PRACE ORYGINALNE Dorota FORMANOWICZ 1,2 Irena PIETRZAK 1 Krzysztof WIKTOROWICZ 3 Mikroheterogennoœæ transferyny u chorych leczonych owtarzan¹ hemodializ¹ Transferrin microheterogeneity in atients treated by maintenance haemodialysis 1 Katedra i Klinika Nefrologii, Translantologii i Chorób Wewnêtrznych Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu Kierownik Katedry i Kliniki: Prof. dr hab. Stanis³aw Czekalski 2 Katedra Chemii i Biochemii Klinicznej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu Kierownik Katedry: Prof. dr hab. Lech Torliñski 3 Katedra Biologii i Ochrony Œrodowiska Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu Kierownik Katedry: Prof. dr hab. Krzysztof Wiktorowicz Dodatkowe s³owa kluczowe: transferna glikozylacja bia³ek niedokrwistoœæ schy³kowa niewydolnoœæ nerek hemodializa Additional key words: transferrin glycosylation of roteins anaemia end-stage renal disease haemodialysis Adres do koresondencji: Dr n. med. Dorota Formanowicz Katedra Chemii i Biochemii Klinicznej UM 60-780 Poznañ, ul. Grunwaldzka 6 Tel.: (061) 854 65 90 e-mail: doforman@am.edu.l Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 7-8 Transferyna (Tf) odgrywa kluczow¹ rolê w transorcie elaza w organizmie cz³owieka. W warunkach fizjologicznych Tf wystêuje w ostaci czterech wariantów. Stê enie Tf i jej wariantów zmienia siê w ró nych stanach, szczególnie odczas reakcji ostrej fazy, która mo e mieæ miejsce w okresie schy³kowej niewydolnoœci nerek (). Celem racy by³a ocena zale noœci omiêdzy zmianami glikozylacji Tf a wybranymi wskaÿnikami morfologii krwi i gosodarki elazowej u chorych w okresie, leczonych rzewlek³¹ hemodializ¹ (HD), u których omimo leczenia rekombinowan¹ ludzk¹ erytrooetyn¹ utrzymuje siê niedokrwistoœæ. Do gruy badanej w³¹czono 55 chorych w okresie leczonych rzewlek³¹ hemodializ¹ (grua ). Wartoœci referencyjne uzyskano od 20 zdrowych ochotników (grua ). Stê enie Tf oznaczano metod¹ immunoelektroforezy rakietkowej wed³ug Laurella. Natomiast stê enia oszczególnych wariantów Tf w surowicy krwi oceniano w oarciu o metodê immunoelektroforezy krzy owej owinowactwa wed³ug Bog-Hansena. Stê enie wybranych arametrów hematologicznych i wybranych wskaÿników funkcji w¹troby zbadano metodami rutynowymi, stê enie cytokin oznaczano metod¹ ELISA, natomiast stê enie wybranego bia³ka ostrej fazy, tj. bia³ka C-reaktywnego oceniono metod¹ immunonefelometryczn¹. Tf w badanych surowicach ulega³a rozdzia³owi na cztery warianty, Tf2, Tf3, Tf4. Procentowy udzia³ wariantów Tf w gruie by³ nastêuj¹cy =4%, Tf2=9%, Tf3=82%, Tf4=4%. W gruie rocentowy udzia³ wariantów, Tf2, Tf4 wzrós³ odowiednio do 9%, 16% i 10%, odczas gdy udzia³ wariantu Tf3 uleg³ obni eniu do 65% w orównaniu z gru¹. Stê enie Tf w surowicy krwi by³o ni sze 1441 ± 526 mg/l u chorych w okresie (<0,0001) w orównaniu z gru¹ 3539 ± 955 mg/l. W badaniu zaobserwowano, e Tf u chorych w okresie ulega zmianom iloœciowym i jakoœciowym. Stwierdzone zale noœci omiêdzy stê eniem wariantu Tf3 a wybranymi arametrami hematologicznymi i wielkoœci¹ rhuepo sugeruj¹, e obni one stê enie Tf3 mo e uoœledzaæ transort elaza do komórek i byæ jednym z czynników w³ywaj¹cych na wystêowanie niedokrwistoœci u chorych leczonych HD i rhuepo. Transferrin (Tf) lays a crucial role in iron transort in the human body. In hysiologically status Tf occurs in four variants. The concentration of Tf and its variants is changing in several conditions, esecially during acute hase resonse, which may take lace in end-stage renal disease (ESRD). The aim of this study was the assessment of the associations between changes of glycosylation of transferrin and selected blood cell count and iron metabolism arameters in ESRD atients treated by maintenance hemodialysis (mhd) with long lasting anaemia desite treatment by rhuepo. Studies were carried out on a grou of 55 ESRD atients treated by HD (ESRD grou). The reference values were obtained from a grou of 20 healthy volunteers (HV grou). The Tf concentration was determined by the rocket immunoelectrohoresis according to Laurell. To