowicz R., Shahidi F.: Antioxidant activity of phenolic fractions of beach pea (Lathyrus maritimus L.). J. Food Lipids, 1999; 6: 1-11. 16. Amarowicz R., Shahidi F.: Application of Sephadex LH-20 chromatography for the separation of cyanogenic glycosides and hydrophylic phenolic fraction from flaxseed. J. Liquid Chrom., 1994; 17: 1291-1299. 17. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B.: The Systematic Identification of Flavonoids, Springer Verlag, New York Heidelberg Berlin, 1970; 41-227. 18. Katagiri Y., Ibrahim R.K., Tahara S.: HPLC analysis of white lupin isoflavonoids. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2000; 64: 1118-1125. 19. Naczk M., Amarowicz R., Sullivan N., Shahidi F.: Current research developments on polyphenolics of rapeseed/canola: a review. Food Chem., 1998; 62: 489-502. Adres: 10-747 Olsztyn, ul. Tuwima 10.