WYSTĘPOWANIE W JEDNYM Z WARSZAWSKICH SZPITALI PAŁECZEK KLEBSIELLA PNEUMONIAE WYTWARZAJĄCYCH KARBAPENEMAZĘ TYPU KPC **

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 9-20 Katarzyna Piekarska 1, Katarzyna Zacharczuk 1, Jolanta Szych 1, Elwira Zawidzka 2, Elżbieta Wilk 2, Sebastian Wardak 2, Marek Jagielski 1, Rafał Gierczyński 1* WYSTĘPOWANIE W JEDNYM Z WARSZAWSKICH SZPITALI PAŁECZEK KLEBSIELLA PNEUMONIAE WYTWARZAJĄCYCH KARBAPENEMAZĘ TYPU KPC ** 1 Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski 2 Niepubliczny Zakład Opieki Zdrowotnej, Laboratoria Analiz Lekarskich ALAB. Kierownik: mgr E. Wilk Określono profile lekowrażliwości oraz podobieństwo profili XbaI-PFGE jedenastu szczepów K. pneumoniae wykazujących oporność na ertapenem. Szczepy te wyizolowano od dziesięciu pacjentów jednego z warszawskich szpitali i jednego pacjenta hospicyjnego. Analiza fenotypowa (test z kwasem boronowym) i genetyczna (PCR) badanych szczepów wykazała, że wytwarzają one karbapenemazę typu KPC. Wśród badanych szczepów wyróżniono 7 genotypów PFGE, przy czym 5 szczepów zaliczono do tego samego genotypu, co może wskazywać na ich epidemiczne szerzenie się w szpitalu. Pozostałe 6 szczepów należało do różnych genotypów. Dendrogram genetycznego podobieństwa badanych szczepów składał się z dwóch gałęzi obejmujących 2 i 9 szczepów, o podobieństwie wynoszącym odpowiednio 86,5% i 93,2%. Genetyczne zróżnicowanie badanych szczepów na dwie wyraźnie odrębne grupy może wynikać z horyzontalnego i wertykalnego transferu genu bla KPC u pałeczek K. pneumoniae występujących u pacjentów szpitala. W okresie ostatnich pięciu lat w USA obserwowano zjawisko intensywnego narastania oporności pałeczek Enterobacteriaceae na antybiotyki z grupy karbapenemów, które stosowano powszechnie w terapii zakażeń wywołanych przez szczepy wytwarzające ESBL (12, 17). Zjawisko to, dotyczące głównie pałeczek Klebsiella pneumoniae, obserwowane jest obecnie również w Europie (1, 16, 18). Jest ono następstwem pojawienia się grupy β- laktamaz, które w wyniku zmian strukturalnych prowadzących do poszerzenia spektrum substratowego uzyskały zdolność hydrolizy pierścienia β-laktamowego w cząsteczkach * autor do którego należy kierować korespondencję ** badania współfinansowane ze środków na naukę w latach 2008-2009 w ramach projektu badawczego NN 404 165034

10 K. Piekarska i inni Nr 1 karbapenemów. Z tego powodu β-laktamazy zdolne do rozkładania karbapenemów określane są powszechnie mianem karbapenemaz. Do tej grupy enzymów należą zarówno metalo β laktamazy (IMP i VIM), oksacylinazy o szerokim spektrum substratowym (OXA-48), jak też β-laktamazy zaliczane do klasy A schematu klasyfikacji według Ambler (NMCA, IMI, SME, GES i KPC) (17). Karbapenemazę KPC, występującą pierwotnie u pałeczek K. pneumoniae i z tego względu zwaną Klebsiella pneumoniae carbapenemase, opisano po raz pierwszy w 2001 roku (23). Ze względu na strukturę molekularną i obecność seryny KPC jest zaliczana do klasy A β-laktamaz, zaś w schemacie klasyfikacji funkcjonalnej przypisano ją do klasy f2 (17). Karbapenemazy z rodziny KPC są zdolne do hydrolizy szeregu antybiotyków β-laktamowych. Wydajnie rozkładają cefalosporyny I i II generacji oraz penicyliny, włącznie z piperacyliną, a także mogą hydrolizować cefotaksym, meropenem, imipenem i aztreonam, lecz ze znacznie niższą efektywnością (17). Wytwarzanie karbapenemazy typu KPC warunkuje gen bla KPC. Sekwencja nukleotydów tego genu jest wysoce stabilizowana przez dobór naturalny (konserwatywna). Dotychczas opisano tylko kilka haplotypów tego genu, kodujących warianty KPC różniące się pojedynczymi aminokwasami. Obecnie wyróżnia się warianty KPC oznaczone numerami od 2 do 5, przy czym najczęściej spotykane są warianty: KPC-2 i KPC-3 (17, 22). U większości szczepów wytwarzających KPC gen z rodziny bla KPC zlokalizowany jest w transpozonie TN4401, wbudowanym w koniugacyjny plazmid o wielkości około 60 kpz (12). Lokalizacja genu bla KPC w tak wysoce mobilnym, genetycznym środowisku (11) przyczynia się do efektywnego, horyzontalnego zarówno wewnątrz jak i między gatunkowego (19) szerzenia się zdolności wytwarzania KPC wśród pałeczek Enterobacteriaceae. Proces ten zachodzi