estimate the microheterogenity of Tf the crossed affinoimmunoelectrohoresis according to Bog-Hansen was used. The concentration of selected hematological variables, and selected liver metabolism variables was assessed by routine laboratory tests, while the concentration of cytokines was measured by ELISA method, and selected acute hase roteins, i.e. C-reactive rotein, by immunonehelometry method. Tf in studied sera was divided into four variants, Tf2, Tf3, Tf4. The ercentage contents of variants in HV was =4%, Tf2=9%, Tf3=82%, Tf4=4%. In the sera of ESRD grou the ercentage contents of the, Tf2, Tf4 variants increased to 9%, 16%, 10% resectively, while the Tf3 variant decreased to 65%. Serum concentration of Tf was lower (1441 ± 526 mg/l) in ESRD atients (<0.0001) vs. 3539 ± 955 mg/l in HV grou. During this study we have revealed that the quantity and the quality of Tf is changing in ESRD atients. The observed correlations between concentration of Tf3 and selected hematological variables and also between Tf3 and rhuepo, suggests that the decrease concentration of the Tf3 may lead to an imaired iron transort to the cells and may be one of the factors affecting anaemia in atients treated by HD and rhuepo. 483
Wstê Transferyna (Tf) ma istotne znaczenie w metabolizmie elaza cz³owieka [4,5]. G³ówna jej rola olega na transortowaniu elaza (Fe) z miejsc jego wch³aniania (komórki jelita cienkiego) i magazynowania (komórki jednoj¹drzaste) do komórek osiadaj¹cych na swojej owierzchni recetor dla Tf (TfR) [21]. Pod wzglêdem budowy chemicznej Tf jest N-glikorotein¹ o masie cz¹steczkowej 79,57 kda i ruchliwoœci elektroforetycznej b-globulin, zbudowan¹ z jednego ³añcucha olietydowego (679 aminokwasów) i dwóch bocznych ³añcuchów wêglowodanowych tyu z³o onego (anten) rzy³¹czonych kowalencyjnie, na drodze glikozylacji, do trzonu bia³kowego [8,24]. añcuch bia³kowy Tf sk³ada siê z dwóch czêœci (N- i C- koñcowej) zawieraj¹cych o dwie domeny ka da. Pomiêdzy domenami znajduje siê jedno miejsce o wysokim owinowactwie do wi¹zania elaza (Fe 3+ ), dziêki któremu Tf mo e transortowaæ równoczeœnie dwa jony Fe 3+ [10,11]. Cz¹steczka Tf charakteryzuje siê heterogennoœci¹, która zwi¹zana jest w g³ównej mierze z obecnoœci¹ trzech czynników, tj. genetycznym olimorfizmem cz¹steczki, ró nic¹ w iloœci transortowanych jonów elaza oraz ró norodnoœci¹ w budowie reszt cukrowcowych (wêglowodanowych) [6,9]. Genetyczny olimorfizm cz¹steczki Tf wynika z faktu, e istnieje onad dwadzieœcia olimorficznych form Tf, warianty Tf (gruy cz¹steczek Tf o identycznej strukturze bocznych ³añcuchów) s¹ determinowane rzez allele wielokrotne tego samego ojedynczego 'locus' i ró ni¹ siê miedzy sob¹ ojedynczymi nukleotydami. Postaci Tf (holotransferyna (holo-tf) i aotransferyna (ao-tf)) w³ywaj¹ na ró - nice w iloœci transortowanych jonów elaza. Holo-Tf (30% ca³kowitej Tf) transortuje jeden jon elaza w N -koñcowej lub C -koñcowej domenie (Nt(Fe)Tf lub Tf(Fe)Ct) lub dwa jony elaza w ka dej z domen Tf(Fe) 2, natomiast ao-tf (70% ca³kowitej Tf) nie tranortuje elaza i mo e je zwi¹zaæ rzechodz¹c wówczas w ostaæ holo-tf. Ró norodnoœæ reszt cukrowcowych (wêglowodanowych) Tf wynikaj¹ca z ró nic iloœciowych (iloœæ cukrów) i jakoœciowych (stoieñ rozga³êzienia cukrów) w budowie bocznych ³añcuchów cz¹steczki nazywana jest mikroheterogennoœci¹ [3, 6, 13, 24]. Wyró - nia siê dwie ostaci mikroheterogennoœci Tf: g³ówn¹ i oboczn¹. G³ówna mikroheterogennoœæ Tf dotyczy ró norodnoœci bocznych ³añcuchów cukrowcowych (struktur antenarnych) [18,22]. Tf mo e tworzyæ warianty zawieraj¹ce jeden ³añcuch dwuantenarny, dwa jednakowe ³añcuchy dwu, trzy lub czteroantenarne, a tak- e dwa ró ne ³añcuchy: dwu i trzy lub trzy i czteroantenarne. Najbardziej owszechn¹ ostaci¹ Tf w organizmie cz³owieka jest ao-tf, której boczny ³añcuch wêglowodanowy zbudowany jest z dwóch ³añcuchów dwuantenarnych zakoñczonych resztami kwasu sialowego [24]. Schemat budowy ³añcuchów wêglowodanowych ao-tf zosta³ rzedstawiony na rycinie 1. Sosób umiejscowienia reszt cukrowcowych w b³onach mo na oceniæ za omoc¹ Ñ Ñ Ñ Ñ o o o o o o - N-acetyloglukozamina o - mannoza Ñ - galaktoza y - kwas sialowy Rycina 1 Schemat budowy ³añcuchów wêglowodanowych (dwa ³añcuchy dwuantenarne) cz¹steczki ao-tf. Scheme of carbohydrate chain structure (two bi-antennary chains) of ao-tf molecule. 