Bacillus thuringiensis w zwalczaniu owadów Izabela Święcicka Zakład Mikrobiologii Uniwersytet w Białymstoku
Chemiczne środki owadobójcze Time, 30 czerwiec 1947
Wpływ insektycydów na zdrowie ludzi DDT neonikotynoidy nowotwór mózgu, wątroby, trzustki białaczka?? cukrzyca? obniżenie zdolności reprodukcyjnych zmiany w metabolizmie wapnia?? zmiany w układzie dokrewnym? dysfunkcje neurofizjologiczne i? Beard, J. 2005. Sci. Total Environ. 355: 78-89. Karalliedde, L.D. i wsp. 2003. Food Chem. Toxicol. 41: 1-13.
Biologiczne środki owadobójcze Bacillus thuringiensis gramdodatnie, tlenowe bakterie przetrwalnikujące polimorficzne saprofity występują wzróżnicowanych środowiskach 10 0000 x kryształy parasporalne z -endotoksyną Cry1Ab21 ~ 500 toksyn Cry (50 144 kda) efektywne i selektywne wobec niektórych gatunków owadów Święcicka, I., Bideshi, D.K., Federici, B.A. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74: 923-930.
Biologiczne środki owadobójcze protoksyna Cry endospora 1 Larwa pobiera kryształy Cry i endospory wraz z pokarmem 2 Rozpuszczenie kryształów i aktywacja -endotoksyn aktywna toksyna Cry 3 Toksyny łączą się z receptorami 4 W jelicie tworzą się kanały jonowe 5 Śmierć larwy Święcicka, I. i wsp. 2001. Med. Wet. 57: 859 862.
Badania Uniwersytetu w Białymstoku Polimorfizm izolatów z gleby, mleka oraz z przewodów pokarmowych zwierząt. Molekularne aspekty entomopatogenności nowych izolatów Środowiskowe izolaty Bacillus thuringiensis Interakcje B. thuringiensis z organizmami wyższymi
Polimorfizm środowiskowych izolatów B. thuringiensis z północno-wschodniej Polski Cel badań: Wyznaczenie struktury genetycznej populacji B. thuringiensis z różnych środowisk. d i k Oszacowanie poziomu zróżnicowania genów kodujących entomotoksyny (cry, vip) u polskich izolatów. Określenie enterotoksyczności wśród badanych szczepów ze środowisk naturalnych. Analiza przystosowań B. thuringiensis do wzrostu w niskich temperaturach.
Polimorfizm B.thuringiensis Struktura genetyczna polskich izolatów B. thuringiensis B. thuringiensis od ssaków dziko żyjących (n=103) kb 2200 M NotI A B C D E F G H I m PULSOTYPY DNA kb kb M 2200 AscI A B C D E F G H I m kb 680 680 225 145.5 225 48.5 BPN 13 2 12 13 5 1 1 0 0 BPN 13 2 12 13 5 1 1 0 0 ŁPK 18 27 5 0 4 0 0 1 1 ŁPK 18 27 5 0 4 0 0 1 1 145.5 48.5 Święcicka, I., Mahillon, J. 2005. Environ. Microbiol. 7: 34-39.
Polimorfizm B.thuringiensis Zróżnicowanie genów cry wśród polskich izolatów B. thuringiensis Procent sz zczepów B. thurin ngiensis 30 25 20 15 10 5 cry1 cry9 cry1+2 cry1+9 cry4 cry? Lepidoptera Diptera Święcicka, I., Mahillon, J. 2005. Environ. Microbiol. 7: 34-39.
Polimorfizm B.thuringiensis Korelacja pomiędzy występowaniem genów cry a profilem DNA Liczba sz zczepów B. thurin ngiensis 35 30 25 20 15 10 5 cry1 cry9 cry1+2 cry1+9 cry4 cry1+4 cry niezdefiniowane A B C D E F G H I Typ PFGE B. thuringiensis Święcicka, I., Mahillon, J. 2005. Environ. Microbiol. 7: 34-39.
Polimorfizm B.thuringiensis 1. Populacja B. thuringiensis z północno-wschodniej Polski ma charakter wieloklonalny. Istnienie stabilnych klonów B. thuringiensis wskazuje, iż w środowisku u bakterii tego gatunku rzadko zachodzą procesy modyfikujące strukturę chromosomu. 2. W komórkach B. thuringiensis ma miejsce horyzontalny transfer genów -endotoksyn, za czym przemawia polimorfizm genów cry u izolatów o identycznym profilu chromosomu. 3. Wśród B. thuringiensis z północno-wschodniej Polski przeważają izolaty potencjalnie toksyczne dla larw motyli. Kontynuacja badań: Grant MNiSW N N304 281140 (2011-14) Tytuł: Struktura genetyczna oraz transfer genów w wybranych populacjach Bacillus cereus sensu lato z północno-wschodniej Polski.
Cel badań: Właściwości entomopatogenne B. thuringiensis podgat. thuringiensis IS5056 Oszacowanie entomopatogenności B. thuringiensis IS5056. Analiza molekularnych aspektów aktywności owadobójczej izolatu IS5056.
B. thuringiensis IS5056 SDS-PAGE 2 m kda 200 97.4 M IS5056 HD1 ~130 kda 65.0 MALDI-TOF-MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry) 10 000 x Sekwencje peptydów: IEDPQDLEIYLIR GNLEFLEEK VDALFVNS NLEFLEEE 10 000x -endotoksyna Cry1Ab21 Święcicka, I., Bideshi, D.K., Federici, B.A. 2008. Appl. Environ. Microbiol.74: 923-930.