głównie w środowisku szpitalnym, u osób poddawanych długotrwałej terapii z użyciem różnych grup antybiotyków β-laktamowych (17). Badania epidemiologiczne prowadzone z wykorzystaniem takich technik genotypowania jak elektroforeza fragmentów restrykcyjnych chromosomalnego DNA w zmiennym polu elektrycznym (PFGE) i analiza sekwencji nukleotydów wybranych genów metabolizmu podstawowego (MLST) wykazały, że szczepy K. pneumoniae, które uzyskały zdolność wytwarzania KPC, szybko rozprzestrzeniają się wśród pacjentów tego samego szpitala jak i między różnymi szpitalami, także zlokalizowanymi w różnych krajach (16, 17, 18). Wśród pałeczek K. pneumoniae wytwarzających KPC-2 w USA i w innych krajach dominuje szczep reprezentujący genotyp MLST 258. Wytwarzający KPC-2 szczep K. pneumoniae należący do genotypu 258 wyizolowano również w Polsce (1). Także wyniki analiz podobieństwa profili XbaI-PFGE pałeczek K. pneumoniae wytwarzających KPC-2 wskazują na klonalny charakter szczepów tych pałeczek wyosobnianych w różnych krajach oraz potwierdzają ich szybkie szerzenie się wśród hospitalizowanych pacjentów (16). Ze względu na szybkie wertykalne i horyzontalne szerzenie się zdolności wytwarzania karbapenemaz typu KPC wśród pałeczek Enterobacteriaceae, a także zdolność kumulowania mechanizmów warunkujących lekooporność na różne grupy antybiotyków przez szpitalne szczepy pałeczek K. pneumoniae (4), szybka i skuteczna identyfikacja szczepów wytwarzających KPC oraz monitorowanie ich występowania u pacjentów, personelu oraz w środowisku szpitala jest kluczowa dla bezpieczeństwa pacjentów i obniżenia kosztów leczenia. Skuteczne ograniczenie szerzenia się tych drobnoustrojów w szpitalach wymaga zaostrzenia reżimu sanitarnego, przeprowadzania bakteriologicznych badań pacjentów

Nr 1 K. pneumoniae wytwarzające karbapenemazy typu KPC 11 przyjmowanych na oddziały i prowadzenia regularnych badań przeglądowych celem identyfikacji i izolacji osób skolonizowanych, bądź zakażonych pałeczkami K. pneumoniae wytwarzającymi KPC (3, 13). W prezentowanej pracy przedstawiono charakterystykę szczepów pałeczek K. pneumoniae wytwarzających karbapenemazę KPC wyizolowanych, w ramach rutynowo prowadzonej diagnostyki bakteriologicznej u pacjentów leczonych w jednym z warszawskich szpitali. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne. W badaniach posłużono się jedenastoma szczepami K. pneumoniae, które zostały wyizolowane z materiału klinicznego od 11 pacjentów, z których 10 leczonych było w jednym z warszawskich szpitali klinicznych, a jeden przebywał w hospicjum. Pacjent ten był w 2009 roku leczony w różnych placówkach medycznych na terenie Warszawy. Szczegółowe informacje o pochodzeniu badanych szczepów przedstawiono w tabeli I. Przy użyciu diagnostycznych systemów komercyjnych (API 10S i Vitek-2) zostały one zidentyfikowane jako pałeczki K. pneumoniae wykazujące oporność na ertapenem, co stanowiło podstawę podejrzenia, że szczepy te mogą wytwarzać karbapenemazę typu KPC. Wszystkie badane szczepy poddano reidentyfikacji w Zakładzie Bakteriologii NIZP-PZH przy użyciu klasycznych testów biochemicznych. Tabela I. Charakterystyka badanych szczepów K. pneumoniae Numer Wiek Oddział / Data pobrania Oporność na Pacjent Płeć Materiał szczepu (lata) placówka próbki karbapenemy a DM0259 SP 20 M hospicjum b b.d 18.08.2009 ETP DM0260 SF 73 M interna b.d 22.08.2009 ETP DM0261 ŁJ 79 K interna b.d 20.08.2009 MEM, IMP,ETP DM0262 BE 77 M interna mocz 02.11.2009 MEM, IMP DM0263 JH 87 K interna mocz 04.11.2009 MEM, IMP DM0265 KK 74 M urologia mocz 18.09.2009 MEM, IMP DM0266 BJ 58 K interna mocz 17.09.2009 ETP DM0267 CJ 52 M urologia mocz 25.09.2009 ETP DM0268 KI 70 K interna mocz 26.09.2009 MEM, IMP DM0269 RW 47 M urologia mocz 16.09.2009 MEM, IMP DM0270 WL 54 M urologia mocz 16.12.2009 MEM, IMP a określono w badaniu diagnostycznym, b pacjent leczony w różnych placówkach opieki medycznej na terenie Warszawy b.d.- brak danych IMP imipenem; MEM meropenem; ETP ertapenem; M mężczyzna, K - kobieta Profile lekowrażliwości. Lekowrażliwość badanych szczepów na wybrane antybiotyki i chemioterapeutyki (Tabela II) określono metodą dyfuzyjno-krążkową w Zakładzie Bakteriologii NIZP-PZH.