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 *** *** Rycina 2 Porównanie stê eñ transferyny [mg/l] w surowicy krwi w obu gruach badanych. The comarison of serum transferrin concentrations [mg/l] in both studied grous. A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Rycina 3 Wyniki rozdzia³u transferyny metod¹ immunoelektroforezy rakietkowej wed³ug Laurella w 12 surowicach chorych w okresie oraz w surowicach referencyjnych A i B. The results of transferrin division by the rocket immunoelectrohoresis method according to Laurell in 12 sera of ESRD atients and A and B references sera. secyficznych metod znakowania. W tym celu wykorzystuje siê bia³ka roœlinne zwane lektynami, wykazuj¹ce du e owinowactwo do niektórych reszt cukrowcowych. Dziêki zastosowaniu immunoelektroforezy owinowactwa z u yciem lektyny - Konkanawaliny A (ConA) wyodrêbnia siê cztery warianty transferyny, Tf2, Tf3 i Tf4 [6, 24]. Charakterystykê oszczególnych wariantów Tf [4] rzedstawiono w tabeli I. Poboczna mikroheterogennoœæ Tf wnika z ró nic w zawartoœci i rodzaju reszt wêglowodanowych. Poszczególne warianty mog¹ zawieraæ cukry nietyowe dla glikorotein, jak n. reszty fukozy, N-acetylogalaktozaminy, dodatkowe reszty kwasu sialowego, galaktozy lub N-acetyloglukozaminy [24]. Do analizy obocznej mikroheterogennoœci wykorzystuje siê elektroforezê ogniskowania elektrycznego, która ozwala wyró niæ dziewiêæ form Tf od asialo do oktasialo-tf [24]. 484 Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 7-8 D. Formanowicz i ws.
A Tf 4 Tf 3 Tf 1 Tf 4 Tf 1 Tf 4 B Tf 3 Tf 2 Cel racy Celem racy by³a ocena zale noœci omiêdzy zmianami iloœciowymi i jakoœciowymi transferyny a wybranymi wskaÿnikami morfologii krwi i gosodarki elazowej u chorych w okresie, leczonych HD, u których omimo leczenia rekombinowan¹ ludzk¹ erytrooetyn¹ utrzymuje siê niedokrwistoœæ. Tf 3 Tf 2 Tf 2 Rycina 4 Wyniki rozdzia³u Tf metod¹ immunoelektroforezy krzy owej owinowactwa wed³ug Bog-Hansena u dwóch chorych z gruy (A) i jednej osoby z gruy (B). The results of transferrin division by crossed affinoimmunoelectrohoresis method according to Bog-Hansen in 2 atients from the grou (A) and one atient from the (B). Z D R S N N 0% 20% 40% 60% 80% 100% Rycina 5 Porównanie udzia³u rocentowego oszczególnych wariantów Tf w surowicy w obu badanych gruach. The comarison of selected serum transferin variant ercentage contents in both studied grous. Tf2 Tf3 Tf4 Materia³ i metody Badaniami objêto gruê 55 chorych (24 kobiety, 31 mê czyzn) w V stadium rzewlek³ej choroby nerek (egfr <15 ml/min/1,73m 2 ), leczonych rzez rzynajmniej jeden miesi¹c hemodializ¹ (HD) (GRUPA ). Zabiegi HD wykonywano 3 razy w tygodniu rzez 4 godziny rzy u yciu dializatorów kailarnych, olisulfonowych o owierzchni 1,2 m 2. Prze³yw krwi rzez dializator by³ sta³y i wynosi³ œrednio 200 ml/min, a rze³yw konwencjonalnego dwuwêglanowego ³ynu dializacyjnego wynosi³ 500 ml/min. Chorzy o zabiegu HD otrzymywali do ylnie: rekombinowan¹ ludzk¹ ertrooetynê (rhuepo) w ostaci erytrooetyny - a (EPREX ) w œredniej dawce tygodniowej 4480 ± 2546 IU oraz do ylnie elazo w ostaci komleksu sacharozy i wodorotlenku Fe 3+ (Venofer ) w œredniej dawce tygodniowej 124 ± 54 mg oraz rearaty kwasu foliowego w œredniej dawce tygodniowej 15 ± 5 mg. Z badania wykluczono chorych z rocesem nowotworowym oraz zaka onych wirusem HBV, HCV, CMV, i tych, którzy w ci¹gu szeœciu miesiêcy orzedzaj¹cych badanie rzebyli jak¹kolwiek ostr¹ chorobê zaaln¹. Do gruy zdrowych ochotników (GRUPA ) w³¹czono 20 osób, u których w badaniach rzedmiotowych oraz laboratoryjnych nie stwierdzono odchyleñ od stanu rawid³owego. Próbki krwi do badañ obierano od chorych rzed rozoczêciem drugiego w tygodniu zabiegu HD, a od. Charakterystykê badanych gru rzedstawiono w tabelach II, III, IV