Magdalena Karamać, Agnieszka Kosińska ROZDZIAŁ NATYWNYCH FENOLOKWASÓW PSZENICY METODA RP-HPLC-DAD

Transkrypt

1 BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. XL, 2007, 2, str Magdalena Karamać, Agnieszka Kosińska ROZDZIAŁ NATYWNYCH FENOLOKWASÓW PSZENICY METODA RP-HPLC-DAD Zakład Analizy Żywności, Oddział Nauki o Żywności Instytutu Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności Polskiej Akademii Nauk w Olsztynie Kierownik: doc. dr hab. R. Amarowicz Z ziarniaków pszenicy otrzymano ekstrakt zwia zków fenolowych stosuja c ekstrakcję 80% metanolem i niskociśnieniowa chromatografię kolumnowa na żelu RP-18. Zwia zki fenolowe zawarte w tak otrzymanym ekstrakcie analizowano następnie jakościowo metoda RP-HPLC-DAD w systemie gradientowym. Otrzymany chromatogram charakteryzował się obecnościa 8 głównych pików. Jeden z nich pochodził od kwasu sinapowego. Widma UV-DAD pozwalaja stwierdzić, że pozostałe zwia zki fenolowe były pochodnymi kwasu sinapowego. Hasła kluczowe: pszenica, fenolokwasy, RP-HPLC-DAD. Key words: wheat, phenolic acids, RP-HPLC-DAD. Fenolokwasy stanowią grupę związków fenolowych typową dla ziarniaków zbóż (1). Aktywność przeciwutleniająca fenolokwasów jest dobrze udokumentowana w literaturze naukowej (2 5). Ekstrakty związków fenolowych uzyskiwanych ze zbóż wykazywały właściwości przeciwutleniające i przeciwrodnikowe w badaniach wykorzystywano różne metody zmiatanie DPPH i ABTS, siłę redukcyjną, układ emulsyjny z β-karotenem i kwasem linolenowym (6 9). Biorąc pod uwagę przytoczone powyżej dane oraz uwzględniając duże spożycie produktów zbożowych ważne są badania dotyczące fenolokwasów zbóż. W ziarniakach fenolokwasy tylko w niewielkich ilościach występują w wolnej postaci (10 12). Większość ich spotykana jest w postaci estrów, w mniejszej ilości związane są z cukrami (10 12). Fenolokwasy ekstrahuje się z ziarniaków zbóż roztworem alkoholu. Po destylacji i liofilizacji otrzymuje się surowy ekstrakt związków fenolowych i cukrowców (10). Po zawieszeniu naważki ekstraktu w wodzie zakwaszonej do ph 2 wolne fenolokwasy ekstrahowane są do eteru etylowego lub octanu etylu. Pozostałe w fazie wodnej fenolokwasy uwalniane są z estrów na drodze hydrolizy zasadowej i ekstrahowane do eteru etylowego lub octanu etylu. W trzeciej fazie analizy stosuje się hydrolizę kwasową, a uwolnione z glikozydów fenolokwasy ponownie ekstrahowane są w układzie ciecz-ciecz. Trzy uzyskane w powyższy sposób frakcje analizowane są następnie bezpośrednio metodą HPLC (10) lub po sililacji metodą GC (13). Przytoczony tok analityczny daje wprawdzie ilościowy obraz fenolokwasów zawartych w ziarniaku lecz nie dostarcza informacji na temat samych postaci