12 K. Piekarska i inni Nr 1 Tabela II. Profile lekowrażliwości i genotypy PFGE badanych szczepów K. pneumoniae Szczep Genotyp PFGE Antybiotyk lub chemioterapeutyk Profil b a AM AMC CAZ CTX IMP MEM ETP ATM GM AN STR D CIP SXT CL DM0259 D 1 R R I I S S R R S R R I R R S DM0260 F 2 R R R R S S R R I I I I R R S DM0261 G 3 R R R R R R R R R S I R R R S DM0262 A 4 R R R R R R R R S S I S R R S DM0263 A 4 R R R R R R R R S S I S R R S DM0265 B 5 R R R R R R R R R R R S R R S DM0266 C 5 R R R R R R R R R R R S R R S DM0267 A 6 R R R R R R R R I I I S R R S DM0268 A 4 R R R R R R R R S S I S R R S DM0269 E 5 R R R R R R R R R R R S R R S DM0270 A 5 R R R R R R R R R R R S R R S a profil lekowrażliwości b - AM ampicilina; AMC - amoksycylina z kw. klawulanowym; CAZ - ceftazydym; CTX - cefotaksym; IMP imipenem; MEM meropenem; ETP ertapenem; ATM aztreonam; GM gentamycyna; AN amikacyna; STR streptomycyna; D doksycyklina; CIP ciprofloksacyna; STX trimetoprim-sulfometoksazol; CL kolistyna, R oporny, I - średnio-wrażliwy, S wrażliwy

Nr 1 K. pneumoniae wytwarzające karbapenemazy typu KPC 13 Zawiesiny badanych szczepów o gęstości 0,5 w skali McFarland a posiewano na podłoże Mueller-Hinton (Oxoid) i nakładano krążki zawierające: ampicilinę (10 μg); amoksycylinę (20 μg) z kw. klawulanowym (10 μg); ceftazydym (30 μg); cefotaksym (30 μg); imipenem (10 μg); meropenem (10 μg); ertapenem (10 μg); aztreonam (30 μg); gentamycynę (10 μg); amikacynę (30 μg); streptomycynę (10 μg); doksycyklinę (30 μg); ciprofloksacynę (5 μg); trimetoprim (1,25 μg) z sulfometoksazolem (23,75 μg) i kolistynę (50 μg) firmy Oxoid. Stosowano szczepy kontrolne E.coli ATCC 25922 i ATCC 35218. Interpretację wyników przeprowadzano zgodnie z zaleceniami CLSI (5). Test fenotypowy na wytwarzanie KPC. W badaniach do wykrywania aktywności karbapenemazy KPC posłużono się testem dyfuzyjnym z kwasem boronowym. Test przeprowadzono zgodnie z metodyką opisaną przez Doi i wsp. (8) wykorzystując krążki z meropenemem (10 μg) firmy Oxoid z tym, że jako źródło kwasu boronowego użyto preparatu phenylboronic acid (PBA) firmy Sigma-Aldrich (20). Zawiesiny komórek badanych szczepów o gęstości 0,5 w skali McFarland a posiewano na podłoże Mueller-Hinton (Oxoid) i nakładano dwa krążki (w odległości 4-5 cm) zawierające meropenem (10 μg) firmy Oxoid. Na jeden z krążków nanoszono 6 μl roztworu PBA o stężeniu 50 mg/ml (300 μg PBA na krążek). Roztwór kwasu boronowego przygotowywano dwuetapowo, rozpuszczając 52,5 mg PBA (95% substancji czynnej) w 0,5 ml DMSO (Applichem, Niemcy), a następnie stężenie aktywnego PBA doprowadzono do 50 mg/ml dodając 0,5 ml wody dejonizowanej. Za wynik dodatni (wytwarzanie KPC) przyjmowano różnicę średnic stref zahamowania wzrostu wokół krążków z meropenemem oraz meropenemem z dodatkiem kwasu boronowego wynoszącą przynajmniej 5 mm (8). Wynik uznawano za prawidłowy jedynie, gdy średnica strefy zahamowania wzrostu była większa wokół krążka z dodatkiem PBA. Badanie metodą PCR. Do wykrywania obecności genu bla KPC zastosowano technikę łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Posłużono się opracowanymi we własnym zakresie starterami KPC372F (CTGTGCAGCTCATTCAAGGG) i KPC372R (TTGTAAGCTTTC- CGTCACGG) komplementarnymi do wysoce konserwatywnych fragmentów genu bla KPC-2. Startery zaprojektowano wykorzystując referencyjne sekwencje nukleotydowe haplotypów genu bla KPC zebrane przez Lahey Institute (http://www.lahey.org/studies/other.asp#table1). Izolację matrycowego DNA i PCR przeprowadzono stosując postępowanie opisane uprzednio (9) z tym, że użyto preparatu polimerazy DNA PAQ5000 firmy Stratgene, w ilości 0,75 jednostki na reakcję, wraz z buforem reakcyjnym dostarczonym przez producenta, a objętość mieszaniny reakcyjnej zredukowano do 25 μl. Określenie haplotypu genu bla KPC. Typ genu bla KPC określono przeprowadzając analizę sekwencji nukleotydów. Analizie poddano obie nici amplifikatu PCR uzyskanego z opracowanymi we własnym zakresie starterami KPC895F (TTGATGTCACTG- TATCGCCG) i