i V. U wszystkich badanych wykonano oznaczenia stê- enia Tf w surowicy krwi, rofil glikozylacji Tf, morfologiê krwi, stê enie wybranych arametrów gosodarki elazowej i w¹trobowej oraz stê enia wybranych bia³ek ostrej fazy i cytokin. Stê enie Tf [mg/l] oznaczano metod¹ immunoelektroforezy rakietkowej wg Laurella [16]. Profil glikozylacji Tf (stê enia wariantów, Tf2, Tf3, Tf4 w surowicy krwi) wyznaczano w oarciu o metodê immunoelektoforezy krzy owej owinowactwa wg Bog-Hansena [1]. Stê enie oszczególnych wariantów Tf wyra ano w mg/l. Stê enie hemoglobiny (Hb) [g/dl], iloœæ krwinek czerwonych (RBC) [1012/l], œredni¹ objêtoœæ krwinki czerwonej (MCV) [fl], œredni¹ masê HGB w krwince czerwonej (MCH) [g], wskaÿnik hematokrytowy (Hct) [%] oznaczano metod¹ konduktometryczn¹ rzy u yciu analizatora hematologicznego Sysmex K-4500 firmy ICN, Stany Zjednoczone. Stê enie elaza (Fe), ca³kowit¹ zdolnoœæ wi¹zania Fe (TIBC) oraz utajon¹ zdolnoœæ wi¹zania elaza (UIBC) oznaczano metod¹ kolorymetryczn¹ z ferrozyn¹ rzy u yciu analizatora biochemicznego Cobas Integra 400, firmy Roche, Szwajcaria. Saturacjê Tf (TSAT) obliczano na odstawie wzoru: TSAT [%] = Fe/TIBC. Stê enie ferrytyny [ng/ml] oznaczano metod¹ elektrochemiluminescencyjna (ECL) z monoklonalnymi rzeciwcia³ami mysimi rzeciwko ferrytynie rzy u yciu analizatora immunochemicznego Elecsys 2010, firmy Roche, Szwajcaria. Stê enie bilirubiny oznaczano metoda kolorymetryczn¹ diazo z dwumetylosulfotlenkiem (DMSO), rzy u yciu analizatora biochemicznego Cobas Integra 400, firmy Roche, Szwajcaria. Stê enie aminotransferazy alaninowej (AlAT) [U/l] oraz aminotransferazy asaraginianowej (AsAT) [U/l] oznaczano metod¹ kinetyczn¹ wg IFCC (International Federation for Clinical Chemistry) bez fosforanu 5-irydoksylu (P-5-P) w temeraturze 37 o C, rzy u yciu analizatora biochemicznego Cobas Integra 400, firmy Roche, Szwajcaria. Stê enie bia³ka C-reaktywnego (CRP) [mg/l] oznaczano metod¹ immunonefelometryczn¹, u ywaj¹c testów o wysokiej czu³oœci high sensitivity CRP (hscrp) firmy DADE Behring, USA i nefelometru DADE Behring Analyzer II, Stany Zjednoczone. Stê enie interleukiny-1 (IL-1) oznaczano metod¹ immunoenzymatyczn¹ (ELISA) rzy u yciu zestawu Quantikine human IL-1, firmy R&D Systems, Stany Zjednoczone. Stê enie interleukiny-6 (IL-6) zbadano metod¹ immunoenzymatyczn¹ (ELISA) rzy u yciu zestawu Quantikine human IL-6, firmy R&D Systems, Stany Zjednoczone, natomiast stê enie czynnika martwicy nowotworów (TNFa) oznaczano metod¹ immunoenzymatyczn¹ (ELISA) rzy u yciu zestawu Quantikine human TNF, firmy R&D Systems, Stany Zjednoczone. Stê enia cytokin odczytywano z krzywej wzorcowej i wyra ano w g/ml. Analiza statystyczna wyników objê³a statystykê oisow¹, badania istotnoœci ró nic, zale noœci miêdzy zmiennymi oraz badanie ró nic miêdzy gruami. W zakresie arametrów dotycz¹cych statystyki oisowej zosta³a obliczona œrednia i odchylenie standardowe (SD). Za omoc¹ testu Shairo-Wilka oceniono zgodnoœæ z rozk³adem normalnym dla wszystkich zmiennych. Zale - noœci omiêdzy zmiennymi zbadano za omoc¹ wsó³czynnika Pearsona oraz regresji liniowej, natomiast do oceny ró nic u ywano testu t-studenta. Dla badania zmiennych nie wykazuj¹cych zgodnoœci z rozk³adem normalnym wykorzystano testy niearametryczne. Ocena istotnoœci ró nic omiêdzy badanymi gruami chorych wykonana zosta³a rzy zastosowaniu testu Manna-Whitney`a, a zale noœæ miêdzy zmiennymi zbadano za omoc¹ wsó³czynnika korelacji Searmana. Hiotezê zerow¹ w wy ej wymienionych testach weryfikowano na oziomie istotnoœci <0,05. Analizê wykonano rzy u yciu akietu statystycznego STATISTI- CA v. 6.0 [12]. Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 7-8 485