2 174 M. Karamać, A. Kosińska Nr 2 w jakiej występują fenolokwasy. Ponieważ aktywność biologiczna formy związanej np. właściwości przeciwutleniające mogą się różnić od aktywności wolnych fenolokwasów ważne wydaje się oznaczanie właśnie poszczególnych form natywnych. Do tego niezbędne jest oczywiście otrzymanie ich w postaci czystych związków i ustalenie metodami spektroskopowymi ich struktury chemicznej. Prezentowana praca, której celem była analiza natywnych pochodnych fenolowkwasów z ziarniaków pszenicy metodą HPLC w układzie odwróconych faz z detekcją fotodiodową, stanowi wstęp do takich właśnie badań. MATERIAŁ I METODY Materiał do badań ziarniaki pszenicy odmiany Alba otrzymano z Katedry Biochemii Uniwersytetu Warmińskiego-Mazurskiego w Olsztynie. Zmieloną próbkę ziarniaków o masie 40 g przesypaną do kolby okrągłodennej obj. 500 cm 3 zalano 80% (v/v) roztworem metanolu przy stosunku materiału stałego do solwentu 1:8 (w/v) (14). Następnie szczelnie zamkniętą kolbę umieszczono w łaźni wodnej z wytrząsaniem. Ekstrakcję prowadzono przez 15 min. w temp. 60 C. Po schłodzeniu metanolowy supernatant filtrowano przez bibułę Whatman 1. Pozostały na sączku materiał przenoszono z powrotem do kolbki. Ekstrakcję przeprowadzono trzykrotnie, a uzyskane przesącza łączono. Z tak uzyskanego materiału oddestylowano metanol w wyparce rotacyjnej w temp. 40 C, pozostałą zaś wodę usunięto na drodze liofilizacji. Masę 1 g liofilizatu zawieszono w 10 cm 3 wody destylowanej i naniesiono na kolumnę chromatograficzną (2 15 cm) wypełnioną żelem RP-18 (20 43 μm, Merck), którą poprzednio przemyto trzema objętościami wody. Cukrowce obecne w ekstrakcie wymyto z kolumny wodą destylowaną. Do wymycia zaś związków fenolowych zastosowano 200 cm 3 czystego metanolu. Eluat zagęszczono do sucha w wyparce rotacyjnej. Jakościową analizę natywnych pochodnych fenolokwasów przeprowadzono metodą HPLC. Warunki analizy: system chromatograficzny firmy Shimadzu składał się z 2 pomp LC 10AD, detektora fotodiodowego SPD-M 10A, systemu kontrolującego SCL 10A i kolumny LiChrospher 100 RP-18 (4 250 mm, 5 μm; Merck). Zastosowano rozdział w gradiencie: faza A: acetonitryl kwas octowy woda (5;2;93, v/v/v); faza B: acetonitryl kwas octowy woda (80;2;18, v/v/v). gradient: faza B od 0 do 100% w ciągu 50 min. Prędkość przepływu wynosiła 1 cm 3 /min., objętość nanoszonej próby 0,02 cm 3, dł. fali przy detekcji 320 nm. WYNIKI I DYSKUSJA Chromatogram rozdziału natywnych związków fenolowych wyekstrahowanych z ziarniaków pszenicy przedstawiono na ryc. 1. Na chromatogramie zanotowano obecność 8 głównych pików (1 8). Ich czasy retencji wynosiły odpowiednio: 1 8,17 min.; 2 12,18 min.; 3 13,00 min.; 4 14,10 min.; 5 14,65 min.; 6 16,98 min.; 7 28,25 min.; 8 41,35 min. Widma UV-DAD (ryc. 2) związków fenolowych zarejestrowanych jako piki 1 8 były typowe dla fenolokwasów i charakteryzowały się maksimami absorpcji przy dł. fali 328 nm (1), 327 nm (2), 326 nm (3, 4), 324 nm (8) i 322 nm (5, 6, 7). Na widmach 3 i 5 zanotowano drugie maksim przy 277 i 276 nm; punkt przegięcia (ramię) przy 276 nm widoczne było w widmie 6. Stwierdzone w niniejszej pracy duże zróżnicowanie czasów retencji pików na chromatogramie wskazuje, że fenolokwasy w ziarniakach pszenicy występują w postaci związków bardzo różniących się pod względem polarności. Nastrzykując na kolumnę standard kwasu sinapowego i porównując uzyskany czas retencji oraz widmo UV-DAD z wynikami analizy HPLC ekstraktu stwierdzono, że pik nr 7 pochodzi właśnie od kwasu sinapowego. Ponieważ w chromatografii kolumnowej w układzie odwróconych faz analizowane związki są wymywane z kolumny w kierunku malejącej polarności wyciągnąć można wniosek, że większość natywnych związków fenolowych w ziarniakach pszenicy stanowią pochodne kwasu sinapowego charakteryzujące się większą polarnością niż kwas sinapowy.

3 Nr 2 Rozdział fenolokwasów pszenicy za pomocą metody RP-HPLC-DAD 175 Wydaje się, że związki te nie są raczej glikozydami kwasu sinapowego. Dane literaturowe (11, 12) wskazują, że niewielka tylko ilość fenolokwasów występuje w tej właśnie postaci. Związki te nie są również kwasem sinapowym zestryfikowanym alkoholem etylowym lub metylowym. Grupa alkilowa w cząsteczce estru zmniejsza bowiem polarność związku w porównaniu z fenolokwasem i na chromatogramie czas retencji takiego związku jest większy niż w przypadku fenolokwasu. Biorąc pod uwagę tę właściwość można przypuszczać, że jedynie związek dający na chromatogramie pik 8 być może takim właśnie związkiem. Ryc. 1. Chromatogram rozdziału RP-HPLC-DAD natywnych fenolokwasów. Fig. 1. RP-HPLC-DAD chromatogram of native phenolic acids. Pochodne kwasu sinapowego dające piki 1 6 nie są w swej naturze również depsydami lub deptydami. W tego typu powiązaniach uczestniczą bowiem grupy hydroksylowe pierścienia aromatycznego, co oczywiście zmniejsza polarność związku. Wysoka polarność związków dających piki 1 6 wynika najprawdopodobniej z polarności związku, który wiąże się z kwasem sinapowym poprzez jego grupę karboksylową. Za taką hipotezą przemawiać może duża szerokość piku 1 na chromatogramie. Takim właśnie szerokim pikiem w wysokosprawnej chromatografii kolumnowej cieczowej w układzie odwróconych faz (RP-HPLC) i w micelarnej chromatografii elektrokinetycznej (MEKC) charakteryzuje się sinapina (15), która jest kwasem sinapowym zestryfikowanym choliną. WNIOSKI W ziarniakach pszenicy większość kwasu sinapowego występuje w postaci polarnych połączeń estrowych z nieznanymi związkami naturalnymi. Zastosowanie semipreparatywnej RP-HPLC w układzie gradientowym pozwoli uzyskać czyste substancje do badań spektroskopowych.