KPC895R (TTTCAGAGCCTTACTGCCCG) i preparatem genomowego DNA szczepu DM0269 według metodyki przedstawionej uprzednio (10). Do analizy sekwencji nukleotydów wykorzystano programy FichTV (Geospiza, USA) i CLC Sequence Viewer V6.1. (CLC, Dania). PFGE. Analizę polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych chromosomalnego DNA przeprowadzono przy użyciu endonukleazy XbaI (Eurx, Polska) i aparatu CHEF DR II (BioRad, USA) według metodyki szczegółowo opisanej uprzednio (24) z tym, że czas pulsu wynosił od 3 do 33 sekund. Podobieństwo profili XbaI-PFGE określono przy użyciu programu GelCompar II (Applied Maths, Belgia), stosując współczynnik podobieństwa Dice a.

14 K. Piekarska i inni Nr 1 Dendrogram ilustrujący podobieństwo badanych szczepów utworzono metodą klasteryzacji UPGMA stosując wartość parametrów tolerancji i optymalizacji wynoszącą 1,20. WYNIKI Wyniki wykonanych testów biochemicznych potwierdziły przynależność wszystkich badanych szczepów do gatunku K. pneumoniae. Profile ich lekowrażliwości przedstawiono w tabeli II. Wszystkie szczepy były oporne na ertapenem a w teście z kwasem boronowym (Ryc. 1) wykazały fenotyp KPC+ i z wyjątkiem dwóch szczepów (DM0259 i DM0260) były również oporne na imipenem i meropenem. Ponadto szczepy te były oporne na amoksycylinę z kwasem klawulanowym, aztreonam, ciprofloksacynę i sulfonamidy oraz z wyjątkiem jednego szczepu (DM0259) były także oporne na ceftazydym i cefotaksym. Spośród użytych antybiotyków jedynie kolistyna okazała się być antybiotykiem, na który wszystkie badane szczepy były wrażliwe. Ryc. 1. Przykładowy, pozytywny wynik testu fenotypowego wskazujący na zdolność wytwarzania karbapenemazy typu KPC przez badany szczep pałeczek K. pneumoniae. A krążek z meropenemem (10 μg) na który naniesiono kwas boronowy (PBA 300 μg). B - krążek z meropenemem (10 μg). Wynik testu PCR na obecność rdzeniowego fragmentu genu bla KPC przedstawiono na rycinie 2. Z preparatami genomowego DNA wszystkich badanych szczepów i starterami KPC372F i KPC372R uzyskano produkt PCR o długości zbliżonej do oczekiwanej wartości teoretycznej (372 pz), co świadczyło o obecności genu bla KPC. Analiza sekwencji nukleoty- Ryc. 2. Wynik testu PCR na obecność genu bla KPC u badanych szczepów pałeczek K. pneumoniae, dla których uzyskano wynik testu fenotypowego wskazujący na zdolność wytwarzania KPC. M wzorzec wielkości DNA (GeneRuler 100 bp; Fermentas, Litwa), wielkość DNA przedstawiono w parach zasad (pz). Linie 1-11 badane szczepy w kolejności rosnącej od DM0259 do DM0270. N kontrola negatywna.

Nr 1 K. pneumoniae wytwarzające karbapenemazy typu KPC 15 dów genu bla KPC występującego w szczepie DM0269, którego DNA amplifikowano przy użyciu starterów KPC895F i KPC895R wykazała, że szczep ten posiadał haplotyp bla KPC-2 związany z wytwarzaniem wariantu KPC-2. Ryc. 3. Profile PFGE badanych szczepów K. pneumoniae wytwarzających KPC uzyskane w wyniku trawienia genomowego DNA endonukleazą XbaI. Poniżej linii poziomej umieszczono numery ścieżek elektroforetycznych, a powyżej literami od A do G oznaczono genotypy PFGE odpowiadające poszczególnym profilom. M wzorzec wielkości DNA (PFGEladder, NewEngland Biolabs, USA). Wielkość DNA wyrażono w tysiącach par zasad (kpz). Ścieżki od 1 do 11 przedstawiają kolejno profile XbaI-PFGE szczepów: DM0269; DM0259; DM0260; DM0261; DM0262; DM0263; DM0270; DM0265; DM0266; DM0267; DM0268. Profile XbaI-PFGE jedenastu szczepów K. pneumoniae wytwarzających KPC przedstawiono na rycinie 3. Wśród badanych szczepów wyróżniono 7 genotypów PFGE, przy czym 5 szczepów zaliczono do tego samego genotypu. Pozostałe 6 szczepów należało do różnych genotypów o podobieństwie profili PFGE wynoszącym od 82,3 % do 96,7%. Dendrogram genetycznego podobieństwa badanych szczepów (Ryc. 4) składał się z dwóch gałęzi (A i B) obejmujących szczepy o podobieństwie wynoszącym 82,3%. Obejmowały one 2 szczepy o podobieństwie 86,5% (gałąź B) i 9 szczepów, których zakres podobieństwa wynosił od 93, 2% do 100,0 % (gałąź A).

