Czas. Stomatol., 2008, 61, 6, 387-394 2008 Polish Dental Society http://www.czas.stomat.net Ocena stężenia interleukiny 2 w surowicy krwi obwodowej i ślinie stymulowanej u chorych z aftami nawracającymi Comparison of IL-2 concentration in peripheral blood and stimulated saliva found in individuals suffering from recurrent apthae stomatitis (RAS) and in healthy ones Maciej Nowak, Renata Górska Z Zakładu Chorób Błony Śluzowej i Przyzębia IS WUM w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. R. Górska Summary Aim of the study: To determine the correlation between concentration of IL-2 in stimulated saliva and in peripheral blood found in individuals suffering from recurrent apthae (RAS) and in healthy ones. Material and methods: The study involved 46 individuals including 36 with recurrent apthous ulcers and 11 healthy volunteers as the control group. The concentration of IL-2 was assessed by means of ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) method and sets of reagents. Results: The mean concentration of IL-2 in stimulated saliva of patients with recurrent apthae was statistically insignificant (p<0.05) in comparison with the control group. However, an increased concentration of IL-2 in peripheral blood was observed in patients with RAS without affecting IL-2 concentration in stimulated saliva, which may indicate the production of this cytokine by lymphocyte T. Streszczenie Cel pracy: celem pracy było określenie zależności zachodzących pomiędzy stężeniem IL-2 w ślinie stymulowanej oraz stężeniem tej cytokiny w surowicy krwi obwodowej u osób z aftami i osób zdrowych. Materiał i metody: w badaniu uczestniczyło 46 osób, w tym 35 osób z rozpoznanymi aftami nawracającymi (RAS) i 11 osób zdrowych stanowiących grupę kontrolną. Stężenie IL-2 oznaczano metodą immunoenzymatyczną ELISA (ang. enzyme linked immunosorbent assay) z zastosowaniem gotowych zestawów odczynnikowych. Wyniki: wykonane badanie stężenia IL-2 w ślinie stymulowanej u chorych z aftami nie wykazało statystycznej różnicy stężenia tej cytokiny w porównaniu z grupą kontrolną. Odnotowano natomiast zwiększenie stężenia IL-2 w surowicy krwi obwodowej u osób z RAS przy jednoczesnym braku różnic w jej stężeniu w ślinie stymulowanej, co może sugerować wytwarzanie tej cytokiny przez limfocyty T. KEYWORDS: recurrent apthous stomatitis, immunological disorders, interleukine 2, peripheral blood, stimulated saliva HASŁA INDEKSOWE: afty nawracające, zaburzenia immunologiczne, interleukina 2, krew obwodowa, ślina stymulowana 387
M. Nowak, R. Górska Czas. Stomatol., Wstęp Afty nawracające (ang. Recurre Aphtae Stomatitis, RAS) najczęściej występują u osób młodych. Ich skuteczne leczenie stanowi poważny problem terapeutyczny, który nie jest w pełni rozwiązany [6, 14, 18]. Dane dotyczące częstości występowania aft nawracających w populacji ogólnej wahają się w zależności od ośrodka wykonującego badania epidemiologiczne w granicach od 17% do 50%, z nieznaczną przewagą wśród kobiet [5, 11]. Etiologia aft nawracających do chwili obecnej nie jest wyjaśniona. Niemniej przyjęto, że ta choroba jest następstwem różnorodnych czynników, zarówno miejscowych, jak i ogólnych [6, 19]. Pierwszoplanowym czynnikiem miejscowym sprzyjającym powstawaniu aft nawracających jest uraz, powstały na skutek nieprawidłowo wykonanych uzupełnień protetycznych, obecności startych i ostrych zębów, parafunkcji, podczas szczotkowania zębów, spożywania twardych pokarmów