Wyniki W gruie stê enie Tf w surowicy krwi by³o statystycznie istotne obni one () w orównaniu z gru¹, co zosta³o rzedstawione na rycinie 2. Wyniki rozdzia³u Tf w 12 wybranych surowicach chorych z gruy rzedstawiono na rycinie 3. Stê enia wariantów, Tf2, Tf3 w surowicy krwi by³y istotnie statystycznie ni - sze w gruie w orównaniu z gru¹. Ponadto nie zaobserwowano istotnych ró nic omiêdzy gruami w zakresie stê enia w surowicy krwi wariantu Tf4. W tabeli VI rzedstawiono orównanie stê eñ oszczególnych wariantów Tf w surowicy krwi w obu badanych gruach. Przyk³adowe wyniki rozdzia³u Tf metod¹ immunoelektroforezy krzy owej owinowactwa wg Bog-Hansena u dwóch wybranych osób w okresie i jednej osoby z gruy rzedstawiono na rycinie 4. Analiza udzia³u rocentowego oszczególnych wariantów Tf w ca³kowitej iloœci Tf, znajduj¹cej siê w surowicy krwi, wyra ona w %, wykaza³a w gruie wzrost udzia- ³u rocentowego wariantów =9%, Tf2=16%, Tf4=10% oraz obni enie udzia³u rocentowego wariantu Tf3=65% w orównaniu z wynikami uzyskanymi od osób z gruy, które wynios³y odowiednio =4%, Tf2=9%, Tf3=82%, Tf4=4%. Porównanie udzia³u rocentowego oszczególnych wariantów Tf w obu badanych gruach rzedstawiono na rycinie 5. Ponadto w gruie zaobserwowano wyk³adniki niedokrwistoœci makrocytarnej, hierchromicznej, rzy jednoczesnym obni eniu Fe, TIBC i UIBC oraz odwy szonym stê eniu ferrytyny w surowicy krwi. Ró nice omiêdzy gruami w zakresie wybranych wskaÿników morfologii krwi i gosodarki elazowej rzedstawiono w tabeli III. W gruie analiza korelacji wykaza³a istnienie zale noœci omiêdzy stê eniem Tf i Tf3 a stê eniem RBC (r=0,34, =0,01; r=0,73, =0,065, odowiednio), Hb (r=0,36, =0,02; r=0,48, =0,01, odowiednio) oraz wielkoœci¹ Hct (r=0,29, =0,045; r=0,45, =0,02, odowiednio). Zale noœci omiêdzy stê eniami ozosta³ych wariantów Tf w surowicy krwi a stê eniem RBC, Hb i wielkoœci¹ Hct by³y statystycznie nieistotne. Ponadto zauwa ono istnienie ozytywnej zale noœci omiêdzy stê eniem Tf3 a stê eniem Fe w surowicy krwi (r=0,36, =0,02) oraz stwierdzono obecnoœæ odwrotnej zale noœci omiêdzy stê eniem tego wariantu a wielkoœci¹ dawki rhuepo (r=- 0,28, =0,04). Stê enia ozosta³ych wariantów w surowicy krwi wykazywa³y zale noœci o odobnym charakterze, lecz nie by³y one istotne statystycznie. Wzrost stê enia wybranych wyk³adników zaalenia w surowicy krwi tj. CRP oraz cytokin: IL-1, IL-6 i TNF-a by³ istotny statystycznie w gruie w orównaniu ze, co zosta³o rzedstawione w tabeli V. Wykazano istnienie negatywnych korelacji omiêdzy stê eniem Tf i Tf3 a stê eniem wybranych markerów rocesu zaalnego tj. CRP (r=-0,31, =0,025; r=-0,36, =0,02 odowiednio), IL-1 (r=-0,29, =0,03; r=-0,29, =0,03, odowiednio) oraz IL-6 (r=- 0,36, =0,01; r=-0,34, =0,01, odowiednio). Tabela I Charakterystyka wariantów Tf uzyskanych odczas reakcji z Konkanawalin¹ A. Characteristics of Tf variants obtained in reaction with Concanavalin A. Wariant Tf Tf2 Tf3 g³ównie ao-tf Tf4 Tabela II Charakterystyka badanych gru. Characteristics of examined grous. Gruy Liczba badanych Kobiety Mê czyÿni Œredni wiek ± SD [lata] DN PN Rozoznanie KZN HN TN Œredni okres leczenia HD ± SD [miesi¹ce] 24 31 58 ± 14 15 13 12 12 3 46 ± 16 10 10 48 ± 5 ----- ----- SD - odchylenie standardowe; DN - nefroatia cukrzycowa; PN - odmiedniczkowe zaalenie nerek; KZN - k³êbuszkowe zaalenie nerek; HN - nefroatia nadciœnieniowa; TN - torbielowatoœæ nerek Tabela III Charakterystyka badanych gru (stê enie wybranych arametrów hematologicznych). Characteristics of examined grous (concentration of selected hematological variables). 12 RBC [10 / l] 3,37 ± 0,41 4,63 ± 0,83 Hct [%] 32,25 ± 5,18 44,26 ± 7, 2 Hb [g/dl] 10,78 ± 1,67 14,95 ± 2,03 MCH [g] 33,43 ± 5,12 29,30 ± 3,30 MCV [fl] 98,73 ± 5,87 89,52 ± 8,58 TIBC 41,64 ± 7,24 57,98 ± 13,38 UIBC 17,11 ± 8,18 39,25 ± 3,57 TSAT [%] 36,98 ± 21,67 32,5 ± 6, 5 0,28 Fe 14,24 ± 7,31 18,75 ± 9,11 0,01 ferrytyna [ng/ml] 1628,13 ± 168, 2 188,23 ± 95,32 Tabela IV Charakterystyka badanych gru (stê enie wybranych arametrów gosodarki w¹trobowej). Characteristics of examined grous (concentration of selected variables of the liver metabolism). Reakcja z ConA brak s³aba silna bardzo silna Struktura ³añcucha cukrowego trój-, cztero lub wiêcej antenarna tzw. forma entasialotf dwa ³añcuchy: jeden dwu- i drugi trójantenarny tzw.forma tetrasialotf dwa ³añcuchy dwuantenarne obecnoœæ cukrów defektywnych: brak jednego z ³añcuchów lub obecny sam rdzeñ mannozowy AlAT [U/L] 