16 K. Piekarska i inni Nr 1 Ryc. 4. Dendrogram podobieństwa profili XbaI-PFGE badanych szczepów K. pneumoniae wytwarzających KPC opracowany przy użyciu programu GelCompar II (Dice, UPGMA, 1,2% optymalizacji i tolerancji). DYSKUSJA Występowanie zdolności do wytwarzania KPC wśród pałeczek Enterobacteriaceae w Polsce jest obserwowane stosunkowo od niedawna, a pierwsze doniesienie na ten temat opublikowano w 2009 roku (1). W prezentowanej pracy badaniom poddano szczepy pałeczek K. pneumoniae wyosobnione w ciągu ostatnich 5 miesięcy 2009 roku. Szczepy te wyosobniono od ludzi z materiału klinicznego, głównie z moczu od osób, u których ze względu na podeszły wiek (średnia 67 lat), lub współwystępowanie innych schorzeń, mogło dochodzić do upośledzenia odporności. Uważa się, że oporność pałeczek Enterobacteriaceae na ertapenem może wskazywać na ich zdolność do wytwarzania karbapenemazy KPC. Jednakże wytwarzanie KPC nie zawsze powoduje ujawnianie się in vitro oporności na imipenem i meropenem, gdyż karbapenemaza ta wykazuje ograniczoną wydajność hydrolizy pierścienia β-laktamowego w cząsteczkach karbapenemów (17). Z tego względu nie można wykluczyć zdolności wytwarzania KPC przez szczepy DM0259 i DM0260, u których w metodzie dyfuzyjno-krążkowej stwierdzono oporność na ertapenem oraz wrażliwość na imipenem i meropenem. Ta pozorna sprzeczność w dużej mierze wynika z ogólnie przyjętych kryteriów interpretacji rozmiaru stref zahamowania wzrostu (17). Oporność pozostałych badanych szczepów na imipenem i meropenem może natomiast być wynikiem działania czynników obniżających przepuszczalność błony zewnętrznej (14) oraz wytwarzaniem innych β-laktamaz i ich synergistycznego działania z KPC (21). Przypuszczenie to może potwierdzać stwierdzona u badanych szczepów oporność na cefalosporyny III generacji (cefotaksym i ceftazydym) oraz fakt, że wytwarzanie kilku różnych β-laktamaz, w tym ESBL, przez pałeczki K. pneumoniae izolowane w Polsce z materiału klinicznego od ludzi nie należy do rzadkości (7). Zróżnicowanie uzyskanych wyników oznaczania lekowrażliwości badanych szczepów K. pneumoniae doskonale ilustruje trudności jakie można napotkać przy próbach identyfikacji szczepów wytwarzających KPC jedynie poprzez ocenę profili oporności określonych metodą dyfuzyjno-krążkową. Dlatego wiarygodna, fenotypowa identyfikacja szczepów produkujących karbapenemazy wymaga zastosowania dodatkowych, bardziej specyficznych testów. Do niedawna, za re-

Nr 1 K. pneumoniae wytwarzające karbapenemazy typu KPC 17 ferencyjny w identyfikacji KPC uznawano zmodyfikowany test Hodge a (2), lecz obecnie bardziej specyficzny i mniej pracochłonny wydaje się być test z kwasem boronowym (8) i jego modyfikacje (15). Co więcej, stosowanie kwasu boronowego może też być pomocne w identyfikacji β-laktamaz typu ESBL u szczepów wytwarzających KPC (21). Z uwagi na te zalety, w prezentowanej pracy do wykrywania szczepów wytwarzających KPC posłużono się testem z kwasem boronowym (PBA) opisanym przez Doi i współpracowników (8). Zaletą tego testu jest jego niewielka, w porównaniu do testu Hodge a, pracochłonność i łatwość interpretacji wyniku, będące cechami pożądanymi w rutynowo prowadzonej diagnostyce bakteriologicznej (20). Mając na uwadze wspomniane wyżej zalety, pozytywne wyniki testu fenotypowego z kwasem boronowym uzyskane w prezentowanych badaniach można uznać za wskazujące na zdolność wytwarzania KPC przez wszystkie badane szczepy. W przypadku wykrycia fenotypu KPC+ zdolność wytwarzania karbapenemazy przez badany szczep można także potwierdzić poprzez wykrycie obecności genu bla KPC, związanego z wytwarzaniem KPC. Ponieważ rodzina genów bla KPC charakteryzuje się wysokim stopniem konserwatywności sekwencji nukleotydów (22) możliwe jest opracowanie swoistych, uniwersalnych starterów PCR pozwalających na wykrywanie obecności różnych haplotypów tego genu w pojedynczym badaniu (6). W prezentowanych badaniach do wykrywania genu bla KPC wykorzystano startery PCR opracowane we własnym zakresie, pozwalające na amplifikację środkowego fragmentu genu bla KPC o długości 372 pz. Produkt PCR o zbliżonej długości wykryto u wszystkich badanych szczepów, a swoistość uzyskanego amplifikatu potwierdzono metodą sekwencjonowania DNA, co pozwoliło wykazać, że badane szczepy mogą wytwarzać