lub leczenia stomatologicznego, włączając w to iniekbcje znieczulające. Wśród czynników ogólnych na szczególną uwagę zasługują zaburzenia immunologiczne [7, 13, 21, 22]. Afty mogą występować bez uchwytnej przyczyny lub mogą być związane z predyspozycjami wrodzonymi, zaburzeniami emocjonalnymi i czynnikami psychicznymi, stresem [2], infekcjami bakteryjnymi, wirusowymi, chorobami układowymi, niedoborami w odżywianiu, alergiami i nietolerancjami lub nadwrażliwościami pokarmowymi [3, 4]. Wielu autorów wskazuje na udział zarówno odpowiedzi immunologicznej wrodzonej, jak i nabytej, humoralnej oraz komórkowej w etiopatogenezie tej jednostki chorobowej (ryc. 1). Afty występują jako ograniczone, płytkie, koliste, owalne nadżerki lub owrzodzenia, pojedyncze lub mnogie o powierzchni nekrotycznej, barwy kremowo-białej, otoczone rąbkiem zapalnym. Wykwit rozwija się na zapalnym rumieniowym i lekko obrzękniętym podłożu, wyraźnie odróżniającym się od pozostałej niezmienionej zapalnie błony śluzowej [6, 15]. Uwzględniając obraz kliniczny afty nawracające dzieli się na: Ryc. 1. Zaburzenia układu odpornościowego u pacjentów z aftami nawracającymi. 388
2008, 61, 6 Afty nawracające a interleukina 2 1) afty małe, Mikulicza (MiRAS), 2) afty duże, Suttona (MaRAS), 3) afty opryszczkopodobne (HeRAS), 4) jednoobjawową postać zespołu Behçeta. O roli zaburzeń immunologicznych dotyczących limfocytów w etiopatogenezie aft nawracających może świadczyć obniżenie odsetka limfocytów T pomocniczych i supresorowych/cytotoksycznych, podwyższenie odsetka komórek z receptorem dla interleukiny 2 i limfocytów B, komórek dziewiczych CD4+ i CD8+ oraz komórek pamięci nie mających markerów CD4. Wzrost liczby komórek posiadających receptor dla IL-2 (komórki z markerem powierzchniowym CD 25) jest związany z pobudzeniem tych komórek [6]. Cel pracy Celem pracy było określenie zależności zachodzących pomiędzy stężeniem IL-2 w ślinie stymulowanej oraz stężeniem tej cytokiny w surowicy krwi obwodowej u osób z aftami i osób zdrowych. Materiał i metody W badaniu uczestniczyło 46 osób, w tym 35 pacjentów z rozpoznanymi aftami nawracającymi i 11 osób zdrowych stanowiących grupę kontrolną. U każdej chorej osoby występowały afty nawracające Mikulicza o ciężkim przebiegu klinicznym, od co najmniej pięciu lat. Zmiany w jamie ustnej obserwowano w każdym przypadku nie rzadziej niż raz na trzy miesiące. Rozpoznanie ustalono na podstawie badania klinicznego przedmiotowego i podmiotowego. Ponadto u wszystkich osób wykonano badania morfologii krwi obwodowej w celu wykluczenia ogólnoustrojowych chorób. U osób z RAS dodatkowo określono poziom glukozy, żelaza i witaminy B 12 w surowicy krwi obwodowej. Wyniki badań mieściły się w granicach przyjętych norm referencyjnych. Żadna z osób objętych obserwacją nie leczyła się w chwili badania i w przeszłości immunoregulacyjnie. Oceny stężenia interleukiny 2 (IL-2) we krwi obwodowej dokonano u 46 osób (35 osób z aftami nawracającymi i 11 osób zdrowych, należących do grupy kontrolnej). Do probówki nie zawierającej środka antykoagulacyjnego pobierano 5 ml krwi obwodowej z żyły łokciowej. Następnie krew podlegała odwirowaniu z prędkością 2000 obr/min. przez 10 min. Uzyskany supernatant był porcjowany do odpowiednio oznakowanych pojemników i zamrażany. Stężenie cytokiny oznaczano metodą immunoenzymatyczną ELISA (ang. enzyme linked immunosorbent assay) z zastosowaniem gotowych zestawów odczynnikowych Opteia Set firmy