1. Część teoretyczna Dwufazowe układy dwuskładnikowe Ćwiczenie 3: Wpływ temperatury na równowagę w układzie ciecz-ciecz W ramach omawiania równowag fazowych należy wspomnieć o równowadze cieczciecz. Jest ona fundamentem rozważań nad procesami ekstrakcji. Najprostszym przypadkiem jest równowaga w układzie dwufazowym (dwie niemieszające się ciecze) trójskładnikowym: np. etanol-toluen-woda, w którym wszystkie składniki mieszaniny to ciecze. Technolog żywności ma często do czynienia z układami, w których jedynym rozpuszczalnikiem jest woda a niekompatybilność (niezgodność termodynamiczna) zachodzi pomiędzy dwoma makrocząsteczkami takimi jak białka (~90kDa), polisacharydy (5-2000kDa) czy też dopuszczone do żywności syntetyczne polimery (PVP poliwinylopirolidon 10-1300kDa, PVA alkohol poliwinylowy ~90kDa, PEG glikol polietylenowy 4-40kDa) lub małocząsteczkowe sole nieorganiczne. Dwie niemieszające się ciecze ulegaj rozwarstwieniu tworząc dwie fazy (np. olej-woda, nikotyna-woda). Zazwyczaj równowag w takich układach przedstawia się na wykresie zależności składu poszczególnych faz od temperatury. Rysunek 1 ilustruje zjawisko występowania dolnej (DKTR) oraz górnej (GKTR) krytycznej temperatury rozpuszczalności. Krzywe rozpuszczalności nie są zazwyczaj symetryczne a położenie temperatury krytycznej nie musi by ekstremalne na tej krzywej. Przedstawione powyżej krzywe w przypadku mieszaniny dwóch cieczy nazywamy binodami bowiem ograniczają one obszar występowania dwóch faz. Na linii stałej temperatury wyznaczyć można skład faz pozostających ze sobą w równowadze (konoda). Ich ilość (proporcja mas faz) może być wyznaczona w oparciu o regułę dźwigni. Poza tym obszarem ciecze mieszają się ze sobą w sposób nieograniczony. Znane są mieszaniny które wykazuj istnienie GKTR i DKTR (woda-nikotyna, dwuetyloaminawoda, trójetyloamina-woda). W takich układach wzajemna rozpuszczalność maleje ze wzrostem temperatury a następnie wzrasta (rys. 2). Rys. 1. Wpływ temperatury na mieszalność dwóch cieczy A i B: DKTR dolna krytyczna temperatura rozpuszczalności, GKRT górna krytyczna temperatura rozpuszczalności. Na trzecim rysunku przedstawiono ideę układu z luką mieszalności. Mieszalność cieczy limitowana jest rodzajem oddziaływań pomiędzy cząsteczkami dwóch cieczy A-B oraz wzajemnymi oddziaływaniami A-A i B-B. Zmiana temperatury może oczywiście nasilać lub tłumić te oddziaływania ograniczając lub zwiększając mieszalność. Na rysunku 2a przedstawiono jak obniżenie temperatury z T 1 na T 2 ogranicza obszar współistnienia dwóch faz. Również ciśnienie może zmieniać obszar współistnienia dwóch faz, znane są układy, w których wzrost ciśnienia zwiększa wzajemną mieszalność (rys. 2b). 1
Rys. 2. a) Reguła dźwigni przy określaniu składu równowagowego b) wpływ ciśnienia na mieszalność cieczy o GKTR i DKTR. Dwufazowe układy trójskładnikowe Graficzną analizę właściwości układów trójskładnikowych można przeprowadzić za pomocą wykresu Gibbsa (trójkąt Gibbsa) lub w prostokątnym układzie współrzędnych. Równoboczny trójkąt Gibbsa jest klasycznym układem współrzędnych, w którym wierzchołki trójkąta reprezentują 100% danego składnika. Rys. 3. Idea określania składu mieszaniny trójskładnikowej w trójkątnym i prostokątnym układzie współrzędnych. Podstawa trójkąta odpowiada mieszaninom dwóch składników A i B, drugi bok mieszaninie dwuskładnikowej A oraz C i analogicznie trzeci mieszaninie B i C. Zmieszanie trzech składników A, B i C skutkuje wytworzeniem mieszaniny, której skład reprezentowany jest przez punkt leżący wewnątrz trójkąta. W przypadku określania 2
składu takiej mieszaniny (A, B i C) w prostokątnym układzie współrzędnych, odcięta oznacza zawartość w mieszaninie składnika A natomiast rzędna zawartość składnika B. Zawartość C wyznaczamy z bilansu składu (dopełnienie do 100%). Poniższy rysunek (rys. 4) ilustruje typowe zjawisko separacji faz, odpowiadające przypadkowi gdy dwie ciecze (A i B) wykazują ograniczoną mieszalność. Krzywa zwana binodą ogranicza obszar stężeń składników (A, B i C), w którym następuje separacja faz. Zmieszanie składników w proporcjach z tego obszaru spowoduje powstanie mętnej mieszaniny, która po pewnym czasie ulegnie rozwarstwieniu na dwie fazy: I i II, których składy wynikają z równowagi fazowej. Składy te można połączyć odcinkami zwanymi konodami. Konody to odcinki nie tylko łączące składy faz pozostających w równowadze. Ich przebieg pokrywa się ze takimi proporcjami pomiędzy A, B i C, których zastosowanie w mieszaninie zawsze poskutkuje separacją faz do składów opisanych stężeniami leżącymi na binodzie (czyli składami faz I i II, które bez względu na skład mieszaniny wyjściowej zawsze są takie same). Współistniejące ze sobą dwie fazy I i II różnią się. W fazie II przeważa ciecz A i w tej fazie składnik C jest obecny w niewielkiej ilości. Faza I jest bogatsza w ciecz B, a składnik C obecny jest w większej ilości. Oznacza to, że składnik C ma większe powinowactwo do cieczy B niż cieczy A. W omawianym przypadku występuje punkt krytyczny: krytyczne stężenie, którego przekroczenie oznacza osiągnięcie obszaru jednorodnej fazy. Rys. 4. Separacja faz w układzie trójskładnikowych przedstawiona w trójkątnym i prostokątnym układzie współrzędnych. 3