karbapenemazę typu KPC. W Europie najczęściej wykrywane były dotychczas pałeczki K. pneumoniae wytwarzające wariant 2 i 3 KPC. Warianty te różnią się nieznacznie sekwencją aminokwasów i zakresem spektrum preferencji substratowych (17, 22). Aby określić typ wariantu KPC wytwarzanego przez badane szczepy K. pneumoniae przeprowadzono analizę sekwencji nukleotydów genu bla KPC szczepu DM0269. Analizie poddano amplifikat PCR o długości 895 pz, określając sekwencję 811 nukleotydów dla każdej z obu nici DNA. Sekwencja consensus 811 nukleotydów badanego szczepu okazała się identyczna z sekwencją homologicznego odcinka genu bla KPC-2 (GenBank: AY034847) i świadczyła o wytwarzaniu przez badany szczep wariantu 2 karbapenemazy KPC (KPC-2). Z tego względu prezentowana praca jest drugim z kolei doniesieniem o występowaniu pałeczek K. pneumoniae wytwarzających KPC-2 w Polsce (1). W sytuacji, gdy na terenie szpitala dochodzi do wzrostu częstości izolacji szczepów wytwarzających KPC wskazane jest niezwłoczne wprowadzenie badań mających na celu identyfikację osób zakażonych i ewentualnych nosicieli tych drobnoustrojów, celem ich odosobnienia (3, 13). Wyizolowane od tych osób szczepy należy poddać typowaniu w celu ustalenia, czy reprezentują one klon, czy też doszło do horyzontalnego przenoszenia się mechanizmu warunkującego wytwarzanie KPC (11). W prezentowanych badaniach genetyczne podobieństwo szczepów określono porównując profile XbaI-PFGE. Metoda PFGE uznawana jest za standard w genotypowaniu tych drobnoustrojów dla potrzeb dochodzeń epidemiologicznych i była stosowana przez autorów wielu prac dotyczących zagadnienia szerzenia się zakażeń wywoływanych przez pałeczki Enterobactericeae wytwarzające KPC (11, 12, 16). Uzyskane w przedstawianych badaniach wyniki genotypowania XbaI-PFGE wskazują na epidemiczne szerzenie się pałeczek K. pneumoniae KPC+ należących do tego samego

18 K. Piekarska i inni Nr 1 szczepu sensu stricto wśród pacjentów szpitala. Według ogólnie przyjętych kryteriów interpretacji wyników PFGE (omówienie w piśmiennictwie, pozycja 24), do szczepu epidemicznego sensu stricto zaliczyć można te spośród badanych szczepów, które zostały przyporządkowane do grupy klonalnej A (gałąź A dendrogramu - Ryc. 4). Świadczy o tym fakt izolacji od 5 pacjentów pałeczek K. pneumoniae należących do tego samego genotypu PFGE (genotyp A), a także wysokie genetyczne podobieństwo pałeczek (genotypy B-E) wyosobnionych od kolejnych 4 pacjentów. Do grupy klonalnej A przyporządkowany został również szczep DM0259, wyosobniony od pacjenta z hospicjum, co może wskazywać na jego powiązanie z pałeczkami K. pneumoniae KPC+ występującymi u pacjentów szpitala. Ponieważ do tej grupy klonalnej należy też szczep DM0269, u którego stwierdzono zdolność wytwarzania KPC-2, można przypuszczać, że także pozostałe szczepy zgrupowane w gałęzi A dendrogramu wytwarzają ten sam wariant KPC. Zdolność wytwarzania KPC stwierdzono też u szczepów DM0260 i DM0261 wykazujących stopień zróżnicowania profili PFGE na tyle wysoki, że może on świadczyć o ich przynależności do innego szczepu sensu stricto reprezentowanego przez gałąź B dendrogramu (Ryc. 4). W tym przypadku nie można wykluczyć, że do nabycia zdolności wytwarzania KPC doszło w wyniku horyzontalnego transferu genu bla KPC pomiędzy szpitalnymi szczepami pałeczek K. pneumoniae. Wertykalne i horyzontalne szerzenie się zdolności wytwarzania KPC wśród szpitalnych szczepów pałeczek K. pneumoniae, obserwowali także inni autorzy (11, 16). Na uwagę zasługuje też oporność badanych szczepów pałeczek K. pneumoniae KPC+ na szereg antybiotyków reprezentujących różne grupy strukturalne i funkcjonalne. Szczepy te, a w szczególności szczepy charakteryzujące się profilami lekowrażliwości 5 i 6 (Tabela II), uznać można za wielolekooporne, w tym oporne na różne antybiotyki z grupy aminoglikozydów. Uzyskane wyniki oceny lekowrażliwości badanych szczepów pałeczek K. pneumoniae wskazują, że spośród 15 różnych antybiotyków użytych w badaniach, tylko kolistyna i w ograniczonym stopniu doksycyklina mogłyby być uznane za przydatne w terapii. Z tego względu szerzenie się szczepów K. pneumoniae wytwarzających KPC wśród pacjentów szpitala stanowić może poważny problem epidemiologiczny i terapeutyczny. W przedstawionej pracy posłużono się