21,2 ± 12, 8 20,3 ± 10, 3 0,78 AsAT [U/L] 18,5 ± 9, 2 18,2 ± 8, 2 0,87 bilirubina 8,7 ± 5,87 11,6 ± 4, 3 0,22 Zale noœæ omiêdzy stê eniem Tf i Tf3 w surowicy krwi a wielkoœci¹ stê enia TNF-a by³a statystycznie nieistotna. Dyskusja Chorzy w okresie leczeni HD s¹ szczególnie nara eni na wystêowanie niedokrwistoœci [23,25]. Bardzo istotnym czynnikiem w³ywaj¹cym na ten stan s¹ zaburzenia gosodarki Ostry stan zaalny Przewlek³y stan zaalny elazowej. Ocenia siê, e wystêuj¹ one u 25-37,5% chorych z niedokrwistoœci¹ w rzebiegu rzewlek³ej choroby nerek [27]. G³ówn¹ rzyczyn¹ niedokrwistoœci w okresie jest nieadekwatna w stosunku do stonia niedokrwistoœci synteza erytrooetyny (EPO). U badanych chorych w okresie stwierdzono wyk³adniki niedokrwistoœci makrocytarnej oraz zaobserwowano obni one 486 Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 7-8 D. Formanowicz i ws.
Tabela V Charakterystyka badanych gru (stê enie wybranych bia³ek ostrej fazy oraz cytokin). Characteristics of examined grous (concentration of selected acute hase roteins and cytokines). Tabela VI Porównanie stê eñ wariantów transferyny w surowicy krwi w obu badanych gruach. The comarison of the transferrin variants concentrations in serum in both studied grous. [mgdl] stê enie Fe w surowicy krwi, omimo leczenia uzue³niaj¹cego. Wiadomo, e odczas leczenia rhuepo wzrasta zaotrzebowanie na elazo i jego niedobór mo e stanowiæ jedn¹ z rzyczyn gorszej odowiedzi na leczenie rhuepo. Z drugiej strony nale y amiêtaæ, e odawanie zbyt du ych dawek elaza w obliczu tocz¹cego siê w okresie rzewlek³ego rocesu zaalnego jest nieuzasadnione, oniewa elazo odawane na drodze do ylnej jest zatrzymywane w uk³adzie monocytowo-makrofagowym, co uniemo liwia jego wykorzystanie w rocesie erytrooezy. Jednoczeœnie trzeba amiêtaæ o tym, e elazo mo e byæ wykorzystywane do rozwoju bakterii i w ten sosób dodatkowo srzyjaæ szerzeniu siê infekcji [20]. Ferrytyna to bia³ko najleiej okreœlaj¹ce stê enie elaza zmagazynowanego w uk³adzie monocytowo - makrofagowym w organizmie cz³owieka [27]. Wiadomo równie, e nale y ona do bia³ek ostrej fazy i w rzebiegu reakcji ostrej fazy jej stê enie mo e byæ nieadekwatnie odwy szone w orównaniu z rezerw¹ Fe w uk³adzie monocytowo makrofagowym. Nie oznacza to jednak, e ustrojowe zaasy elaza, u chorych z odwy szonym stê eniem ferrytyny s¹ du e. Nie ma bowiem ewnych dowodów na to, e wysokie stê enie ferrytny w surowicy krwi jest zwi¹zane z gromadzeniem siê elaza w narz¹dach wewnêtrznych u chorych leczonych HD [27]. U badanych chorych stê- enie tego bia³ka w surowicy krwi by³o kilkanaœcie razy wy sze w orównaniu ze stê- eniem obserwowanym w surowicy osób, co mog³oby wskazywaæ na istnienie rzewlek³ego stanu zaalnego u tych chorych. W badaniu, omimo odawania rhu- EPO, Fe oraz kwasu foliowego zaobserwowano utrzymywanie siê niedokrwistoœci w gruie. Jednym z owodów takiego stanu mog³y byæ zaburzenia zwi¹zane z transortem elaza na oziomie komórkowym, w których istotn¹ rolê odgrywa Tf [2, CRP [mg/l] 16,63 ± 19,25 2,28 ± 0,56 0,00001 IL-1 [g/ml] 4,15 ± 0,92 0,64 ± 0,01 0,00001 IL-6 [g/ml] 54,26 ± 10,16 4,31 ± 0,67 0,0007 Piœmiennictwo 1. Bog-Hansen T.C.: Crossed immuno-affinoelectrohoresis: a useful tool to rediect the result of affinity chromatograhy. Anal. Biochem. 1973, 65, 480. 2. Fishbane S., Paganini E.P.: Zaburzenia hematologiczne. [W:] Daugirdas J., Blake P.G., Ing T.S. (red): Podrêcznik dializoteraii, Wydawnictwo Czelej, Lublin 2003. 3. Formanowicz D., Pietrzak I.: Transferrin microheterogeneity in diabetic and non-diabetic atients with end-sage renal disease treated by maintenance haemodialysis. XLI Congress of The Euroean Renal Association Euroean Dialysis and Translant As- TNF-a [ g/ml] 27,12 ± 6,37 1,25 ± 0,11 0,005 132±60 158±52 0,03 Tf2 221±88 332±101 <0,0001 Tf3 943±322 2896±709 <0,0001 Tf4 145±56 153±93 0,81 14,15]. W gruie badanych chorych stwierdzono znamiennie istotne obni enie stê enia Tf w surowicy krwi w orównaniu z wartoœciami uzyskanymi od, rzy jednoczesnym wykluczeniu w³ywu zaburzeñ funkcji w¹troby na wielkoœæ syntezy