Pharmingen. Czułość testu wynosiła 7,00 pg/ml. Płytkę z 96 dołkami pomiarowymi spłaszczano mysimi przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko ludzkiej IL-2 rozcieńczonymi 1:200 w buforze węglanowym ph 9,6. Do każdego dołka dodawano po 100 μl roztworu i następnie inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 4 o C. Płytka była następnie płukana 3 razy buforem zawierającym PBS z dodatkiem 0,05% PBS-T. Niezwiązane z przeciwciałami miejsca w dołkach były blokowane roztworem PBS z dodatkiem 10% FBS (płodowej surowicy wołowej) i inkubowane przez godzinę w temperaturze pokojowej. Ponownie płytka była 3-krotnie płukana roztworem PBS-T. Do tak przygotowanych dołków dodawano 100 μl rozmrożonej surowicy oraz po 100 μl roztworu biotynylowanych mysich przeciwciał przeciwko ludzkiej IL-2 stanowiących system wykrywający oraz avidinę sprzężoną z peroksydazą chrzanową jako koniugat. Materiał in- 389
M. Nowak, R. Górska Czas. Stomatol., kubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej, następnie płukano 5-krotnie PBS-T. Na koniec dodawano po 100 μl substratu zawierającego tetrametylobenzadynę i nadtlenek wodoru. Po 30 minutach inkubacji reakcja była blokowana 50 μl 2 N roztworu kwasu siarkowego. Próbę standardową stanowiła rekombinowana ludzka IL-2 o znanym stężeniu, z której przygotowano 8 roztworów w zakresie 3,9-500 pg/ml. Gęstość optyczna poszczególnych prób była mierzona w czytniku ELISA, wyposażonym w automatyczny system przetwarzania danych. Wszystkie przygotowane próbki surowic badano dwukrotnie, w przypadku 10% różnicy w odczytach, badanie powtarzano. Stężenie interleukiny 2 w ślinie stymulowanej oceniono tylko u losowo wybranych 22 osób (11 pacjentów z aftami i 11 osób zdrowych z grupy kontrolnej). Ślina była pobierana do 10 ml pojemnika, rano na czczo, po umyciu zębów i dokładnym wypłukaniu jamy ustnej. Stymulowanie wydzielania śliny, polegało na żuciu parafinowego bloczka o wymiarach około 1 cm x 0,5 cm przez 5 min., po czym pobierano ślinę do pojemników. Następnie ślina podlegała odwirowaniu z prędkością 2000 obr/min. przez 10 min., a uzyskany supernatant był porcjowany do odpowiednio oznakowanych pojemników i zamrażany. Stężenie cytokiny oznaczano metodą immunoenzymatyczną ELISA, w sposób analogiczny jak w przypadku badania surowicy krwi. Wyniki zostały zgrupowane za pomocą arkusza kalkulacyjnego MS Office Excel oraz poddane analizie statystycznej. Ze względu na charakter danych dokonano porównania uzyskanych parametrów w grupach badanych za pomocą nieparametrycznego testu Manna Whitneya, przyjmując za istotną różnicę statystyczną w przypadku, gdy współczynnik istotności statystycznej p osiągał wartości < 0,05. Wyniki Wartości stężenia IL-2 we krwi obwodowej u osób z aftami nawracającymi oraz u osób z grupy kontrolnej zestawiono w tab. 1 i zilustrowano na ryc. 2. Średnie stężenie tej cytokiny było wyższe u chorych (12,19 pg/ml) niż u osób zdrowych (7,16 pg/ml). Różnica była istotna statystycznie (p < 0,05). Średnie stężenie IL-2 w ślinie stymulowanej u osób z aftami wynosiło 9,08 pg/ml oraz 10,18 pg/ml u osób z grupy kontrolnej (tab. 2, ryc. 3). Maksymalna wartość stężenia tej cytokiny wynosiła 20,5 pg/ml u osoby z grupy kontrolnej, minimalna wartość wynosiła 7 pg/ml u jednej osoby chorej i jednej osoby z grupy kontrolnej. Średnie stężenie IL-2 w ślinie stymulowanej osób z aftami było nieistotnie statystycznie (p > 0,05), niższe od stężenia tej cytokiny w ślinie