najbardziej dostępnymi metodami badawczymi, tak aby podobne badania mogły być prowadzane w jak najliczniejszej grupie laboratoriów w kraju, celem umożliwienia szybkiego i bezpośredniego uzyskiwania informacji niezbędnych dla kontroli i ograniczania zjawiska szerzenia się szczepów wytwarzających KPC. K. Piekarska, K. Zacharczuk, J. Szych, E. Zawidzka, E. Wilk, S. Wardak, M. Jagielski, R. Gierczyński DISSEMINATION OF THE KPC CARBAPENEMASE PRODUCING KLEBSIELLA PNEUMONIAE IN A HOSPITAL IN WARSAW, POLAND SUMMARY Within the last decade, human infections caused by enterobacteria which produce the Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) became a serious therapeutic and epidemiological problem worldwide. The KPC producing strains of K. pneumoniae broadly disseminated in the USA then spread

Nr 1 K. pneumoniae wytwarzające karbapenemazy typu KPC 19 to Europe. Recently, the KPC-2 was found in Poland. In the presented study we tested 11 ertapenem resistant isolates of K. pneumoniae. The isolates were obtained from 10 patients of a regular hospital (RH) and from one patient of a palliative care hospital (PH) in Warsaw, Poland. Expression of the KPC was confirmed in all the tested isolates by the positive result of phenotypic test with boronic acid. All the isolates were also shown to harbour the bla KPC gene by PCR with primers targeting the core 372 bp fragment of the gene, and all but two were resistant to imipenem and meropenem as determined by the disc-diffusion method. The DNA sequence analysis of the complete bla KPC gene from representative isolate DM0269 revealed variant 2 of KPC (KPC-2). Tested isolates were subjected to genotyping by the PFGE with XbaI. Dendrogram based on the PFGE profiles was composed of two main branches with 82,3% of similarity. Branch A encompassed 9 isolates (93,2%), including the one from the PHpatient, while the two remaining isolates (86,5%) were located in branch B. Five isolates of the branch A were indistinguishable by the PFGE. The high genetic similarity of the branch A isolates strongly suggests the intra-hospital dissemination of epidemic K. pneumoniae KPC+ sensu stricto strain. Most probably, the strain was also transferred to the palliative care hospital. In contrast, the branch B isolates appear to belong to the distinct sensu stricto strain, that has acquired the bla KPC gene via horizontal transfer. This is the first report on the intra-hospital dissemination of the KPC producing K. pneumoniae in Poland. It is noteworthy, all the tested strains were also resistant to cefotaxime, ceftazidime, aztreonam, ciprofloxacin and sulphonamides, but sensitive to colistin. PIŚMIENNICTWO 1. Baraniak A, Izdebski R, Herda M, Fiett J, Hryniewicz W, Gniadkowski M, Kern-Zdanowicz I, Filczak K, Łopaciuk U. Emergence of Klebsiella pneumoniae ST258 with KPC-2 in Poland. Antimicrob Agents Chemother 2009 ;53:4565-7 2. Carvalhaes CG, Picão RC, Nicoletti AG, Xavier DE, Gales AC. Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae: be aware of false positive results. J Antimicrob Chemother 2010;65:249-51 3. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Guidance for control of infections with carbapenem-resistant or carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in acute care facilities. Morb Mortal Wkly Rep 2009; 58:256-60 4. Chmelnitsky I, Hermesh O, Navon-Venezia S, Strahilevitz J, Carmeli Y. Detection of aac(6 )-Ib-cr in KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolates from Tel Aviv, Israel. J Antimicrob Chemother 2009;64:718-22 5. CLSI. Performance Standards for Antimicriobial Disc Suseptibility Tests, Eighteenth Informational Supplement, CLSI document M100-S18. Clinical and Laboratory Standards Institute Wayne, PA, USA, 2008 6. Cole JM, Schuetz AN, Hill CE, Nolte FS. Development and evaluation of a real-time PCR assay for detection of Klebsiella pneumoniae carbapenemase genes. J Clin Microbiol 2009; 47:322-6 7. Dierżanowska D, Kamińska W, Semczuk K, Borowiec D, Matysiak M, Szumała-Kąkol A, Gierczyński R, Patzer JA. Carriage of genes for various extended-spectrum beta-lactamases: a novel resistance strategy of Klebsiella pneumoniae in Poland. Int J Antimicrob Agents 2010; 35:392-5 8. Doi Y, Potoski BA, Adams-Haduch JM, Sidjabat HE, Pasculle AW, Paterson DL. Simple diskbased method for detection of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-type beta-lactamase by use of a boronic acid compound. J Clin Microbiol 2008;46:4083-6 9. Gierczyński R. Ocena przydatności wybranych markerów wirulencji do identyfikowania chorobotwórczych szczepów pałeczek Yersinia enterocolitica. II Genotypowe markery związane z plazmidem pyv. Med Dośw Mikrobiol 2000; 52:35-49