4 176 M. Karamać, A. Kosińska Nr 2 Ryc. 2. Widma UV-DAD natywnych fenolokwasów rozdzielonych metodą RP-HPLC-DAD 1-8 jak na ryc. 1. Fig. 2. UV-DAD spectra of native phenolic acids after RP-HPLC-DAD separation 1-8 according to fig. 1.

5 Nr 2 Rozdział fenolokwasów pszenicy za pomocą metody RP-HPLC-DAD 177 M. K a r a m a ć, A. K o s i ń ska SEPARATION OF NATIVE PHENOLIC ACIDS OF WHEAT BY RP-HPLC-DAD Summary Extract of phenolic compounds was obtained from wheat grains using 80% methanol and purified by RP-18 low pressure column chromatography. The extract was then analysed by RP-HPLC-DAD in gradient system. The resultant chromatogram was characterized by the presence of 8 main peaks. One of them originated from sinapic acid. The UV-DAD spectra confirmed that other phenolic constituents present in wheat were the derivatives of sinapic acid. In general, the polarity of those compounds was higher than that of sinapic acid. PIŚMIENNICTWO 1. White P.J., Xing Y.: Antioxidants from cereals and legumes. Shahidi F. (ed.): Natural Antioxidants. Chemistry, Health Effects, and Applications. AOCS Press, Champaign, Illinois, 1995; Brand-Williams W., Cuvelier M.E., Berset C.: Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensm.-Wiss.Technol., 1995; 28: Graf E.: Antioxidant activity of ferulic acid. Free Rad. Biol. Med., 1992; 13: Karamać M., Kosińska A., Pegg R.B.: Comparision of radical scavenging activities for selected phenolic acids. Pol. J. Food Nutr. Sci., 2005; 55: Karamać M., Buciński A., Pegg R.B., Amarowicz R.: Antioxidant and antiradical activity of ferulates. Czech J. Food Sci., 2005; 23: Karamać M., Amarowicz R., Weidner S., Shahidi F.: Antioxidant activity of rye caryopses and embryos extracts. Czech J. Food Sci., 2002; 20: Karamać M., Amarowicz R., Weidner S., Abe S., Shahidi F.: Antioxidant activity of triticale caryopses and embryos extracts. Food Sci. Biotechnol., 2004; 13: Amarowicz R., Karamać M., Weidner S., Abe S., Shahidi F.: Antioxidant activity of wheat caryopses and embryos extracts. J. Food Lipids, 2002; 9: Zieliński H., Kozłowska H.: Antioxidant activity and total phenolics in selected cereal grains and their different morphological fractions. J. Agric. Food Chem., 2000; 48: Amarowicz R., Weidner S.: Content of phenolic acids in rye caryopses determined using HPLC-DAD method. Czech J. Food Sci., 2001; 19: Weidner S., Amarowicz R., Karamać M., Da browski K.: Phenolic acids in caryopses of two cultivars of wheat, rye and triticale that display different resistance to preharvest sprouting. Eur. Food Res. Technol., 1999; 210: Weidner S., Amarowicz R., Karamać M., Fra czek E.: Changes in endogenous phenolic acids during development of Secale cereale caryopses and after treatment of unripe rye grains. Plant Physiol. Biochem., 2000; 38: Weidner S., Paprocka J., Łukaszewicz D.: Changes in free, esterified and glycosidic phenolic acids in cereal grains during the after-ripening. Seed Sci.Technol., 1996; 24: Amarowicz R., Piskuła M., Honke J., Rudnicka B., Troszyńska A., Kozłowska H.: Extraction of phenolic compounds from lentil (Lens culinaris) with various solvents. Pol. J. Food Nutr. Sci., 1995; 45: Amarowicz R., Kołodziejczyk P., Pegg R.B.: Chromatographic separation of phenolic compounds from rapeseed by a Sephadex LH-20 column with ethanol as the mobile phase. Liquit Chromat. Relat. Techn., 2003; 13: Adres: Olsztyn, ul. Tuwima 10.