Tf. Przyczyny obni- onego stê enia tej glikoroteiny w surowicy krwi mog¹ byæ ró norodne. Tf nale y do negatywnych bia³ek ostrej fazy, co oznacza, e jej stê enie w surowicy krwi obni a siê w rzebiegu stanów zaalnych [7]. Z drugiej strony obni one stê enie Tf obserwuje siê równie w stanach niedo ywienia, w chorobach nowotworowych, odczas hemolizy wewn¹trznaczyniowej, w zeso³ach utraty bia³ka oraz rzy rzedawkowaniu elaza [20]. Przyuszczalnie, u badanych chorych jedn¹ z rzyczyn obni onego stê enie Tf w surowicy krwi móg³ byæ rzewlek³y roces zaalny towarzysz¹cy, otwierdzony dodatkowo odwy szonymi stê eniami w surowicy krwi CRP i wybranych cytokin [19, 20]. Ponadto u badanych chorych zaobserwowano rzesuniêcie rofilu glikozylacji Tf w kierunku mniejszej reaktywnoœci z ConA, co manifestowa³o siê onad 2-krotnie zwiêkszon¹ zawartoœci¹ w surowicy krwi wariantów i Tf2 w orównaniu z gru¹. Jednoczeœnie zauwa ono natomiast obni enie stê enia i zawartoœci wariantu Tf3 w surowicy krwi. Wiadomo, e wariant ten, w orównaniu z ozosta³ymi wariantami Tf, odlega najsilniejszym wahaniom od w³ywem bodÿców zaalnych i urazowych [24]. Jest on utworzony g³ównie z ao-tf [24], która hamuje rozwój bakterii na drodze konkurencji o wolne elazo i o zwi¹zaniu z Fe rzechodzi w ostaæ holo-tf. Dlatego w trakcie rocesu zaalnego lub urazu stê enie ao-tf w surowicy krwi ulega obni eniu, rzy jednoczesnym wzroœcie stê enia holo-tf. Niedobór Tf3 stwierdzony u chorych w okresie mo e rzyczyniaæ siê do uoœledzonego transortu Fe w organizmie cz³owieka, co sugeruj¹ negatywne korelacje omiêdzy stê eniami Tf3 i Fe w surowicy krwi oraz w konsekwencji rowadziæ do og³êbiania siê niedokrwistoœci. Uoœledzony transort elaza do komórek rzyuszczalnie stanowi jedn¹ z rzyczyn oornoœci na leczenie niedokrwistoœci rzy omocy rhu- EPO (stwierdzono odwrotn¹ zale noœæ omiêdzy stê eniem Tf3 a wielkoœci¹ dawki rhuepo). Stê enie wariantu Tf4 w surowicy krwi u osób z gruy nie ró ni³o siê istotnie w orównaniu z gru¹, ale u badanych chorych stwierdzono œrednio 2-krotnie wy- szy, w orównaniu z gru¹, udzia³ rocentowy wariantu Tf4 w ca³kowitej iloœci transferyny znajduj¹cej siê w surowicy krwi. Wiadomo, e wariant Tf4 zawiera cukry defektywne i jest najsilniej hamowany w reakcji z ConA. Zwiêkszenie zawartoœci wariantu Tf4 w ca³kowitej iloœci Tf znajduj¹cej siê w surowicy krwi mo na wyt³umaczyæ rzebudow¹ form bia³ka, do której rawdoodobnie dochodzi od w³ywem reakcji ostrej fazy. Przebudowa ta ma na celu zwiêkszenie w surowicy krwi tego wariantu bia³ka, który by najleiej transortowa³ elazo [24]. Obni enie stê enia ca³kowitej Tf, obni- enie zawartoœci g³ównego, dominuj¹cego wariantu Tf3, oraz wzrost udzia³u rocentowego oszczególnych wariantów, Tf2 i Tf4 w ca³kowitej iloœci Tf znajduj¹cej siê w surowicy krwi, a tak e wzrost stê enia CRP i wybranych cytokin s¹ charakterystyczne dla rzewlek³ego rocesu zaalnego [24]. Na odstawie uzyskanych wyników oraz informacji zawartych w dostênym iœmiennictwie [24] wydaje siê, e bardziej istotny od wielkoœci samego stê enia danego wariantu transferyny w surowicy krwi jest jego rocentowy udzia³ w ca³kowitej iloœci Tf znajduj¹cej siê w surowicy krwi. Wnioski 1. U chorych leczonych owtarzan¹ hemodializ¹ obserwuje siê zmiany iloœciowe i jakoœciowe cz¹steczki transferyny. 2. Obni one stê enie wariantu Tf3 (ao- Tf) w surowicy krwi mo e uoœledzaæ transort elaza w organizmie i w³ywaæ na utrzymywanie siê niedokrwistoœci w okresie. 3. Uoœledzony transort elaza do komórek mo e stanowiæ jedn¹ z rzyczyn oornoœci na leczenie niedokrwistoœci rzy omocy rhuepo. 4. Podwy szone stê enie wybranych cytokin (interleukiny-6 i czynnika martwicy nowotworów-a) i wybranych bia³ek ostrej fazy (bia³ka C-reaktywnego) oraz obni one stê enie transferyny w surowicy krwi otwierdzaj¹ istnienie rzewlek³ego rocesu zaalnego w okresie. Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 7-8 487