stymulowanej osób zdrowych. Porównanie stężenia IL-2 we krwi obwodowej i ślinie stymulowanej wskazuje na większe średnie stężenie tej cytokiny u chorych z aftami nawracającymi we krwi obwodowej, przy jednoczesnym mniejszym stężeniu w ślinie stymulowanej w porównaniu do grupy kontrolnej. Uzyskana różnica nie jest znamienna statystycznie (ryc. 4). Dyskusja Interleukina 2 (IL-2) jest cytokiną regulującą mechanizmy odpowiedzi immunologicznej. Stymuluje ona proliferację komórek T, B, makrofagów i dużych ziarnistych limfocytów (ang. Large granular lymphocytes). Nasila cytotoksyczność komórek T, NK (ang. Natural killer) i LAK (ang. Lymphokine activated killer). Cytotoksyczność skierowana jest przeciw wirusom i komórkom nowotworowym (działanie przeciwwirusowe i przeciwnowotworo- 390
2008, 61, 6 Afty nawracające a interleukina 2 T a b e l a 1. Stężenie IL-2 w surowicy krwi obwodowej u pacjentów z RAS i w grupie kontrolnej L.p. Chorzy z RAS pg/ml Grupa kontrolna pg/ml 1 7 7 2 7 7,9 3 7 7 4 7 7,9 5 7 7 6 7 7 7 7 7 8 7 7 9 7 7 10 7 7 11 7 7 12 7,1-13 7,2-14 7,3-15 8-16 8-17 8,3-18 8,3-19 8,4-20 8,8-21 12-22 18,7-23 19-24 19-25 19-26 19,7-27 20,1-28 20,7-29 21,8-30 22,1-31 23,5-32 39-33 8,8-34 8-35 7 - Średnia 12,19 7,16 Mediana 8,15 7 Ryc. 2. Porównanie wartości stężenia średniego IL-2 w surowicy krwi obwodowej u pacjentów z RAS i w grupie kontrolnej. we). Interleukina 2 indukuje również uwalnianie cytokin prozapalnych (IL-1, IL-6, TNF-α) oraz innych cytokin, jak również IL-3, IL-4, IL-5, TNF-γ. Aktywacja komórek docelowych zachodzi poprzez połączenie się IL-2 ze swoistymi receptorami obecnymi na ich powierzchni [9, 16]. Wcześniejsze badania wskazują na udział zaburzeń układu odpornościowego w etiopatogenezie aft nawracających. Przemawiają za tym uzyskane wyniki dotyczące odwrócenia stosunku komórek CD4+/ CD8+, zwiększenie odsetka komórek CD3+, CD4+, CD25+, jak również zwiększenie stężenia IL-2 w surowicy krwi obwodowej [6, 20]. Inne badania wykazały zwiększenie odsetka komórek CD4+ u chorych z aftami w fazie remisji w porównaniu do fazy aktywnej choroby, z wykwitami w jamie ustnej. Jednocześnie wykazano zwiększenie stężenia IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-5, IL-6 i IL-8 w surowicy krwi osób z aftami nawracającymi w porównaniu do osób zdrowych [12]. Można przypuszczać, że u chorych z RAS aktywacja układu immunologicznego i zwiększenie stężenia IL-2 w surowicy krwi obwodowej jest stymulowana czynnikiem, w chwili obecnej, niepoznanym. Może to być nadwrażliwość pokarmowa, infekcja bakteryjna, 391
M. Nowak, R. Górska Czas. Stomatol., T a b e l a 2. Stężenie IL-2 w ślinie stymulowanej u pacjentów z RAS i w grupie kontrolnej L.p. Chorzy z RAS pg/ml Grupa kontrolna pg/ml 1 10,70 10,90 2 7,50 20,50 3 9,00 8,70 4 12,00 8,20 5 8,00 9,00 6 7,50 7,00 7 11,00 8,90 8 7,80 7,80 9 10,90 9,00 10 7,00 9,00 11 8,50 13,00 Średnia 9,08 10,18 Mediana 8,50 9,00 Ryc. 3. Porównanie wartości stężenia średniego IL-2 w ślinie stymulowanej u pacjentów z RAS i w grupie kontrolnej. wirusowa lub reakcja autoimmunologiczna. Za tą hipotezą przemawiają próby skutecznego leczenia aft nawracających preparatami immunomodulującymi [8, 17]. Po wdrożeniu terapii immunoregulacyjnej i uzyskaniu normalizacji parametrów immunologicznych, wykwity nie pojawiają się lub mają łagodniejszy przebieg. Z upływem czasu jednak u pewnej grupy osób dochodzi do ponownych zaburzeń immunologicznych wznowy wykwitów aftowych w jamie