20 K. Piekarska i inni Nr 1 10. Gierczyński R, Kałużewski S, Rakin A, Jagielski M, Zasada A, Jakubczak A, Borkowska-Opacka B, Rastawicki W. Intriguing diversity of Bacillus anthracis in eastern Poland the molecular echoes of the past outbreaks. FEMS Microbiol Letters 2004; 239:235-40 11. Gootz TD, Lescoe MK, Dib-Hajj F, Dougherty BA, He W, Della-Latta P, Huard RC. Genetic organization of transposase regions surrounding bla KPC carbapenemase genes on plasmids from Klebsiella strains isolated in a New York City hospital. Antimicrob Agents Chemother 2009;53:1998-2004 12. Kitchel B, Rasheed JK, Patel JB, Srinivasan A, Navon-Venezia S, Carmeli Y, Brolund A, Giske CG. Molecular epidemiology of KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolates in the United States: clonal expansion of multilocus sequence type 258. Antimicrob Agents Chemother 2009;53:3365-70 13. Kochar S, Sheard T, Sharma R, Hui A, Tolentino E, Allen G, Landman D, Bratu S, Augenbraun M, Quale J. Success of an infection control program to reduce the spread of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae. Infect Control Hosp Epidemiol 2009; 30:447-52 14. Landman D, Bratu S, Quale J. Contribution of OmpK36 to carbapenem susceptibility in KPCproducing Klebsiella pneumoniae. J Med Microbiol 2009;58:1303-8 15. Pasteran F, Mendez T, Guerriero L, Rapoport M, Corso A. Sensitive screening tests for suspected class A carbapenemase production in species of Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol 2009;47:1631-9 16. Pournaras S, Protonotariou E, Voulgari E, Kristo I, Dimitroulia E, Vitti D, Tsalidou M, Maniatis AN, Tsakris A, Sofianou D. Clonal spread of KPC-2 carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae strains in Greece. J Antimicrob Chemother 2009; 64:348-52 17. Queenan AM i Bush K. Carbapenemases: the versatile beta-lactamases. Clin Microbiol Rev 2007; 20:440-58 18. Samuelsen Ø, Naseer U, Tofteland S, Skutlaberg DH, Onken A, Hjetland R, Sundsfjord A, Giske CG. Emergence of clonally related Klebsiella pneumoniae isolates of sequence type 258 producing plasmid-mediated KPC carbapenemase in Norway and Sweden. J Antimicrob Chemother 2009; 63:654-8 19. Sidjabat HE, Silveira FP, Potoski BA, Abu-Elmagd KM, Adams-Haduch JM, Paterson DL, Doi Y. Interspecies spread of Klebsiella pneumoniae carbapenemase gene in a single patient. Clin Infect Dis. 2009; 49:1736-8 20. Tsakris A, Kristo I, Poulou A, Themeli-Digalaki K, Ikonomidis A, Petropoulou D, Pournaras S, Sofianou D. Evaluation of boronic acid disk tests for differentiating KPC-possessing Klebsiella pneumoniae isolates in the clinical laboratory. J Clin Microbiol 2009; 47:362-7 21. Tsakris A, Poulou A, Themeli-Digalaki K, Voulgari E, Pittaras T, Sofianou D, Pournaras S, Petropoulou D. Use of boronic acid disk tests to detect extended- spectrum beta-lactamases in clinical isolates of KPC carbapenemase-possessing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 2009; 47:3420-6 22. Wolter DJ, Kurpiel PM, Woodford N, Palepou MF, Goering RV, Hanson ND. Phenotypic and enzymatic comparative analysis of the novel KPC variant KPC-5 and its evolutionary variants, KPC-2 and KPC-4. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53:557-62 23. Yigit H, Queenan AM, Anderson GJ, Domenech-Sanchez A, Biddle JW, Steward CD, Alberti S, Bush K, Tenover FC. Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase, KPC-1, from a carbapenemresistant strain of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45:1151-61 24. Zacharczuk K, Gierczyński R. Ocena przydatności nowych enzymów restrykcyjnych SfaAI oraz SmiI do różnicowania izolatów Yersinia enterocolitica 4/O3 i 1B/O8 metodą elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym (PFGE). Med Dośw Mikrobiol 2009; 61:133-42 Otrzymano: 3 III 2010 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH e-mail: rgierczynski@pzh.gov.pl