sociation. Lisbon, Portugal, May 15-18, 2004. Abstract Book [B.m., 2004], 328. 4. Formanowicz D.: Znaczenie zmian glikozylacji transferyny i stê enia rozuszczalnego recetora transferyny jako czynników w³ywaj¹cych na wystêowanie niedokrwistoœci u chorych w okresie schy³kowej niewydolnoœci nerek leczonych owtarzan¹ hemodializ¹. Rozrawa doktorska, Akademia Medyczna, Poznañ 2005. 5. Formanowicz D., Sackmann A., Formanowicz P., B³a ewicz J.: Petri Net Based Model of The Body Iron Homeostasis (w druku) J. Biomed. Inform. 2007. doi: 1016/j.jbi.2006.12.001. 6. Formanowicz D., Pietrzak I.: Zmiany rofilu glikozylacji transferyny u chorych w okresie schy³kowej niewydolnoœci nerek leczonych owtarzan¹ hemodializ¹. Diagnostyka Laboratoryjna 2007 (w druku). 7. Formanowicz D., Pietrzak I.: Ocena w³ywu wybranych bia³ek ostrej fazy i cytokin na wystêowanie niedokrwistoœci w okresie schy³kowej niewydolnoœci nerek. Nefrol. Dial. Pol. 2007, 11, 6. 8. Giannetti A.M., Snow P.M., Zak O., Björkman P.J.: Mechamism for Multile Ligand Recognition by the Human Transferrin Recetor. Plos Biol. 2003, 1, 341. 9. de Jong G., van Eijk H.G.: Mikroheterogeneity of human serum transferrin: A biological henomenon studied by isoelectric focusing on immobilized H gradients. Electrohoresis 1988, 9, 589. 10. de Jong G., van Eijk H.G.: The biology of transferrin. Critical review. Clin. Chim. Acta. 1990, 190, 1. 11. de Jong G., van Noort W.L.: Adatation of transferrin rotein and glycans synthesis. Clin. Chim. Acta. 1992, 212, 27. 12. JóŸwiak J., Podgórski J.: Statystyka od odstaw. Polskie Wydawnictwo Ekonomiczne, Warszawa 2001. 13. Kamboh M.I., Ferrell R.E.: Human transferrin olymorhism. Review Hum. Hered. 1987, 37, 65. 14. Ksi¹ ek A.: Patogeneza i leczenie anemii u chorych z rzewlek³¹ niewydolnoœci¹ nerek. Nefrologia i Nadciœnienie Têtnicze S/6 2003, 5. 15. Kuratowska Z.: Niedokrwistoœci. [W:] Kuratowska Z. (red): Podstawy hematologii klinicznej. Wydawnictwo Medyczne, Warszawa 1994. 16. Laurell C.B.: Quantitative estimation of roteins by electrohoresis in agarose gel containing antibodies. Scan. J Clin Invest 1973, 124, 21. 17. Myœliwiec M.: Zaburzenia hematologiczne. [W:] Rutkowski B. (red): Dializoteraia w codziennej raktyce. Wydawnictwo Medyczne MAK, Gdañsk 1996. 18. Pietrzak I, Formanowicz D., Sobieska M.: Transferrin microheterogeneity in atients with end stage renal disease treated by maintenance hemodialysis, J. Am. Soc. Nehrol. 2003, 14, 532A. 19. Pietrzak I., Wojciechowski J., Pauszek D., Czekalski S.: Ocena stê eñ niektórych bialek ostrej fazy oraz IL-6 i TNF-alfa u chorych z nefroati¹ cukrzycow¹ oraz u chorych z innymi nefroatiami leczonych owtarzan¹ hemodializ¹. Diabetologia Praktyczna 2003, T.4, (Sul. B), s B29. 20. Pietrzak I., Wojciechowski J., Formanowicz D., Pawliczak E., Czekalski S.: Usefulness of selected acute hase roteins and cytokines in estimation of inflammatory rocess in maintenance hemodialysis atients with end stage renal disease. Annales Academiae Medicae Gedanensis 2003, 33, 247. 21. Pietrzak I., Formanowicz D.: The soluble transferrin recetor as marker of iron state in atients with end stage renal disease treated by hemodialysis. J. Am. Soc. Nehrol. 2004, 15, 179A. 22. Pietrzak I., Formanowicz D., Czekalski S.: Mikroheterogennoœæ transferyny i rozuszczalny recetor transferyny u acjentów ze schy³kow¹ niewydolnoœcia nerek leczonych owtarzan¹ hemodializ¹. VIII Zjazd Polskiego Towarzystwa Nefrologicznego, Bia³ystok 2004, Abstracts Book [B.m. 2004], 184. 23. Remuzzi G., Rossi E.: Hematologic consequences of renal failure. [W:] Brenner B.M. (red): The Kidney. W.B. Saunders Comany, Philadelhia 1996. 24. Sobiesiak M.: Reactivity of human serum transferrin with two mannose-bindings lectins: LCA and ConA. Centr. Eur. J. Immunol. 2002, 27, 63. 25. Stenvinkel P.: Anaemia and inflammation: what are the imlications for nehrologist? Nehrol. Dial. Translant. 2003, 18, 7. 26. Stibler H., Allgulander C., Borg S., Kjellin K.G.: Abnormal microheterogeneity of transferrin in serum and cerebrosinal fluid in alcoholism. Act. Med. Scand. 1978, 204, 49. 27. Waterbury L.: Hematologia. Wydawnictwo Medyczne Urban & Partner, Wroc³aw 1998. 488 Przegl¹d Lekarski 2007 / 64 / 7-8 D. Formanowicz i ws.