B. thuringiensis IS5056 Wpływ IS5056 na larwy Trichoplusia ni LC 50 i LC 90 -endotoksyny Cry1Ab21 dla larw Trichoplusia ni Cry1Ab2 21 + endos spory ( g/ml) 125 116.9 100 75 65.2 50 25 18.6 29.7 LC 50 LC 90 Etapy rozwoju larwalnego: - drugi - czwarty Święcicka, I., Bideshi, D.K., Federici, B.A. 2008. Appl. Environ. Microbiol.74: 923-930.
B. thuringiensis IS5056 Profil plazmidowy Hybrydyzacja typu Southern z sondą ą cry1a kb 75 65 43 35 sc 12 IS5056 HD-1 IS5056 HD-1 kb 75 kb M bp 50 75 sc sc 21226 14.6 5148 8.2 7.4 5.2 2027 2.0 1375 947 Święcicka, I., Bideshi, D.K., Federici, B.A. 20081. Appl. Environ. Microbiol.74: 923-930.
B. thuringiensis IS5056 1. B. thuringiensis podgat. thuringiensis IS5056 syntetyzuje duże inkluzje o nietypowym sześciennym kształcie z nowo opisaną -endotoksyną Cry1Ab21, aktywną przeciw larwom Trichoplusia ni. 2. Populacje B. thuringiensis ze środowisk naturalnych stanowią rezerwuar szczepów o potencjalnym wykorzystaniu w biologicznej kontroli owadów. Kontynuacja badań: Grant MNiSW N N303656640 (2011-14) Tytuł: Wybrane plazmidy entomopatogennego szczepu Bacillus thuringiensis IS5056 stworzenie podstaw pod produkcję bioinsektycydów.
Cel badań: B. thuringiensis w środowisku naturalnym Określenie typu zależności pomiędzy ę B. thuringiensis,, a organizmami w którym te bakterie bytują. Wyznaczenie miejsca cyklu życiowego B. thuringiensis w środowisku naturalnym.
B. thuringiensis w środowisku naturalnym germinacja? endospory komórki ki wegetatywne drobne ssaki? lądowe skorupiaki? wrażliwe owady? sporulacja cykl życiowy B. thuringiensis
B. thuringiensis w środowisku naturalnym GRYZONIE Białystok nornica ruda nornik północny OWADOŻERNE 0 100 km Łomżyński Park Krajobrazowy Doliny Narwi (2000 r.) Biebrzański Park Narodowy (1996 r.) ryjówka aksamitna ryjówka malutka
B. thuringiensis w środowisku naturalnym Procent zwierząt z B. thuringiensis Łomżyński Park Krajobrazowy Doliny Narwi Biebrzński Park Narodowy gryzonie 16 owadożerne 17 gryzonie 11 owadożerne 17 Święcicka, I., De Vos, P. 2003. J. Appl. Microbiol. 94: 60 64. Święcicka, I., Fiedoruk, K., Bednarz, G. 2002. Lett. Appl. Microbiol. 34: 194-198.
B. thuringiensis w środowisku naturalnym B. thuringiensis w przewodzie pokarmowym prosionka szorstkiego Porcellio scaber okres karmienia i endosporami 0 6 8...30 dni mieszanina endospor z glebą 80 prosionków zakończenie karmienia dezynfekcja nowa gleba izolacja bakterii na podłożach z antybiotykami - mutacja spontaniczna Nal R - transformacja z zrekombinowanym plazmidem: Tet R -Kan R -GFP
B. thuringiensis w środowisku naturalnym kterii Liczba ba 10 5 całkowita liczba 10 4 bakterii liczba komórek 10 3 wegetatywnych 10 2 10 2 6 10 14 18 22 26 30 Czas (dni) Przeżywalność B. thuringiensis w przewodzie pokarmowym prosionka szorstkiego. Święcicka, I., Mahillon, J. 2006. FEMS Microbiol. Ecol. 56: 132-140.
B. thuringiensis w środowisku naturalnym A B C Cykl życiowy B. thuringiensis IS5056 w przewodzie pokarmowym larw T. ni: A. komórki wegetatywne w 48 h od spożycia endospor z pożywieniem; B, C. sporulujące komórki w siódmym 400x 400x 1 000x dniu eksperymentu. Ilość endospor w pożywieniu (ml -1 ) - 1 x 10 4 Ilość endospor w organizmie zmarłej larwy - 7.7 x 10 7 Wzrost liczby endospor - 767X Święcicka, I., Bideshi, D.K., Federici, B.A. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74: 923-930.
B. thuringiensis w środowisku naturalnym proliferacja i sporulacja faza metabolicznej aktywności Komórki wegetatywne Endospory faza metabolicznego uśpienia germinacja przewód pokarmowy niewrażliwych owadów i lądowych skorupiaków jamie ciała ł wrażliwych owadów podczas patogenezy i po śmierci owada w glebie Święcicka, I. 2008. Biocontrol Sci. Tech. 18: 221-239.
Finansowanie badań Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Uniwersytet w Białymstoku Université catholique de Louvain, Belgia Fundacja Fulbrighta COST 862 Bacterial Toxins for Insect Control
Dziękuję za uwagę