ustnej. Badania komórek krążących we krwi obwodowej mogą niedokładnie odzwierciedlać zjawiska zachodzące miejscowo. Celowym wydaje się porównanie posiadanych wyników z wynikami uzyskanymi w miejscu zachodzenia reakcji immunologicznej (in situ), co wymaga dalszych badań. Ocena i analiza komponentów odpowiedzi immunologicznej zawartych w płynach ustrojowych, takich jak krew obwodowa oraz mocz, obecnie nie nastręcza problemów, niemniej jednak analiza płynów biologicznych, tj.: łzy, Ryc. 4. Porównanie stężeń interleukiny 2 w surowicy krwi obwodowej i ślinie stymulowanej. wydzielina szyjki macicy i pochwy oraz ślina nie jest łatwa. Trudności skupiają się nie na samym określeniu poszczególnych parametrów odpowiedzi immunologicznej w materiale analitycznym, lecz na uzyskaniu powtarzalnych i niezafałszowanych wyników. Sposób i dokładność pobierania materiału badawczego, jak również możliwość występowania współtowarzyszących infekcji lub oddziaływania miejscowo stosowanych leków mogą mieć znaczący wpływ na ostateczny wynik, jak i wartości poszczególnie określanych parametrów. Z punktu widzenia chorego ślina jest 392
2008, 61, 6 Afty nawracające a interleukina 2 idealnym materiałem diagnostycznym, gdyż jej pobranie nie jest związane z koniecznością wykonania zabiegu ofensywnego. Analizę śliny z oceną stężenia cytokin, a co za tym idzie określania poziomu odpowiedzi immunologicznej, z powodzeniem wykonuje się w diagnozowaniu infekcji wirusem HIV, zespołu Sjögrena oraz badań nad wpływem zanieczyszczenia powietrza na układ odpornościowy u dzieci [23]. Badania określające stężenie IL-2 w ślinie prowadzone wśród chorych z wirusem HIV-1 wykazały istotny wzrost poziomu tej cytokiny w porównaniu z grupą kontrolną [8]. Ślina była wykorzystywana również jako materiał badawczy u chorych z aftami nawracającymi. Z powodzeniem określano w niej stężenia enzymów i witamin przeciwutleniających [1, 10]. Biorąc pod uwagę te spostrzeżenia spodziewano się wzrostu stężenia IL-2 także w ślinie stymulowanej osób z aftami, co jednak nie uległo potwierdzeniu. Podsumowanie Wykonane badanie stężenia IL-2 w ślinie stymulowanej u chorych z aftami nie wykazało statystycznej różnicy stężenia tej cytokiny w porównaniu do grupy kontrolnej. Zwiększenie stężenia IL-2 w surowicy krwi obwodowej przy jednoczesnym braku różnic w jej stężeniu w ślinie stymulowanej może sugerować wytwarzanie tej cytokiny przez limfocyty T. Piśmiennictwo 1. Albanidou-Farmaki E, Poulopoulos A, Epivatianos A, Farmakis K, Karamouzis M, Antoniades D: Assessment of salivary and serum antioxidant vitamins and lipid peroxidation in patients with recurrent aphthous ulceration. Tohocu J Exp Med 2005, 206, 4: 305-312. 2. Chiappelli F, Alwan J, Prolo P, Christensen R, Fiala M, Cajulis O, Bernard G: Neuroimmunity in stress-related oral ulcerations: a fractal analysis. Front Biosci 2005, 10: 3034-3041. 3. Eglin R, Lehner T, Subak-Sharpe J: Detection of RNA complementary to herpes-simplex virus in mononuclear cells from patients with Behcet s syndrome and recurrent oral ulcers. Lancet 1982, 18, 2: 1356-1361. 4. Elsheikh M, Mahfouz M: Prevalence of Helicobacter pylori DNA in recurrent aphthous ulcerations in mucosa-associated lymphoid tissues of the pharynx. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2005, 131, 9: 804-808. 5. Górska R: Badania epidemiologiczne zmian na błonie śluzowej jamy ustnej u dzieci, młodzieży i dorosłych w wieku od 13 do 21 lat w Warszawie. Przegl Epidemiol 1997, 1: 328- -331. 