2. Część doświadczalna A) Przygotowanie wodnych roztworów do miareczkowania Do badań wykorzystane zostaną następujące substancje: laktoferyna HOLO (białko) o masie cząsteczkowej rzędu 87 kg/mol, glikol polietylenowy (PEG) o masach cząsteczkowych 10 kg/mol i 100 kg/mol Przygotować trzy butelki Simax o pojemności 200mL. Do pierwszej z nich odważyć na wadze technicznej 7g laktoferyny i dopełnić wodą destylowaną do 70g całkowitej masy roztworu. W butelce umieścić mieszadełko magnetyczne (propeller) i umieścić, bez podgrzewania, na napędzie mieszadła magnetycznego (obroty 500rpm). Do pozostałych dwóch butelek naważyć odpowiednio: do pierwszej 10g PEG 10 kg/mol i do drugiej 10g PEG 100 kg/mol. Dopełnić do masy 100g roztworu wodą destylowaną i mieszać na mieszadle magnetycznym (500 rpm) w podwyższonej temperaturze do 60 ºC. Po rozpuszczeniu polimerów ogrzane roztwory schłodzić w łaźni wodnej. BUTLEKI Z ROZTWORAMI PODPISAĆ. B) Miareczkowanie roztworów PEG do zmętnienia Jedną z metod badania równowagi w układach ciecz-ciecz jest miareczkowanie cieczy I (roztworu I) cieczą II (roztworem II) aż do uzyskania zmętnienia świadczącego o powstaniu układu dwufazowego. Aby wykonać to proste doświadczenie należy przygotować stanowisko złożone z mieszadła magnetycznego, biurety i zlewki, w której mieszane będą ze sobą obydwa roztwory (rys. 5). Na poniższym zdjęciu przedstawiono ogólny widok stanowiska do miareczkowania. Rys. 5. Widok ogólny stanowiska do miareczkowania. Przed przystąpieniem do miareczkowania należy przygotować 5 zlewek o objętości 40 ml i tak dobrać wielkość propellera do mieszania, aby zapewnić odpowiednie warunki do wytworzenia układu dwufazowego. Biuretę należy napełnić roztworem laktoferyny do objętości nominalnej 10mL. Do zlewki należy wlać 20mL roztworu PEG-u, ustawić na mieszadle i rozpocząć mieszanie. Po ustaleniu obrotów mieszadła rozpocząć miareczkowanie roztworem laktoferyny. 4
W początkowym etapie nie widać zmian w zabarwieniu mieszaniny. Rys. 6. Postęp miareczkowania roztworem laktoferyny, zmętnienie mieszaniny. Po dodaniu większej ilości roztworu laktoferyny mieszanina jest zabarwiona ale bez wyraźnych oznak powstania układu dwufazowego. W końcowym efekcie można zaobserwować zmętnienie mieszaniny świadczące o powstaniu emulsji. Wynikiem doświadczenia jest objętość roztworu laktoferyny, która spowodowała zmętnienie mieszaniny. C) Wpływ temperatury na równowagę w badanym układzie. Miareczkowanie powtórzyć podgrzewając roztwory do 30 ºC, 40ºC i 50ºC. Wyniki przedstawić w postaci wykresu ilustrującego zależność zużytej objętości roztworu laktoferyny od temperatury miareczkowania. D) Wpływ temperatury na współczynnik podziału Nernsta. Współczynnik podziału Nernsta dla badanego białka określa iloraz stężeń białka w fazie górnej (c G ) i dolnej (c D ): k c c G D Aby wyznaczyć stężenie białka w górnej i dolnej fazie należy oddzielić fazy (zlać fazę górną) i rozcieńczyć je wodą destylowaną 5x, 10x i 20x. W tym celu posługując się pipetą jednomiarową (1mL) należy pobrać po 1mL fazy górnej i dolnej i wlać do przygotowanych wcześniej i podpisanych kuwet o pojemności 22mL. Następnie korzystając z pipety wielomiarowej dopełnić kuwety odpowiednio 4mL, 9mL i 19mL wody destylowanej. Pomiar stężenia białka w badanych próbkach przeprowadzony zostanie metodą pomiaru absorbancji (A) w nadfiolecie, przy 1=280nm i 2=260nm. Wykorzystany zostanie spektrofotometr UV-VIS Spectro UVS-2800. 5
Pomiary należy wykonać w kuwetach kwarcowych, wyznaczając absorbancję w i. Stężenie białka oblicza się ze wzoru: c 1,55 A A 280 0, 76 260 4. Sprawozdanie Specjalność W sprawozdaniu proszę umieścić Tabelkę według wzoru Data wykonania ćwiczenia Temat ćwiczenia Data oddania sprawozdania Numer grupy Imię i nazwisko Ocena Krótki wstęp teoretyczny Wyniki pomiarów objętości roztworu laktoferyny zużytej podczas miareczkowania jako funkcję temperatury oraz masy cząsteczkowej PEG-u obecnego w roztworze miareczkowanym Wartości współczynnika podziału Nernsta Wnioski dotyczące właściwości badanego układu, w szczególności wpływu temperatury na zjawisko separacji faz. 6