6. Górska R: Badania epidemiologiczne i zaburzenia dotyczące limfocytów u chorych z aftami nawracającymi. Dział Wydawnictw AM w Warszawie. Warszawa 1997, str. 13-38. 7. Hasan A, Shinnick T, Mizushima Y, Zee R van der, Lehner T: Defining a T-cell epitope within HSP 65 in recurrent aphthous stomatitis. Clin Exp Immunol 2002, 128, 2: 318-325. 8. Jacobson J, Greenspan J, Spritzler J, Ketter N, Fahey J, Jackson J, Fox L, Chernoff M, Wu A, MacPhail L, Vasquez G, Wohl D: Thalidomide for the treatment of oral aphthous ulcers in patients with human immunodeficiency virus infection. National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Clinical Trials Group. N Engl J Med 1997, 336, 21: 1487-1493. 9. Jakóbisiak M, Gołąb J, Lasek W: Immunologia. Wyd II. PWN, Warszawa 1997, str. 54-78. 10. Karincaoglu Y, Batcioglu K, Erdem T, Esrefoglu M, Genc M: The levels of plasma and salivary antioxidants in the patient with recurrent aphthous stomatitis. J Oral Pathol Med 2005, 34, 1: 7-12. 11. Kleinman D, Swango D, Pindborg J: Epidemiology of oral mucosol lesions in US 393
M. Nowak, R. Górska Czas. Stomatol., schoolchildren 1986-87. Community Dent Oral Epidemiol 1994, 22, 4: 243-253. 12. Lewkowicz N, Lewkowicz P, Banasik M, Kurnatowska A, Tchórzewski H: Predominance of Type 1 cytokines and decreased number of CD4(+)CD25(+high) T regulatory cells in peripheral blood of patients with recurrent aphthous ulcerations. Immunol Lett 2005, 99, 1: 57-62. 13. Natah S, Häyrinen-Immonen R, Hietanen J, Malmström M, Konttinen Y: Quantitative assessment of mast cells in recurrent aphthous ulcers (RAU). J Oral Pathol Med 1998, 27, 3: 124-129. 14. Porter S, Scully C, Pedersen A: Recurrent aphthous stomatitis. Crit Rev Oral Biol Med 1998, 9: 306-321. 15. Rogers R: Recurrent aphthous stomatitis: clinical characteristics and associated systemic disorders. Semin Cutan Med Surg 1997, 16: 278-283. 16. Roitt I, Brostoff J, Male D: Immunology. 6 th. Edition. David Male Mosby Edinburgh, 2001, str. 78-94. 17. Sarmadi M, Ship J A: Refractory major aphthous stomatitis managed with systemic immunosuppressants: a case report. Quintessence Int 2004, 35: 39-48. 18. Ship J, Chavez E, Doerr P, Henson B S, Sarmadi H: Recurrent aphthous stomatitis. Quintessence Int 2000, 31, 2: 95-112. 19. Shohat-Zabarski R, Kalderon S, Klein T, Weinberger A: Close Association of HLA - B 51 in persons with recurrent aphthous stomatitis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1992, 74, 4: 455-458. 20. Sun A, Chu C, Liu B, Wang J, Leu J, Chiang P: Expression of interleukin-2 receptor by activated peripheral blood lymphocytes upregulated by the plasma level of interleukin-2 in patients with recurrent aphthous ulcers. Proc Natl Sci Counc Repub China B 2000, 24, 3: 116-122. 21. Sun A, Chu C, Wu Y, Yuan J: Mechanisms of depressed natural killer cell activity in recurrent aphthous ulcers. Clin Immunol Immunopathol 1991, 60, 1: 83-92. 22. Ueta E, Umazume M, Yamamoto T, Osaki T: Leukocyte dysfunction in oral mucous membrane diseases. J Oral Pathol Med 1993, 22: 120-125. 23. Winkler O, Hadnagy W, Idel H: Cytokines detectable in saliva of children as appropriate markers of local immunity of the oral cavity an approach for the use in air polution solution. Int J Hyg Environ Health 2001, 204, 2-3: 181-184. Otrzymano: dnia 27.III.2008 r. Adres autorów: 00-246 Warszawa, ul. Miodowa 18 Tel.: 022 5022036 e-mail: sluzowski@am.edu.pl 394